添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法

摘要

本发明公开了添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，该方法为：将法夫酵母种子液接入添加了纳米二氧化钛的无菌发酵培养基中进行发酵培养，发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，从而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行。本发明的优点是：本发明通过调节添加不同浓度的纳米二氧化钛，从而有效的激发了法夫酵母的应激反应，产生了细胞膜内外的pH梯度，提高了虾青素的产量。该高产虾青素在用作保健品，药物原料，化妆品，动物饲料，增加免疫力，抗氧化性，营养性等方面具有重大的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法。

背景技术

虾青素（Astaxanthin）化学名称为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素，分子式为C

虾青素主要以游离态和酯化态两种形式存在。游离态虾青素极不稳定，易被氧化，通常化学合成的虾青素为游离态形式。酯化态虾青素是由于虾青素末端环状结构中各有一个羟基易于与脂肪酸形成酯而稳定存在，水生动物皮肤和外壳上的虾青素以脂化态形式为主，肉及内脏上则以游离形式为主，红酵母、雨生红球藻中虾青素主要以酯化形式存在。

虾青素具有强大的抗氧化性。动物实验表明，虾青素可以去除NO

目前虾青素的生产主要有化学合成和微生物合成提取两种方式，化学合成的虾青素不仅价格昂贵，而且分子结构生物学功能、应用效果及生物安全性能方面和天然虾青素存在显著差异。目前，使用微生物发酵合成提取虾青素的方法逐渐占据主导地位。自然界的虾青素来源于藻类、细菌、浮游植物。一些水生物种包括虾蟹在内的甲壳类动物，由于长期食用这些藻类、细菌和浮游植物而外表呈现红色，它们又被三文鱼、加力鱼等鱼类，火烈鸟、鸡、鸭等鸟类、家禽捕食，色素储存在皮肤和脂肪组织中使它们的皮肤和羽毛也呈现红色。研究发现很多种类的藻类如雪藻、衣藻、裸藻、伞藻等都含有虾青素，其中雨生红球藻对虾青素的积累量比其它绿藻类高，是目前公认生产天然虾青素很好的生物来源。而细菌由于受其自身因素的影响，利用价值较低。法夫酵母被认为是目前真菌发酵生产中最为合适的虾青素来源。从法夫酵母中提取虾青素是生产虾青素的主要途径之一。

法夫酵母是天然可产虾青素的酵母，其反式虾青素已于2000年获得FDA批准，用于食品添加剂。法夫酵母以单细胞为主，有时形成假菌丝，繁殖方式为无性繁殖的芽殖，无有性繁殖，细胞中不但含有丰富的蛋白质、脂类、维生素，而且还含有大量的不饱和脂肪酸及多种虾青素的前体，其生长的温度范围0—27℃。法夫酵母生产虾青素的特点是：法夫酵母不需要光照，能利用多种糖作为碳源进行快速异养代谢，发酵周期短，生产速度快，能够在发酵罐中实现高密度培养，以及色素提取后菌体单细胞蛋白可作为饵料、饲料添加剂等。

微生物如酵母，或者大肠杆菌，可以使用葡萄糖或者油脂等能量物质，在体内合成虾青素。法夫酵母体内虾青素的合成途径示意图如图2所示。微生物在摄入葡萄糖（Glucose）或者其他能量物质后，会转化成关键代谢中间体乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），通过甲羟戊酸途径（MVA）合成异戊二烯焦磷酸（IPP），IPP在相关酶的作用下通过缩合反应生成法尼基焦磷酸（FPP），两分子FPP可以进一步缩合生成垅牛儿垅牛儿焦磷酸（GGPP），两分子GGPP进一步缩合生成八氢番茄红素（Phytoene），八氢番茄红素再经过脱氢和环化生成β-胡萝卜素，再经过氧化作用，酮基化和羟基化生成终产物虾青素（Astaxanthin）。

值得注意的是，自然条件下培养的法夫酵母菌株体内虾青素产量低，且容易退化，不可能实现工业化生产。因此，使用各种诱变方法提高虾青素产量成为了研究的首选目标。目前采用的方法有紫外线诱变法，高能射线诱变法，化学试剂诱变法，基因工程改造法等。比如Gong 2012 （Gong, J., Duan, N., Zhao, X., 2012. Evolutionary engineeringof Phaffia rhodozyma for astaxanthin-overproducing strain. Front. Chem. Sci.Eng. 6 (2), 174–178.）这篇文献中，提到了在法夫酵母培养基中添加氧化物如二氧化钛（TiO2）可以诱变使得酵母产生应激反应，从而过表达某些特定基因以增产虾青素。虽然文献报道了添加二氧化钛可以促进法夫酵母生产虾青素的研究，可是文献中提到的二氧化钛固体颗粒尺度只是微米级别，在发酵期间微米级二氧化钛无法高效送达至酵母细胞体内，因此该文献所报道方法培养的法夫酵母体内的虾青素含量较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效促进法夫酵母高产虾青素的方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，该方法为：将法夫酵母种子液接入添加了纳米二氧化钛的无菌发酵培养基中进行发酵培养，发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，从而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：无菌发酵培养基中按300～500mg/L的添加量添加纳米二氧化钛，二氧化钛固体颗粒大小为40～80纳米，无菌发酵培养基的pH值保持为5.2～7.8，发酵期间法夫酵母细胞内的pH值比细胞外的pH值低，并使发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在-2.6～-1.9。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：法夫酵母种子液的制备方法如下：将法夫酵母接入种子培养基中进行发酵制备法夫酵母种子液，其中，种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，种子培养基的组成成分包括：1～3%的葡萄糖、1～3%的酵母抽提物、1～2%的蛋白胨。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：无菌发酵培养基中所添加的纳米二氧化钛为经溶胶凝胶法处理的硬脂酸表面修饰的亲油性纳米二氧化钛。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：溶胶凝胶法处理硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛的处理方法如下：将10±20%克硬脂酸溶于50±20%毫升丙酮溶液中，然后加入5±20%克的纳米二氧化钛和50±20%毫升的蒸馏水，二氧化钛固体颗粒大小为40～80纳米，将温度升至60±20%

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：无菌发酵培养基中按50～100mg/L的添加量添加经溶胶凝胶法处理的硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛，无菌发酵培养基的pH值保持为5.2～7.8，发酵期间法夫酵母细胞内的pH值比细胞外的pH值低，并使发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在-2.3～-1.8。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：法夫酵母种子液的制备方法如下：将法夫酵母接入种子培养基中进行发酵制备法夫酵母种子液，其中，种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，种子培养基的组成成分包括：1～2%的葡萄糖、0.5～1%的酵母抽提物、1～2%的蛋白胨。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：法夫酵母种子液接入无菌发酵培养基后在发酵罐内进行发酵培养，发酵培养周期为48～72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖60～100g/L、酵母抽提物0.5～1g/L、硫酸镁0.5～1g/L、硫酸铵2～6g/L、磷酸二氢钾1～3g/L、磷酸氢二钾1～3g/L、氯化钙0.1～0.2g/L。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：种子发酵过程在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃。

进一步地，前述的添加纳米二氧化钛促进法夫酵母高产虾青素的方法，其中：使用2～5mol/L的NaOH水溶液及1～2mol/L的盐酸水溶液控制调节无菌发酵培养基的pH值。

通过上述技术方案的实施，本发明的有益效果是：本发明在无菌发酵培养基中添加纳米二氧化钛或亲油性纳米二氧化钛，在发酵期间纳米二氧化钛或亲油性纳米二氧化钛可以高效率的送达至酵母细胞体内，进而能快速调节细胞内的酸碱度，并使发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，即改变了法夫酵母细胞膜内外的pH环境，造成法夫酵母细胞膜内外pH值梯度，进而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行，从而有效增加法夫酵母体内的虾青素含量，该高产虾青素技术在用作保健品，药物原料，化妆品，动物饲料添加剂等方面具有重大的意义。

附图说明

图1为虾青素的化学结构式。

图2为法夫酵母体内虾青素合成途径示意图。

具体实施方式

下面结合优选实施例对本发明所述的技术方案作进一步详细的说明。

对比实施例一

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma（ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：2%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、2%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用5mol/L的NaOH水溶液以及2mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖80g/L、酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵6g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化钙0.2g/L；特别的，在培养基中另外加入500mg/L的二氧化钛（阿拉丁，CAS13463-67-7，SKU#T164497），该二氧化钛固体颗粒大小约为微米级别；

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内的pH值为5.8，因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外有个pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）为-1.4，即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在-1.4；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重浓度为39g/L；

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸水溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂；破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液；在避光条件下45℃蒸馏去除全部的丙酮残留物；之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为3.2mg/g细胞干重；将上述测定得到的虾青素含量3.2mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度39g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为124.8mg/L。

实施例二

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma （ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：1%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、1%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用2mol/L的NaOH水溶液以及1mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖60g/L、酵母抽提物0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钙0.1g/L；特别的，在培养基中另外加入500mg/L的纳米二氧化钛（阿拉丁，CAS13463-67-7，SKU#T104936），该二氧化钛固体颗粒大小约为60纳米；

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内的pH值为5.3；因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外的pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）为-1.9，即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在-1.9；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重浓度为37g/L。

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸水溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂；破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液；在避光条件下45℃蒸馏去除全部的丙酮残留物；之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为4.8mg/g细胞干重；将上述测定得到的虾青素含量4.8mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度37g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为177.6mg/L。

实施例三

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma（ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：3%的葡萄糖、3%的酵母抽提物、2%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用5mol/L的NaOH水溶液以及2mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖100g/L、酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵6g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化钙0.2g/L；特别的，在培养基中另外加入400mg/L的纳米二氧化钛（阿拉丁，CAS 13463-67-7，SKU#T104936），该二氧化钛固体颗粒大小约为60纳米；

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内的pH值为5.0；因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外有个pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）为-2.2；即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在-2.2；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重为42g/L。

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸水溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂。破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液。在避光条件下45℃蒸馏去除全部的丙酮残留物。之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为5.5mg/g细胞干重。将上述测定得到的虾青素含量5.5mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度42g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为231mg/L。

实施例四

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma（ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：2%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、2%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用5mol/L的NaOH水溶液以及2mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖80g/L、酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵6g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化钙0.2g/L；特别的，在培养基中另外加入300mg/L的纳米二氧化钛（阿拉丁，CAS 13463-67-7，SKU# T104936），该二氧化钛固体颗粒大小约为60纳米；

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内的pH值为4.6；因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外有个pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）为-2.6；即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持在-2.6；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重浓度为39g/L。

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸水溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂。破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液。在避光条件下45℃蒸馏去除全部的丙酮残留物。之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为7.4mg/g细胞干重，将上述测定得到的虾青素含量7.4mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度39g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为288.6mg/L。

实施例一至四中产虾青素数据比较如下表一所示

上表一总结了添加不同TiO2对法夫酵母发酵产虾青素的影响；添加普通微 米级二氧化钛500mg/L的对比实施例一中，虾青素含量为3.2mg/g细胞干重， 其总的虾青素浓度约为124.8mg/L。与之相比，添加相同浓度的纳米二氧化钛组 中，虾青素含量为4.8mg/g细胞干重，其总的虾青素浓度约为177.6mg/L，提高 了大约42％。

在添加300 mg/L纳米二氧化钛的实施例中，虾青素含量为7.4mg/g细胞干重，总的虾青素浓度约为288.6mg/L，均为几组中最佳的结果。由此可见，添加纳米二氧化钛可以增加法夫酵母生产虾青素的产量，其中添加量为300mg/L情况下，可以得到最佳的虾青素生产强度。

对比实施例五

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma （ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：2%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、2%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用5mol/L的NaOH水溶液以及2mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖80g/L、酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵6g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化钙0.2g/L；

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内壁的pH值为5.9。因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外有个pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）为-1.3；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重为34g/L；

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂；破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液；在避光条件下45度蒸馏去除全部的丙酮残留物；之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为1.8 mg/g细胞干重；将上述测定得到的虾青素含量1.8mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度34g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为61.2 mg/L。

实施例六

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma（ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：1%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、1%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用2mol/L的NaOH水溶液以及1mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖60g/L、酵母抽提物0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钙0.1g/L；特别的，在培养基中另外加入50mg/L的经硬脂酸处理的亲油性纳米二氧化钛（阿拉丁，CAS13463-67-7，SKU# T299716），该二氧化钛固体颗粒大小为60纳米；溶胶凝胶法处理的硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛处理方法如下：将10克硬脂酸溶于50毫升丙酮溶液中，然后加入5克的纳米二氧化钛和50毫升的蒸馏水，将温度升至60

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内壁的pH值为5.4；因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外的pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）约为-1.8，即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持为-1.8；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重浓度为38g/L。

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂；破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液；在避光条件下45度蒸馏去除全部的丙酮残留物；之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为8.7mg/g细胞干重；将上述测定得到的虾青素含量8.7mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度38g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为330.6mg/L。

实施例七

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma （ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用YPD培养基（酵母浸出粉胨葡萄糖培养基），其组成成分通常包括：2%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、2%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用5mol/L的NaOH水溶液以及2mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖100g/L、酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵6g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化钙0.2g/L；特别的，在培养基中另外加入75mg/L的经硬脂酸处理的亲油性纳米二氧化钛（阿拉丁，CAS13463-67-7，SKU# T299716），该二氧化钛固体颗粒大小为60纳米；溶胶凝胶法处理的硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛处理方法如下：将10克硬脂酸溶于50毫升丙酮溶液中，然后加入5克的纳米二氧化钛和50毫升的蒸馏水，将温度升至60

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%；

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内壁的pH值为5.1。因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外的pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）约为-2.1，即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持为-2.1；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重为35g/L；

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂；破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液；在避光条件下45度蒸馏去除全部的丙酮残留物；之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为12.5mg/g细胞干重；将上述测定得到的虾青素含量12.5mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度35g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为437.5mg/L。

实施例八

本发明所述的发酵方法可以应用于分批发酵场合，也可以应用于连续发酵场合。本实施例以在5L发酵罐中分批发酵法夫酵母生产虾青素为例进行说明。

首先，将法夫酵母Phaffia rhodozyma （ATCC 24202）接入100ml的种子培养基中进行发酵、制备法夫酵母种子液；种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，其组成成分通常包括：2%的葡萄糖、1%的酵母抽提物、2%的蛋白胨，其余成分为去离子水；种子发酵过程可在摇床中进行，摇床的转速通常在100～200rpm，法夫酵母种子液发酵温度控制在15～25℃；

在5L发酵罐内投入2L经121℃高压灭菌的无碳源的无菌发酵培养基，高压灭菌时间为30分钟，使用5mol/L的NaOH水溶液以及2mol/L的盐酸水溶液控制将发酵培养基的pH值调节为7.2；本实施例中所述的无菌发酵培养基的组成成分包括：葡萄糖80g/L、酵母抽提物1g/L、硫酸镁1g/L、硫酸铵6g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化钙0.2g/L；特别的，在培养基中另外加入100mg/L的经硬脂酸处理的亲油性纳米二氧化钛（阿拉丁，CAS 13463-67-7，SKU# T299716），该二氧化钛固体颗粒大小为60纳米； 溶胶凝胶法处理的硬脂酸表面修饰亲油性纳米二氧化钛处理方法如下：将10克硬脂酸溶于50毫升丙酮溶液中，然后加入5克的纳米二氧化钛和50毫升的蒸馏水，将温度升至60

将获得的法夫酵母种子液按照5%的接种浓度将法夫酵母种子液接入以上pH值恒定为7.2的无菌发酵培养基中进行发酵培养，培养周期为72小时；其中，发酵罐内发酵液温度控制在15～25℃，发酵罐中的搅拌设备的初始搅拌转速为100～200rpm，发酵罐内初始通气量为0.5～2vvm，整个发酵培养过程中通过设置搅拌转速和通气量保证发酵液中溶解氧在20%～60%

当72小时发酵完成后取样，使用细胞胞内pH测试试剂盒（购买自 abcam，Intracellular pH Assay 试剂盒 ab228552），测试该时间点细胞内的pH值，该时点细胞膜内壁的pH值为4.9。因为发酵罐的pH值一直保持恒定为7.2，可以计算得到细胞膜内外的pH梯度ΔpH（胞内pH-胞外pH）约为-2.3，即发酵期间法夫酵母细胞内的pH值与细胞外的pH值之间的pH差值保持为-2.3；

整个72小时发酵完成后进行细胞干重测定：将发酵液称重后，以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心5分钟，所得沉淀过滤后，在80℃烘干称重，测得发酵液中细胞干重浓度为36g/L；

取1克72小时发酵完成后的菌种样品，离心洗涤后，加入等体积的3mol/L盐酸溶液在沸水浴中加热5分钟使得细胞壁破裂；破壁后的细胞使用丙酮萃取得到虾青素的丙酮溶液；在避光条件下45度蒸馏去除全部的丙酮残留物；之后使用高效液相色谱（HPLC），测定虾青素的含量约为17.3mg/g细胞干重；将上述测定得到的虾青素含量17.3mg/g乘以本次发酵液得到的细胞干重浓度36g/L，得到该批次发酵虾青素的浓度为622.8mg/L。

实施例五至八中产虾青素数据比较如下表二所示

上表二总结了添加不同浓度硬脂酸处理的亲油性TiO2对法夫酵母发酵产虾青 素的影响。在未添加二氧化钛的实施例中，虾青素含量为1.8mg/g细胞干重， 其总的虾青素浓度约为61.2mg/L。与之相比，添加适当浓度的经硬脂酸处理的 亲油性纳米二氧化钛组中，虾青素含量可达17.3mg/g细胞干重，其总的虾青素 浓度约为622.8mg/L，提高了超过10倍。由此可见，添加硬脂酸处理的亲油性 纳米二氧化钛可以增加法夫酵母生产虾青素的产量，其中添加量为100mg/L情 况下，可以得到最佳的虾青素生产强度。

本发明的优点是：本发明在无菌发酵培养基中添加纳米二氧化钛或亲油性纳米二氧化钛，在发酵期间纳米二氧化钛或亲油性纳米二氧化钛可以高效率的送达至酵母细胞体内，进而能快速调节细胞内的酸碱度，并使发酵期间保持法夫酵母细胞内外的酸碱度不平衡，即改变了法夫酵母细胞膜内外的pH环境，造成法夫酵母细胞膜内外pH值梯度，进而激发法夫酵母的应激反应，使法夫酵母体内的代谢通路朝向生产虾青素的方向进行，从而有效增加法夫酵母体内的虾青素含量，该高产虾青素技术在用作保健品，药物原料，化妆品，动物饲料添加剂等方面具有重大的意义。