一种大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺

摘要

本发明公开一种大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括天山雪莲细胞系筛选:采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，以MS培养基作为筛选培养基对固体细胞进行逐代筛选，培养条件为22～25℃的无光照培养，筛选出生长快速的白色细胞系；摇瓶规模继代培养:挑选生长状态良好、没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞接种到含有MS培养基的培养液摇瓶中继代培养；培养条件为22～25℃的无光照培养；摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，培养条件为23～25℃的无光照培养，通气保持反应器中的流量计通气读数在60～80L/h；解决细胞在放大培养的过程中对培养条件的波动的耐受力低，容易出现褐化现象的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞培养领域，具体涉及一种大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺。

背景技术

天山雪莲为菊科植物雪莲(Saussureainvolucrata(Kar.etKir)Sch.-Bip.Linnaea)的干燥地上部分，是中国特有的药用植物，其主要的有效成分为高含量的黄酮类化合物以及其他苯丙素类化合物、倍半萜内酯及其苷类化合物、多糖类化合物及挥发油类化合物等多种天然生物活性成分，一般以总黄酮及总蛋白含量作为评价天山雪莲质量的指标。天山雪莲作为我国特有的特色植物已被国家列为二级濒危植物，因为野生资源日益匮乏使得采集得到的天山雪莲已经无法满足日益增长的医疗保健用途需求，并且通过植物细胞工程技术和专利CN201410675127.3提供的的一次性生物反应器对雪莲细胞进行规模化放大培养，找到了解决雪莲短缺的良好途径。上述技术通过诱变技术筛选得到的是高产的紫红色天山雪莲细胞系，但是细胞系对培养环境的氧气和光照的需求很严格，细胞在放大培养的过程中对培养条件的波动的耐受力低，容易出现褐化现象。

因此需要一种新的天山雪莲细胞培养工艺，能够解决细胞在放大培养的过程中对培养条件的波动的耐受力低，容易出现褐化现象的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，能够解决细胞在放大培养的过程中对培养条件的波动的耐受力低，容易出现褐化现象的问题。

本发明的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1,天山雪莲细胞系筛选:采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，以MS培养基作为筛选培养基对固体细胞进行逐代筛选，培养条件为22～25℃的无光照培养，筛选出生长快速的白色细胞系；

S2,摇瓶规模继代培养:挑选生长状态良好、没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞接种到含有MS培养基的培养液摇瓶中继代培养至细胞鲜重不小于150g/L；培养条件为22～25℃的无光照培养；

S3,摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，培养条件为23～25℃的无光照培养，通气保持反应器中的流量计通气读数在60～80L/h；

进一步，所述MS培养基含有0.5～1.5mg/L 6-BA和0.5～1.5mg/L NAA的MS；

进一步，步骤S2中，MS培养基的含糖量20～40g/L，细胞接种量为30～50g/L，摇床转速为100～120rpm；

进一步，步骤S3中，摇瓶转反应器继代培养包括摇瓶转5L反应器继代培养、5L转20L反应器继代培养和20L转200L反应器继代培养，每次继代培养的培养周期为7～10天；

进一步，步骤S3中，摇瓶转5L反应器继代培养包括以下步骤：将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，细胞接种量为30～50g/L，保持反应器振频为5～15rpm，通气量为70～90L/h；

进一步，步骤S3中，5L转20L反应器继代培养包括以下步骤：在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为5～15rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为60～80L/h；

进一步，步骤S3中，20L转200L反应器继代培养包括以下步骤：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，通气量为80～120L/h；

进一步，20L转200L反应器继代培养中，培养第1-5天的反应器振频为10-15rpm，培养第6天以上的反应器振频为15-25rpm。

本发明的有益效果是：本发明公开的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，不通过诱变技术筛选出天山雪莲没有天然色素积累的白色细胞系，与已有的紫红色的高产黄酮的天山雪莲细胞相比，细胞在继代以及放大培养的过程中不需要高溶氧比，不需要用光照来刺激代谢产物的合称，并且细胞分裂快速，细胞的蛋白质含量更高并且对环境的波动的耐受力也很好。虽然黄酮的含量有所下降，但细胞的生长速度和细胞的抗逆性均有所提高，并且细胞对氧气的需求量大幅度下降，这大大降低了了雪莲细胞的培养难度，增加了细胞规模放大培养过程中的成功率。同时，调整了培养基的激素配比并进行生物动力学从而系统性的对细胞筛选驯化过程中的种源进行科学筛选。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明的天山雪莲(白色)细胞系的生长动力学图；其中A.鲜重增长、B.干重增长、C.残糖含量、D.pH、E.电导率、F.OD430检测。

具体实施方式

实施例一

本实施例的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1，天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行逐代筛选，使用MS培养基进行逐代筛选，选出生长快速的白色细胞系，并命名为SIC，培养条件为22℃每两周继代一次；

S2,摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞放入含有MS培养液的摇瓶中，所述培养液为含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS生长培养基(含糖量30g/L)；接种量为30g/L，培养条件为22℃，摇床转速为100rpm，每7天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L，在逐渐驯化得到悬浮细胞的细胞系后对细胞进行生长动力学的实验监控，最后得到经过液体环境悬浮驯化的细胞系，其可以在一周的时间内将现有的细胞的生物量的含量提高到4倍以上(图一)；

S3，摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7天，反应器中加入含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS培养基作为培养液，培养条件为23℃，通气保持反应器中的流量计通气读数在60L/h；

S3-1,摇瓶转5L反应器继代培养:将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，接种量为30g/L，保持反应器振频为5rpm，通气量为80L/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；

S3-2,5L转20L反应器继代培养:在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为5rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为60L/h；

S3-3,20L转200L反应器继代培养：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为10rpm，培养第6天以上的反应器振频为15rpm通气量为80L/h。

实施例二

本实施例的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1，天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行逐代筛选，使用MS培养基进行逐代筛选，选出生长快速的白色细胞系，并命名为SIC，培养条件为25℃每两周继代一次；

S2,摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞放入含有MS培养液的摇瓶中，所述培养液为含有0.6mg/L 6-BA、0.6mg/LNAA的MS生长培养基(含糖量20g/L)；接种量为50g/L，培养条件为25℃，摇床转速为120rpm，每10天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L；

S3摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为10天，反应器中加入含有1.5mg/L 6-BA、1.5mg/LNAA的MS培养基作为培养液，培养条件为25℃，通气保持反应器中的流量计通气读数在80L/h；

S3-1,摇瓶转5L反应器继代培养:将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，接种量为50g/L，保持反应器振频为15rpm，通气量为90L/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；

S3-2,5L转20L反应器继代培养:在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为15rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为80L/h；

S3-3,20L转200L反应器继代培养：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为15rpm，培养第6天以上的反应器振频为15-25rpm通气量为120L/h。

实施例三

本实施例的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1，天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行逐代筛选，使用MS培养基进行逐代筛选，选出生长快速的白色细胞系，并命名为SIC，培养条件为22℃每两周继代一次；

S2,摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞放入含有MS培养液的摇瓶中，所述培养液为含有1.0mg/L 6-BA、0.6mg/LNAA的MS生长培养基(含糖量35g/L)；接种量为30g/L，培养条件为22-25℃，摇床转速为120rpm，每7天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L；

S3摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7-10天，反应器中加入含有0.5mg/L 6-BA、1.5mg/LNAA的MS培养基作为培养液，培养条件为23℃，通气保持反应器中的流量计通气读数在80L/h；

S3-1,摇瓶转5L反应器继代培养:将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，接种量为30g/L，保持反应器振频为15rpm，通气量为70L/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；

S3-2,5L转20L反应器继代培养:在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为15rpm，，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为60L/h；

S3-3,20L转200L反应器继代培养：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为15rpm，培养第6天以上的反应器振频为15rpm通气量为120L/h。

实施例四

本实施例的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1，天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行逐代筛选，使用MS培养基进行逐代筛选，选出生长快速的白色细胞系，并命名为SIC，培养条件为25℃每两周继代一次；

S2,摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞放入含有MS培养液的摇瓶中，所述培养液为含有0.5mg/L 6-BA、1.2mg/LNAA的MS生长培养基(含糖量30g/L)；接种量为50g/L，培养条件为22℃，摇床转速为120rpm，每7天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L；

S3摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为10天，反应器中加入含有0.5mg/L 6-BA、1.2mg/LNAA的MS培养基作为培养液，培养条件为25℃，通气保持反应器中的流量计通气读数在60L/h；

S3-1,摇瓶转5L反应器继代培养:将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，接种量为50g/L，保持反应器振频为5rpm，通气量为80L/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；

S3-2,5L转20L反应器继代培养:在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为15rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为80L/h；

S3-3,20L转200L反应器继代培养：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为10rpm，培养第6天以上的反应器振频为25rpm通气量为120L/h。

实施例五

本实施例的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1，天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行逐代筛选，使用MS培养基进行逐代筛选，选出生长快速的白色细胞系，并命名为SIC，培养条件为23℃每两周继代一次；

S2,摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞放入含有MS培养液的摇瓶中，所述培养液为含有0.8mg/L 6-BA、0.8mg/LNAA的MS生长培养基(含糖量30g/L)；接种量为40g/L，培养条件为22℃，摇床转速为110rpm，每9天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L；

S3摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为7天，反应器中加入含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS培养基作为培养液，培养条件为24℃，通气保持反应器中的流量计通气读数在65L/h；

S3-1,摇瓶转5L反应器继代培养:将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，接种量为45g/L，保持反应器振频为12rpm，通气量为80L/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；

S3-2,5L转20L反应器继代培养:在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为8rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为65L/h；

S3-3,20L转200L反应器继代培养：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为13rpm，培养第6天以上的反应器振频为22rpm通气量为90L/h。

实施例六

本实施例的大规模继代培养及规模放大培养天山雪莲细胞的工艺，包括以下步骤：

S1，天山雪莲细胞系筛选：采用天然雪莲试管苗进行外植体诱导，获得愈伤组织，对固体细胞进行逐代筛选，使用MS培养基进行逐代筛选，选出生长快速的白色细胞系，并命名为SIC，培养条件为23℃每两周继代一次；

S2,摇瓶规模继代培养：挑选生长状态良好，没有灰色褐化、质地疏松的固体细胞放入含有MS培养液的摇瓶中，所述培养液为含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/LNAA的MS生长培养基(含糖量30g/L)；接种量为40g/L，培养条件为22-25℃，摇床转速为110rpm，每8天继代一次；继代完成后细胞鲜重不小于150g/L；

S3摇瓶转反应器继代培养：将摇瓶中细胞转接到反应器中进行继代培养，每次继代培养的培养周期为8天，反应器中加入含有1.0mg/L 6-BA、1.0mg/L NAA的MS培养基作为培养液，培养条件为24℃，通气保持反应器中的流量计通气读数在70L/h；

S3-1,摇瓶转5L反应器继代培养:将摇瓶细胞无菌接入5L反应器中，接种量为40g/L，保持反应器振频为10rpm，通气量为80L/h，完成继代的细胞鲜重达到150g/L；

S3-2,5L转20L反应器继代培养:在5L反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将5L反应器中完成继代的细胞种源转接入20L反应器中，保持反应器振频为10rpm，并将空气和氧气的混合气体通入到反应器中，通气量为70L/h；

S3-3,20L转200L反应器继代培养：在20L的反应器继代培养结束后，通过无菌连接的方式将20L反应器中完成继代的细胞种源转接到200L反应器中，培养第1-5天的反应器振频为12rpm，培养第6天以上的反应器振频为20rpm通气量为100L/h。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。