碳酸酐酶1和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a作为分子标志物在结直肠癌诊断中的应用

摘要

本发明公开了碳酸酐酶1和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a作为分子标志物在结直肠癌诊断中的应用。本发明通过基于高通量的色谱质谱联用的蛋白质组学技术筛选结直肠癌组织与远端正常组织中的差异生物标志物，以及结直肠癌患者与无癌对照人群血清中的差异生物标志物；通过组织及血清样本的蛋白质组学结果对比分析筛选结直肠癌相关候选生物标志物；通过外部数据库验证生物标志物区分结直肠癌的能力；最后通过低通量方法检测病例对照人群血清的结直肠癌生物标志物，评价标志物对结直肠癌的诊断能力。基于筛选的生物标志物尝试建立可用于结直肠癌诊断的快速、灵敏、特异的标准方法体系，为大规模人群筛检及临床诊断提供帮助。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于人群结直肠癌诊断的生物标志物及其应用。特别涉及碳酸酐酶1和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a作为分子标志物在结直肠癌诊断中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

结直肠癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，2018年结直肠癌的发病率为所有癌症中的第四位，同时结直肠癌的死亡率在所有癌症中位列第三。不同性别人群中，结直肠癌的发病率在男性和女性中分别为第三位和第二位，并且死亡率在男性和女性中也同样分别为第三位和第二位。在2019年至2021年的全球癌症统计报告中，结直肠癌的发病率与死亡率在男性和女性中均为第三位。

在中国，结直肠癌在所有癌症中的发病率排名第五。与2010年相比，2011年中国结直肠癌的发病率为从15/10万人上升至25/10万人，死亡率从7/10万人上升至13/10万人，总体呈上升趋势。在中国的不同地区结直肠癌的发病率也有所不同，经济相对发达城市地区的发病率高于经济较为落后的农村地区。

在过去的几十年中，已经提出了几种用于诊断结直肠癌的方法，主要有：内镜检查、粪便检测、影像学检查和血液检查。患者早期诊断可有效提高其生存率，诊断为局部病灶(Ⅰ期和Ⅱ期)的患者5年生存率为90.1％，随着肿瘤分期的进展，结直肠癌患者的预后迅速恶化，诊断为局部扩散(Ⅲ期)和远端转移(Ⅳ期)的患者5年生存率分别为69.2％和11.7％。目前，近45％的结直肠癌患者会被诊断出患有晚期癌症或转移，其五年生存率不到10％。相比之下，如果诊断出肿瘤仍位于局部，则可以通过手术切除肿瘤治愈超过90％的患者。早期发现结直肠癌并提供相应的治疗措施可以提高结直肠癌患者的生存率，因此应该更注重结直肠癌的早期筛查。

尽管有多种可用与结直肠癌的筛查方法，同时也已经明确证明筛查可以降低结直肠癌相关死亡的风险，但筛查效果仍然受到测试性能的局限性，如结直肠癌筛查方法的不充分使用以及筛查依从性的限制。作为结直肠癌筛查与诊断的金标准，结肠镜检查因其侵入性引起不适，有超过一半的患者不会使用结肠镜检查。粪便潜血检测是非侵入性的方法，但因为其结果的灵敏度低不能被推广与普及。而影像学检查常在确定为肠梗阻时才会使用。因此，在诊断时，许多患者出现局部晚期或转移性疾病的情况，甚至在发达国家中也观察到这种现象。因此，仍需要寻找常规检测中可以检测得到的结直肠癌早期生物标志物，血液仍是早期检测标志物的理想样品。于是，结直肠癌研究人员将研究重点放在分子标记物鉴定上，以开发用于无创筛查结直肠癌，以提高人群的筛查依从性。

癌胚抗原(CEA)是被研究最多的蛋白质，并且作为肿瘤标志物在结直肠癌的随访中的应用已有40多年的历史，但由于其在早期结直肠癌中的敏感性较低(43％至69％)，因此无法用于结直肠癌筛查，其诊断适用性同样存在争议。

虽然生物标记物的数量随着生物检测技术的发展激增，但是很少有新的生物标记物会经过严格的验证并用于实际临床。实际上，在过去的十年左右的时间内，很少有新的肿瘤标志物被美国食品药品监督管理局(FDA)批准并用于临床。综上，仍然没有足够的证据来确定哪种生物标志物具有明显的优势，且普遍适用的结直肠癌的筛查和诊断方法尚未明确。为了准确的诊断结直肠癌并提供早期治疗，非常有必要采用一种新的技术或方法筛选可靠的结直肠癌的生物标志物，蛋白质组学正是解决以上问题的关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于诊断结直肠癌的生物标志物及其应用，所述的生物标志物可以灵敏且特异的诊断结直肠癌。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

首先，本发明提出了碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1，CA1)和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a(Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a，SMPDL3A)联合作为分子标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

其次，本发明还提出了用于检测碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1，CA1)和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a(Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a，SMPDL3A)的试剂在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。

其中，优选的，所述的试剂通过检测个体空腹静脉血中碳酸酐酶1(Carbonicanhydrase 1，CA1)和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a(Acid sphingomyelinase-likephosphodiesterase 3a，SMPDL3A)的浓度来诊断结直肠癌。

其中，优选的，所述的检测方法包括通过采用ELISA检测方法或Western Blot检测方法对个体空腹静脉血碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1，CA1)和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a(Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a，SMPDL3A)的浓度进行检测。

进一步的，本发明还提出了一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1，CA1)和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a(Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a，SMPDL3A)的试剂。

其中，优选的，所述的试剂为用于碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase 1，CA1)和酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3a(Acid sphingomyelinase-like phosphodiesterase 3a，SMPDL3A)的ELISA检测试剂或Western Blot检测试剂。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过基于高通量的色谱质谱联用的蛋白质组学技术筛选结直肠癌患者的肿瘤组织与远端正常组织中的差异生物标志物(蛋白质)，以及结直肠癌患者与无癌对照人群血清中的差异生物标志物(蛋白质)，不同类型样本的蛋白质组学结果对比分析筛选结直肠癌相关候选生物标志物；通过外部数据库验证生物标志物区分结直肠癌的能力；最后通过低通量方法检测病例对照人群的结直肠癌生物标志物评价标志物对结直肠癌的诊断能力。高通量组学筛选结合靶向生物标志物定量分析，同时结合外部数据库验证，使标志物选择更准确。基于本发明筛选得到的生物标志物可尝试建立用于结直肠癌诊断的快速的、灵敏的、特异的标准方法体系，为大规模人群筛查及临床诊断结直肠癌提供帮助。

附图说明

图1为组织和血清中发现的差异蛋白质；

其中：(A)血清；(B)组织；

图2为组织和血清联合蛋白候选标志物筛选流程图；

图3为候选蛋白质相互作用关系图；

图4为候选蛋白标志物外部数据验证流程图；

图5为候选蛋白标志物在癌和正常组织中表达箱式图；

图6为候选蛋白标志物相关矩阵；

图7为候选蛋白标志ROC曲线；

图8为CA1和SMPDL3A在多种癌症的肿瘤与正常组织中的mRNA表达差异；

图9为血清ELISA检测结果及诊断效果评价；

其中：(A)为使用人(Human)CA1 ELISA检测试剂盒对血清蛋白标志物进行检测；(B)为人(Human)SMPDL3A ELISA检测试剂盒对血清蛋白标志物进行检测；(C)为使用ROC曲线对CA1和SMPDL3A联合诊断结直肠癌的能力进行评价。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1结直肠癌组织与血清蛋白质组学实验筛选候选生物标志物

1、样品采集：

1)结直肠癌病例人群：为2016年哈尔滨医科大学附属第三医院经病理诊断为结直肠癌的患者，排除神经内分泌癌、恶性黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃肠道间质瘤、Lynch综合征结直肠癌患者，仅保留新诊断的病理确诊病例。

组织样本采集：于术中采集其结直肠癌组织和配对远端正常粘膜组织样本5例，立即保存在液氮中，并转运至-80℃冰箱中存放，直至检测分析。

血清样本采集：术前空腹静脉血样本5-10ml共15例。采集后静置1-2小时，3000转/分钟离心10分钟，吸出上层乳黄色上清液，分装血清，冻存于-80℃冰箱待用。

2)无癌对照人群：纳入2016年同时期在哈尔滨医科大学附属第二医院做过结直肠癌筛查确定未患有癌症的对照人群15例(蛋白质组检测)。

血清样本采集：采集其空腹静脉血样本5-10ml。采集后静置1-2小时，3000转/分钟离心10分钟，吸出上层乳黄色上清液，分装血清，冻存于-80℃冰箱待用。

2、蛋白质组学实验：

结直肠癌患者和无癌对照人群血清和组织的蛋白质组学(TMT标记的色谱质谱联用)分析全面系统的分析结直肠癌蛋白组学特征；通过生物信息分析鉴定蛋白(含差异蛋白)和比较差异蛋白的表达量，筛选可靠的结直肠癌诊断生物标志物。

具体步骤：样品蛋白的提取(高丰度蛋白的去除)；对富集的低丰度蛋白进行酶解消化；对酶解得到的肽段进行同位素标记；检测标记结果，以确定标记成功；将待分析的样品进行混合，经过纳升流速的HPLC液相系统Easy nLC进行分离；串联质谱鉴定蛋白质；数据分析(MASCOT)：差异蛋白的相对定量信息列表；go分类和功能分析；差异蛋白的Pathway富集分析；差异蛋白互作网络构建、转录因子预测等。

结果：高通量的色谱质谱联合蛋白质组学发现，在组织中总共鉴定出6313种蛋白质，其中2916种蛋白质是肿瘤组织与远端正常组织的差异蛋白质(P<0.05)。在血清中总共鉴定出912种蛋白质，其中183种蛋白质是病例对照血清的差异蛋白质(P<0.05)，如图1所示。最终，确定了10个在组织和血液样本中，重复出现的具有相同的变化趋势(上调或下调)的蛋白，为候选蛋白标志物(图2，表1)。

表1 组织与血清差异蛋白比对结果

GO注释分析结果显示：在细胞组分中多数是微粒与微粒腔，例如血液微粒、分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔、囊泡腔、内质网腔、富含ficolin-1的颗粒、富含ficolin-1的颗粒内腔、液泡腔以及嗜蓝粒颗粒腔。这些细胞组分可能是肿瘤组织中的细胞分泌或基质中的某些结构的碎片的蛋白流出到血液之中。

在分子功能分析中，血清与组织重复的是抗氧化活性、肌动蛋白结合、细胞粘附分子结合、细胞外基质结构成分和过氧化物酶活性，这也验证了细胞组分中组织与血清中的重复可能是肿瘤组织的细胞外基质的蛋白。

将10个候选标志物在STRING在线分析平台中进行蛋白质相互作用分析，结果如图3所示。CA1、HBB、HBD和HBA2之间具有相关性，同样ALAD和CAT之间显示出了共表达关系。

由以上结果可知，CA1、ALAD、S100A4、SMPDL3A、TARBP1、ZNF648、HBA2、HBB、HBD、CAT有作为结直肠癌诊断的潜力。

3、基于外部数据验证筛选的生物标志物

在LinkedOmics(http://linkedomics.org/)下载美国国家癌症研究所的临床蛋白质组学肿瘤分析协会(CPTAC)的结直肠癌蛋白质组数据，其中包括97个肿瘤和100个正常组织样品。使用在线分析平台STRING(string-db.org)对蛋白质进行相互作用分析，分析蛋白质之间的关联途径。使用在线分析平台TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)分析蛋白质在不同类型肿瘤的癌与癌旁之间的差异表达。

结直肠癌CPTAC数据分析结果显示，癌组织和正常组织差异蛋白共5650种，与候选的10个蛋白标志物重复的有8个(图4)，分别为：CA1、ALAD、S100A4、SMPDL3A、HBA2、HBB、HBD、CAT，这些蛋白在癌组织中低表达，如图5所示。

同时，CPTAC数据验证了这八个蛋白质在肿瘤组织中的关系，如图6。HBA2、HBB和HBD这三个蛋白之间的相关性很高，意味着他们存在于同一细胞或是在某种结构中发挥着相似的作用，结果与蛋白质相互作用分析结果相符。而其他的五个蛋白之间没有明显的相关性。

ROC曲线能够反映检测方法的预测性以及对检测方法的灵敏度和特异度之间关系从而进行描述的指标。所得出的结果能够判断某种因素对于某种疾病的诊断是否有诊断价值。AUC代表ROC曲线下的面积，表示预测准确率。AUC值取值在0-1之间，数值越大，代表正确率越高。为了判断蛋白的诊断效果，将组织中CA1、ALAD、S100A4、SMPDL3A、HBA2、HBB、HBD、CAT均做了ROC曲线分析，结果如图7所示，八个候选蛋白标志物在组织水平对肿瘤具有较好的分类能力。

为了验证候选蛋白质对于结直肠癌的特异性，使用在线TCGA数据库分析平台TIMER，将八个蛋白基因在癌与癌旁中的mRNA表达差异进行了对比，结果如图8显示，只有CA1和SMPDL3A在正常结直肠组织中显示出特异性的高表达，具有结直肠组织特异性。

基于上述结果，我们筛选出CA1和SMPDL3A这2个在组织和血清中有显著差异，且有较高诊断学价值的蛋白质，作为结直肠癌的诊断标志物。

实施例2结直肠癌诊断蛋白标志物的人群验证

对具有结直肠癌特异性的两个蛋白质CA1和SMPDL3A在结直肠癌患者和健康人群中进行了低通量验证，检测其在病例对照的血清中的蛋白表达情况，评价其对结直肠癌的诊断学价值。

1.样品收集

本研究纳入108例2016年哈尔滨医科大学附属第三医院经病理诊断为结直肠癌患者以及120例2017年在哈尔滨医科大学附属第二医院的骨科患者并确定未患有癌症的对照人群。在病例对照中女性参与者分别占32.4％和48.4％，其中大于六十岁人群分别占53.7％和36.7％，人口统计学信息表2。

采集其空腹静脉血样本5-10ml。采集后静置1-2小时，3000转/分钟离心10分钟，吸出上层乳黄色上清液，分装血清，冻存于-80℃冰箱待用。

表2 血清样本病例对照人口学特征

2.检测方法

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对血清蛋白标志物进行检测。往预先包被人CA1和SMPDL3A抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CA1和SMPDL3A呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品活性。

3.生物标志物验证结果

根据说明使用人(Human)CA1 ELISA检测试剂盒、人(Human)SMPDL3A ELISA检测试剂盒对血清蛋白标志物进行检测。结果如图9(A)，(B)所示，无癌对照人群的血清中CA1、SMPDL3A水平高于结直肠癌患者，且具有统计学意义(P＜0.05)。

4.血清蛋白标志物诊断学价值评价

ROC曲线分析生物标志物的诊断能力，在最佳截断值下CA1的灵敏度和特异度分别为90.2％和36.8％，SMPDL3A的灵敏度和特异度分别为84.3％和80.2％(表3)。在logistic回归模型中，计算CA1和SMPDL3A联合预测变量，使用ROC曲线对CA1和SMPDL3A联合诊断结直肠癌的能力进行评价，结果如图9(C)，其AUC为0.947(0.917-0.978)，灵敏度和特异度分别为82.8％和93.3％，这两个蛋白可以作为联合标志物对结直肠癌进行诊断。

表3 ELISA检测病例对照血清蛋白标志物情况

综上，CA1和SMPDL3A可用于人群结直肠癌的诊断，且具有良好的诊断效能，价格适中，检测速度快。