琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用

摘要

本发明涉及琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用，以及利用琼脂糖对生物大分子进行冻干保存的方法。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用，以琼脂糖为冻干保护剂，冻干后琼脂糖可形成三维网状立体空间结构，为冻干体系中的生物分子提供空间支撑、防止生物分子冻干后的空间塌陷，且琼脂糖不与生物分子反应、不会引入二次污染，对于生物大分子的冻干、运输、活性维持、复溶和常温保存具有重要意义。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用和一种生物大分子尤其是核酸冻干保护剂，以及利用琼脂糖对生物大分子进行冻干保存的方法。

(二)背景技术

核酸作为生物大分子，在自然条件下容易降解，其稳定保存技术对于研制和生产核酸样品、核酸标准物质、核酸试剂盒、核酸疫苗等具有重要作用。因此，先进的核酸保存技术在医学生物学诊断检测、动植物检验检疫等核酸相关的诸多领域中具有广泛应用前景。

目前，国内外常用于存储DNA的方式主要有两种，一种是采用TE等缓冲液溶解DNA后进行超低温冷冻保存，通过低温来抑制DNase对DNA的降解作用，另一种是将DNA样品进行冷冻干燥(冻干)成固体后再进行储存或运输，系通过冻干来破坏DNase所需的工作条件，从而抑制DNase对DNA的降解作用。但是，经冻干后，原本DNA溶液中的水分升华，使得原先分散在溶液中的DNA出现“空间坍塌”，所占体积小，DNA洒落在容器底部，最终形成些许不规则粉末状物质，肉眼有时难以分辨。冻干后的微量DNA很轻，容易在开盖或复溶过程中气流的作用下造成丢失，进而影响后续实验。因此有必要研发一种保存效果好的冻干保护剂及冻干保存方法。

对于RNA而言，由于RNA的性质不稳定性，以及RNase普遍存在于自然环境和人体中，RNA常采用低温或超低温保存及运输，通过低温抑制RNase的活性，从而保护RNA。因此，新冠病毒的mRNA疫苗需要全程-70℃超低温冷链，物流和储存问题巨大，如果新冠mRNA疫苗存储在普通的医用冷藏箱(2～8℃)中，其有效期仅有24小时。因此有必要研发一种保存效果好的保存方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用和一种生物大分子尤其是核酸冻干保护剂，以及利用琼脂糖对生物大分子进行冻干保存的方法。

本发明采用的技术方案是：

琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用。所述生物大分子包括蛋白质、核酸、多糖等。

具体的，所述生物大分子为下列之一：蛋白质、多糖、DNA、RNA。所述琼脂糖可以是普通琼脂糖，也可以是低熔点琼脂糖。具体的，所述琼脂糖为普通琼脂糖时，琼脂糖使用时终浓度为0.003125％～0.1％(w/w，优选0.0125％～0.05％)。所述琼脂糖为低熔点琼脂糖时，低熔点琼脂糖使用时终浓度为0.003125％～0.2％(w/w，优选0.0125％～0.2％)。

琼脂糖要成凝胶，其浓度通常大于0.5％，低熔点琼脂糖浓度不高于0.2％或普通琼脂糖浓度不高于0.1％时常温下呈液态。发明人在实验中发现，常温下液态的低浓度琼脂糖溶液，先经冷冻结冰(从液态变成固态)，再经冷冻干燥后却能形成良好的立体空间结构，该发现使得常温下呈液态的低浓度琼脂糖溶液可作为良好的冻干保护剂，其优点包括：(1)不吸附核酸、蛋白质等生物分子，复溶后生物分子几乎无损失；(2)三维网状立体空间结构给生物分子提供空间支撑，防止生物分子“塌陷”(比如原来1cm高的液面，冻干后只有薄薄的一层冻干粉末)；(3)化学惰性，即不与生物分子反应；(4)加水复溶时不影响生物分子的快速溶解；(5)常规冻干塑形剂溶于水，而冻干后的琼脂糖分子不溶于水，后续通过静置或离心后即可除去，不会引入二次污染。(6)冻干剂在常温下为液态，可与待冷冻干燥的溶液进行任何比例混合，操作简便，常温操作即可，推广价值大。

对于终浓度0.3％左右的琼脂糖溶液，当溶液温度37℃左右时，也是液体，这个时候马上进行冰箱冷冻，也可以形成良好的空间结构。因此终浓度0.3％左右的琼脂糖溶液在使用温度37℃左右时，也可以作为冻干保护剂。

所述琼脂糖包括普通琼脂糖和低熔点琼脂糖，优选为低熔点琼脂糖。申请人发现低浓度的普通琼脂糖溶液在室温下不成凝胶，浓度≤0.1％的普通琼脂糖溶液在常温下是液态，可以直接和生物制品混合，冻干使水分升华，冻干后留下的琼脂糖形成三维立体空间结构，复溶操作简单，且不影响生物制品的活性和稳定性。低熔点琼脂糖是琼脂糖的一种，溶液在浓度≤0.2％时其在常温下是液态，亦可直接和生物制品混合，不影响后者的活性和稳定性。

优选的，所述琼脂糖用于制备核酸冻干保护剂。

本发明还涉及一种利用琼脂糖对生物大分子进行冻干保存的方法，所述方法包括：常温下，将生物大分子(如蛋白质、多糖、DNA或RNA)加入常温下为液态的普通琼脂糖溶液至其(琼脂糖)终浓度为0.003125％～0.1％或加入常温下为液态的低熔点琼脂糖溶液至其(琼脂糖)终浓度为0.003125％～0.2％，混匀后进行冻干保存，使用时加入去离子水复溶即可。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了琼脂糖在制备生物大分子冻干保护剂中的应用，以琼脂糖作为冻干保护剂，在室温下可与待冻干物进行混合，操作简单，其冻干可形成三维网状立体空间结构，可给生物大分子提供空间支撑、防止生物大分子塌陷，且不吸附生物大分子，不与生物大分子反应，复溶时不影响生物大分子的重新溶解，还不会引入二次污染，对于生物大分子的储存和运输具有重要意义。

(四)附图说明

图1为常温下呈液态的0.003125～0.1％的普通琼脂糖溶液和0.003125～0.2％的低熔点琼脂糖溶液各0.5ml，于-80℃冰冻，再于-52℃下冻干后的形态；A为不同浓度普通琼脂糖冻干后效果；B为不同浓度低熔点琼脂糖冻干后效果。

图2为琼脂糖溶液作为人基因组DNA冻干保护剂的冻干后效果。

图3为琼脂糖溶液作为植物RNA冻干保护剂的冻干后效果。

图4为人基因组DNA和pUC19质粒DNA样品复溶后电泳图；左图为人基因组DNA电泳图，泳道1不含琼脂糖溶液，泳道2～4含终浓度0.2％、0.05％和0.0125％低熔点琼脂糖溶液；右图为pUC19质粒DNA样品复溶后电泳图，泳道1不含琼脂糖溶液，泳道2～4含终浓度0.05％、0.025％和0.0125％普通琼脂糖溶液。

图5为水稻叶片RNA样品复溶后电泳图；泳道1不含琼脂糖溶液，泳道2～4含终浓度0.2％、0.05％和0.0125％低熔点琼脂糖溶液。

图6为低熔点琼脂糖溶液作为蛋白保护剂并经冻干后的效果。

图7为低熔点琼脂糖溶液作为多糖保护剂并经冻干后的效果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：普通琼脂糖和低熔点琼脂糖的成胶浓度摸索

用水配0.003125～1.2％的普通琼脂糖或低熔点琼脂糖，每个浓度配制1ml，加热到100℃，颠倒混匀直至琼脂糖完全熔化，室温(25℃左右)放置使其自然冷却，观察不同浓度的琼脂糖溶液是否会形成凝胶，结果见表1～2，冻干物经复溶再离心，观察是否会形成琼脂糖沉淀及沉淀量多少，结果见表3～4。

表1：不同浓度普通琼脂糖溶液在室温下的凝固状态

表2：不同浓度低熔点琼脂糖溶液在室温下的凝固状态

表3：不同浓度普通琼脂糖冻干物经复溶再离心后的沉淀量情况

表4：不同浓度低熔点琼脂糖冻干物经复溶再离心后的沉淀量情况

对于普通琼脂糖而言，结果显示浓度≤0.1％的琼脂糖溶液不凝固，在室温下仍成液态；浓度为0.2％～0.3％琼脂糖溶液呈现半凝固状(整体为溶液状态，但内含部分块状凝胶)，0.4％以上则均为凝胶状态。因此，当琼脂糖溶液浓度≤0.1％时，经熔化后的琼脂糖溶液在室温下不会形成凝胶。终浓度为0.1％的琼脂糖溶液，冻干物经复溶再离心后的沉淀量较多。而终浓度≤0.05％的琼脂糖溶液，冻干物经复溶再离心后的沉淀量少，以终浓度0.0125％～0.05％时为最佳，因此普通琼脂糖作为冻干保护剂的合适终浓度范围为0.003125％～0.1％，优选为0.0125％～0.05％。

对于低熔点琼脂糖而言，终浓度≤0.2％的低熔点琼脂糖溶液不凝固，在室温下仍成液态；而浓度为0.3％～0.5％低熔点琼脂糖溶液呈现半凝固状，0.6％以上则均为凝胶状态。因此，当低熔点琼脂糖溶液浓度≤0.2％时，经熔化后的低熔点琼脂糖溶液在室温下不会形成凝胶。浓度≤0.2％的低熔点琼脂糖冻干物经复溶再离心后的沉淀量较少，以终浓度0.0125％～0.2％时为最佳，因此低熔点琼脂糖作为冻干保护剂的合适终浓度范围为0.003125％～0.2％，优选为0.0125％～0.2％。

实施例2：常温下液态的琼脂糖溶液经冻干后的形状

取0.003125～0.1％的普通琼脂糖和0.003125～0.2％的低熔点琼脂糖溶液各0.5ml，于-80℃冰冻，再于-52℃下冻干，形态参见图1。

从图1可知，常温(25℃左右)下液态的琼脂糖溶液经冻干后，形成白色絮状空间立体网状结构，对于普通琼脂糖而言，其质量虽然仅为0.016mg～0.5mg，但体积可达0.5ml，对于低熔点琼脂糖而言，其质量虽然仅为0.016mg～1mg，但体积可达0.5ml，两者均呈现非常好的蓬松立体结构，可为生物分子提供良好的支持条件。

实施例3：低浓度琼脂糖溶液作为核酸保护剂并经冻干后的形状及回收率

以含人基因组DNA或水稻RNA的溶液为检测样品，往溶液中加或者不加常温(25℃左右)下呈液态的琼脂糖溶液，使普通琼脂糖溶液的终浓度为0.05％、0.025％、0.0125％或低熔点琼脂糖溶液的终浓度为0.2％、0.05％、0.0125％(具体实验设计参见表5)，再进行冷冻干燥，观察其冻干后形态，结果见图2和图3。

表5：不同浓度不同种类琼脂糖溶液对人基因组DNA和植物RNA冻干保护实验设计

从图2可知，不含琼脂糖溶液的DNA，在经冻干后，其形态不一，结构塌陷，DNA随机粘附在管壁上。

而含低熔点琼脂糖溶液或普通琼脂糖溶液或的DNA和RNA溶液，无论是0.0125％还是0.2％的琼脂糖溶液，都能形成良好的、较为致密的空间立体结构(图3)。

以100μl含人基因组DNA、pUC19质粒DNA、水稻叶片RNA的溶液为检测样品，往溶液中加等体积常温(25℃左右)下呈液态的普通琼脂糖溶液或低熔点琼脂糖溶液，使琼脂糖的终浓度分别为0.05％、0.025％、0.0125％和0.2％、0.05％、0.0125％，对照组加100μl水以确保试验组总体积一致，再进行冷冻干燥。室温放置2周后往管内加入100μl的水进行样品复溶。

随着水的加入，可见三维空间立体结构迅速被溶解，复溶速度快，同时溶液中出现透明琼脂糖絮状物或小颗粒，系因为冻干后的琼脂糖分子不溶于水，由于其密度大于水溶液，经静置或离心后，即可去除琼脂糖，不引入二次污染。

核酸复溶后进行电泳，结果参见图4～5。由图4可知，人基因组DNA和质粒DNA经冻干后，加琼脂糖冻干保护剂的DNA电泳谱型和未加冻干保护剂的DNA电泳谱型一致，说明琼脂糖作为冻干保护剂不会降解DNA，不影响DNA质量。由图5可知，水稻RNA经冻干后，加琼脂糖冻干保护剂的RNA电泳谱型和未加冻干保护剂的RNA电泳谱型一致，28S、18S和5S条带清晰，说明琼脂糖作为冻干保护剂不会降解RNA，不影响RNA质量。

对复溶后的上清进行核酸浓度测定，计算回收率，结果参见表6～表8：

表6：不同浓度不同类别琼脂糖溶液对人基因组DNA冻干后再复溶的回收率情况

表7：不同浓度不同类别琼脂糖溶液对质粒DNA冻干后再复溶的回收率情况

表8：不同浓度不同类别琼脂糖溶液对植物RNA冻干后再复溶的回收率情况

由表6～8可知，人基因组DNA、质粒DNA和RNA的回收率均超过95％，三者的平均回收率约100％，说明复溶后核酸得率高，几乎无损失，可见琼脂糖不吸附核酸，是一个良好的冻干保护剂。

实施例4：琼脂糖溶液作为蛋白保护剂并经冻干后的形状及回收率

牛血清白蛋白(BSA)是一种在生化实验中有广泛应用的经典蛋白质。以1mg/ml、0.316mg/ml、0.1mg/ml的BSA为检测样品，吸取200μl的不同浓度的BSA溶液至洁净的Eppendorf管中，再往溶液中加等体积常温(25℃左右)下呈液态的0.025％低熔点琼脂糖溶液，低熔点琼脂糖溶液的终浓度为0.0125％，总体积为400μl。对照组为400μl的不同浓度的BSA溶液，确保试验组总体积一致，再进行冷冻干燥。冻干后形状见图6，结果可见，未加琼脂糖溶液为冻干保护剂的情况下，1mg/ml、0.316mg/ml、0.1mg/ml的BSA溶液，经冻干后均呈现不规则状，结构塌陷，蛋白随机粘附在离心管壁上。而加等体积0.025％低熔点琼脂糖溶液的BSA溶液，都能形成良好的、较为紧凑的空间立体结构。

室温放置2周后，往对照组中加入400μl水进行复溶，往琼脂糖为冻干保护剂组中加入200μl的水进行样品复溶。随着水的加入，可见琼脂糖为冻干保护剂组的三维空间立体结构迅速被溶解，复溶速度快，同时溶液中出现透明小颗粒，系因为冻干后的琼脂糖分子不溶于水。由于其密度大于水溶液，经静置或离心后，即可去除琼脂糖，不引入二次污染。

颠倒混匀充分复溶后，12000g离心3min，对上清溶液进行蛋白浓度测定。由表9可知，三个BSA浓度的回收率均约为100％，说明复溶后蛋白得率高，几乎无损失，可见琼脂糖不吸附蛋白，是一个良好的蛋白样品冻干保护剂。

表9：低熔点琼脂糖溶液对BSA蛋白冻干后再复溶的回收率情况

实施例5：琼脂糖溶液作为多糖保护剂并经冻干后的形状

多糖是单糖单元通过糖苷键连接组成的长链态、聚合状碳水化合物分子。淀粉是一种代表性多糖。本实施例以可溶性淀粉为材料开展研究，用热水配制10mg/ml的可溶性淀粉溶液，再经稀释获得1mg/ml、0.316mg/ml、0.1mg/ml的可溶性淀粉为检测样品，吸取200μl不同浓度的可溶性淀粉溶液至洁净的Eppendorf管中，再往溶液中加等体积常温(25℃左右)下呈液态的0.025％低熔点琼脂糖溶液，总体积为400μl，低熔点琼脂糖溶液终浓度为0.0125％。对照组为不加0.025％低熔点琼脂糖溶液的可溶性淀粉溶液，其中1mg/ml、0.316mg/ml浓度的可溶性淀粉溶液体积为480μl，0.1mg/ml的可溶性淀粉溶液的体积为800μl。上述组别进行冷冻干燥。

冻干后形状见图7，结果可见，未加琼脂糖溶液为冻干保护剂的情况下，1mg/ml、0.316mg/ml、0.1mg/ml的可溶性淀粉溶液，经冻干后均呈现不规则状，结构塌陷，淀粉随机粘附在离心管壁上。而加等体积0.025％低熔点琼脂糖溶液的可溶性淀粉溶液，都能形成良好的、较为蓬松的空间立体结构。

综上所述，常温下(25℃左右)为液态的琼脂糖溶液，其与待冻干生物大分子溶液能以任何比例混合，操作简便，琼脂糖冻干后可形成良好的三维网状立体空间结构、给生物大分子提供空间支撑，且不吸附生物大分子、不与生物大分子反应，复溶时不影响生物大分子的重新溶解，可作为生物大分子冻干保护剂使用，对于生物大分子的储存和运输具有重要意义。