一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法

摘要

本发明涉及固态发酵制备饲用β‑甘露聚糖酶的方法，有效解决饲用β‑甘露聚糖酶的生产，满足对β‑甘露聚糖酶的实际需要问题，制备马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，无菌操作将黑曲霉HKS016菌株接种于PDA斜面培养基上，恒温培养，直到斜面上长满黑色孢子，得斜面菌种；无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，混匀，温度28‑30℃，直到麸皮面上长满黑色孢子，得种子；无菌操作将种子接种于发酵培养基中，混匀，恒温培养，50℃低温烘干，粉碎，得饲用β‑甘露聚糖酶；本发明固态发酵设备投资少，能耗低，环境友好，固态发酵，变废为宝，高效节能环保，酶活性高，适合畜禽动物肠道等消化系统环境，在饲料中应用拥有巨大的市场前景。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物，特别是一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法。

背景技术

β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族，能够水解甘露聚糖中的β-1,4-D-吡喃糖苷键，降解甘露聚糖等多聚糖为具有2-10个单糖单元的寡糖组成的产物。

β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸及制药等行业得到广泛应用，尤其在食品、饲料领域应用前景广阔，食品方面β-甘露聚糖酶作为特殊的酶应用于果汁加工过程中降低果汁的粘度、果汁的澄清（CHAUHAN PS，2014）；在面团中添加β-甘露聚糖酶处理15min的2.0%魔芋葡苷聚糖，能够显著抑制二硫键的断裂，防止面团水分的散失，维持面团的拉伸能力（崔婷婷，2019）；用于生产功能性低聚糖甘露寡糖（manno-oligosaccharides，MOS）（郭金玲，2018），甘露寡糖有很好的生物调节功能，能够有效降低人体胆固醇水平，减轻便秘、降低血糖，是良好的食品添加剂（李长影，2011）；用于降解瓜尔豆胶（guar gum，GG）生产功能性可溶性膳食纤维半乳甘露聚糖（partially hydrolysed guar gum，PHGG）（KAIRA G S，2016）。

饲料方面β-甘露聚糖酶作为第三代饲料酶成为研究的热点（冯定远，2018），作为半纤维素酶类的一种，可降解饲料豆粕中β-甘露聚糖抗营养因子，降低肠道粘度，提高豆粕中营养物质消化率，提高猪的生长性能（薛瑞婷，2020）。我国畜禽养殖上普遍采用玉米-豆粕型日粮，在玉米-豆粕型日粮中，玉米可被单胃动物消化，但豆粕中的能量只有50%-60%被利用，利用率低调主要原因是豆粕中含有22.7%的半纤维素，其主要成分是β-甘露聚糖，β-甘露聚糖除了消耗率低之外，由于β-甘露聚糖具有较高度持水活性，在水中溶解后变成有粘性的溶液使畜禽消化道中食糜的粘稠度增加，浓度较高时分子本身相互作用成网状结构易形成凝胶，还具有较强的抗营养作用（杨鸿昆，2007），食糜粘稠的增加减缓了肠内食糜通过消化道的速度从而降低了畜禽的采食量，使已经消化了的养分向小肠壁扩散的速度减慢，降低了已经消化养分的吸收，养分消耗增加，减少了消化酶与饲料中各种营养物质的接触机会，行之有效的解决方法是在饲料中添加β-甘露聚糖酶。

β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、动物和微生物中，微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点，是最主要的来源，如细菌中的枯草芽孢杆菌（

玉米-豆粕型日粮为畜禽养殖业主要养殖配方日粮类型，为解决畜牧养殖业绿色发展对β-甘露聚糖酶需要，发酵原料麸皮、豆腐渣等来源广泛、价格低廉，豆腐渣是豆腐加工的副产品，滤去浆汁后所剩下的渣滓，是豆腐加工的下脚料，豆腐渣当作废料一样扔掉。我国每年产出的数量以百万吨计，含水量为81%的豆腐渣冷冻干燥脱水至6.7%成为粉状，含有丰富的氮源等营养物质，其中含蛋白质17.8%，脂肪5.9%，糖类37%，维素（纤维素、半纤维素）9.6%，灰分3.85%，19种以上氨基酸，且富含钙、铁、镁、钾等矿物质元素（王东玲，2010），矿物质元素可满足微生物生长及产酶的需要，以豆腐渣为发酵原料，既可强化其应用功能又能降低生产成本。另外，β-甘露聚糖酶是诱导酶，豆腐渣中含有β-甘露聚糖诱导物。

β-甘露聚糖酶是食品及饲料工业生产用添加剂和微生物，目前市场满足不了工业生产中的实际需要，因此，能否利用玉米、豆粕及豆腐加工的副产品等，提供一株新的真菌，用于固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶，真正解决β-甘露聚糖酶的生产，满足市场的实际需要，至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法，可有效解决饲用β-甘露聚糖酶的生产，满足对β-甘露聚糖酶的实际需要问题。

本发明解决的技术方案是，一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

（1）制备马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：将洗净去皮、挖去芽眼的马铃薯200g切成片状或丝状，加水1000mL，煮沸15min，过滤，加入20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其溶化，补水至体积为1000mL，即成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，摆斜面，得PDA斜面培养基；

（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将黑曲霉HKS016菌株接种于步骤（1）制备的PDA斜面培养基上，28-30℃恒温培养，直到斜面上长满黑色孢子，得斜面菌种；

所述的黑曲霉HKS016分类命名为黑曲霉（

（3）制备种子：用接种环无菌操作将步骤（2）制备的斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.20-0.40%，混匀，培养温度为28-30℃，直到麸皮面上长满黑色孢子，孢子数为1-3×10

所述的种子培养基：麸皮100g，加水95mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，得种子培养基；

（4）制备β-甘露聚糖酶：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基重量的0.4-0.6%，混匀，培养温度为28-30℃，培养28h-36h，50℃低温烘干，粉碎过40目筛，得饲用β-甘露聚糖酶；

所述的发酵培养基：麸皮70g，干豆腐渣25g，脱脂米糠5g，硫酸铵0.2g，加水100mL（若为鲜豆腐渣则减去相应的鲜豆腐渣含水量），混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，得发酵培养基。

本发明固态发酵设备投资少，能耗低，制备工艺简单和没有废渣废水排出，环境友好等特点，采用豆腐渣、脱脂米糠农副产品下脚料为原料生产成本低，利用新的一株真菌黑曲霉HKS016，固态发酵，生产饲用β-甘露聚糖酶，变废为宝，高效节能环保，制备出的β-甘露聚糖酶活性高，在35-50℃下，pH2.5-6.0之间能保持高的酶活，适合畜禽动物肠道等消化系统环境，在饲料中应用拥有巨大的市场前景，经济和社会效益巨大。

具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

（1）制备马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：将洗净去皮、挖去芽眼的马铃薯200g切成片状或丝状，加水1000mL，煮沸15min，过滤，加入20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其溶化，补水至体积为1000mL，即成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，摆斜面，得PDA斜面培养基；

（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将黑曲霉HKS016菌株接种于步骤（1）制备的PDA斜面培养基上，29℃恒温培养，直到斜面上长满黑色孢子，得斜面菌种；

（3）制备种子：用接种环无菌操作将步骤（2）制备的斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.30%，混匀，培养温度为29℃，直到麸皮面上长满黑色孢子，孢子数为2×10

（4）制备β-甘露聚糖酶：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基重量的0.5%，混匀，培养温度为29℃，培养32h，50℃低温烘干，粉碎过40目筛，得饲用β-甘露聚糖酶。

实施例2

本发明一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

（1）制备马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：将洗净去皮、挖去芽眼的马铃薯200g切成片状或丝状，加水1000mL，煮沸15min，过滤，加入20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其溶化，补水至体积为1000mL，即成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，摆斜面，得PDA斜面培养基；

（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将黑曲霉HKS016菌株接种于步骤（1）制备的PDA斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满黑色孢子，得斜面菌种；

（3）制备种子：用接种环无菌操作将步骤（2）制备的斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.40%，混匀，培养温度为28℃，直到麸皮面上长满黑色孢子，孢子数为1×10

（4）制备β-甘露聚糖酶：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基重量的0.6%，混匀，培养温度为28℃，培养36h，50℃低温烘干，粉碎过40目筛，得饲用β-甘露聚糖酶。

实施例3

本发明一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

（1）制备马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：将洗净去皮、挖去芽眼的马铃薯200g切成片状或丝状，加水1000mL，煮沸15min，过滤，加入20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其溶化，补水至体积为1000mL，即成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，摆斜面，得PDA斜面培养基；

（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将黑曲霉HKS016菌株接种于步骤（1）制备的PDA斜面培养基上，30℃恒温培养，直到斜面上长满黑色孢子，得斜面菌种；

（3）制备种子：用接种环无菌操作将步骤（2）制备的斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.2%，混匀，培养温度为30℃，直到麸皮面上长满黑色孢子，孢子数为3×10

（4）制备β-甘露聚糖酶：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于发酵培养基中，接种量为发酵培养基重量的0.4%，混匀，培养温度为30℃，培养28h，50℃低温烘干，粉碎过40目筛，得饲用β-甘露聚糖酶。

本发明发酵原料丰富，利用新筛选的一株真菌黑曲霉HKS016，固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶，方法简单，易生产，产品酶活性高，并经实验，效果非常好，有关资料如下：

一、菌株的筛选和鉴定

采集的河南南阳魔芋种植土壤样品为实验材料，通过魔芋胶为碳源培养基富集培养，分离平板初筛分离纯化，以发酵产酶复筛，测定产β-甘露聚糖酶酶活力，得到一株高产β-甘露聚糖酶真菌菌株HKS016，具体是：

（1）初筛：多点取样四分法处理后，无菌操作条件下称取土壤样品样品5.0g于250mL三角瓶中，加入100mL灭菌蒸馏水，震荡混匀10～15min，然后取2.0mL土壤悬浊液加入到盛有富集培养基的三角瓶中，30℃，180 r/min的摇床培养1d左右。培养好的富集培养液1.0mL分别稀释到10

所述的富集培养基：魔芋胶5.0g，蛋白胨10.0 g，KH

（2）复筛：将初筛得到的分离纯化后所得的真菌菌株，无菌操作挑取2-3环斜面真菌菌落孢子于发酵培养基中进行产酶试验复筛，每个菌株作3个平行，于28～30℃下培养，培养条件为30℃，180 r/min的摇床培养40h后，进行β-甘露聚糖酶酶活力检测分析,把

（3）菌株HKS016的形态特征：

菌株HKS016孢子点种于察氏酵母培养基（CYA）平板上培养，于25℃下培养7d后，菌落直径64～67 mm，外观形态：黑褐色，具放射状皱纹，质地丝绒状，反面浅黄色，无渗出液产生，无可溶性色素产生。所述的察氏酵母培养基（czapek yeast exatract agar，CYA）：硝酸钠3.0g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，酵母膏5.0g，蔗糖30.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL；

（4）菌株HKS016在显微镜下的形态，分生孢子梗发生于基质，孢梗茎壁平滑透明，直径7～18 μm；分生孢子头球形，直径60～160 μm；顶囊近球形，直径45～75 μm；产孢结构双层，梗基6～13×2.5～3.5 μm，瓶梗7～15×1.5～3.0 μm；分生孢子近球形，直径2.5～4.5 μm，表面粗糙。从菌落及孢子形态观察可以看出，根据魏景超《真菌鉴定手册》及相关文献有关报道，初步将菌株HKS016鉴定为黑曲霉菌（

（5）菌株HKS016的ITS基因的序列分析：

用真菌基因组DNA提取试剂盒（D2300），按照试剂盒说明书操作流程提取菌株HKS016的基因组DNA。以其为模板，采用真菌通用引物，上游引物ITS1：5

在50µLPCR反应体系中依次加入以下试剂： 2×E

PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s， 30个循环，最后72℃m末端·延伸10min。

基因的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测出现明显电泳条带后，将PCR纯化目的片段送至华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果进行序列比对分析：将测序得到的ITS结果基因序列分别提交到美国国立生物技术中心（national center forbiotechnology information，NCBI）的GenBank数据库，与选择的相关同源模式菌株（sequences from type material）序列进行基本局部比对搜索工具（basic localalignment search tool，BALST）比对分析。

结果显示，菌株HKS016采用真菌通用引物ITS进行PCR反应后，将目的片段送至华大基因科技股份有限公司进行测序，其ITS序列片段长度为562bp，具体序列见表1，ITS序列测序比对结果表明菌株HKS016在ITS基因的测序片段与数据库模式菌株

表1 HKS016菌株ITS序列

ITS基因序列长度（562bp）

依据菌株HKS016分子生物学ITS序列基因的比对分析，结合菌落形态、孢子形态观察，将菌株HKS016鉴定为黑曲霉属（

二、β-甘露聚糖酶酶活力的测定：

（1）pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置：a、称取7.16g磷酸氢二钠溶解定容至100mL，b、称取2.1g柠檬酸溶解定容至100mL，取a溶液24.3mL和b溶液25.7mL混匀，用精密pH试纸测至pH值为5.0；（2）DNS试剂：称取3,5-二硝基水杨酸6.30g置于2N氢氧化钠262mL溶液中，然后加入酒石酸钾钠的热溶液（182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中），再加5.0g苯酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌至溶解，冷却后定容至1000mL，置于棕色瓶中备用；（3）甘露聚糖溶液配置（6mg/mL）：称取0.600g甘露聚糖（Sigma公司 G0753），加入pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至100mL，冰箱4℃保存，有效期3天；（4）D-甘露糖标准贮备溶液配置：精确称取干燥至恒重的D-甘露糖1.000g，加入pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至100mL，得到10.0mg/mLD-甘露糖标准贮备溶液；（5）D-甘露糖标准溶液配置：吸取D-甘露糖标准贮备溶液配置1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL，加入pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液分别定容至100mL，配置成D-甘露糖标准溶液，浓度分别为：0.10mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL；（6）标准曲线绘制：分别吸取D-甘露糖标准溶液各2mL，再分别加入2mLpH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和5mL DNS试剂，摇匀定容至25mL，以空白调零，在540nm处测定吸光度，以D-甘露糖溶液浓度为Y轴，吸光度为X轴，绘制标准曲线，获得线性回归方程；（7）样品处理：将发酵后的β-甘露聚糖酶粉碎，过40目筛，称取一定量β-甘露聚糖酶粉碎样品，加入适量pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液50℃浸提2小时，4层纱布过滤备用，测定时适当用缓冲液稀释，控制待测酶液中β-甘露聚糖酶酶活力控制在0.04U/mL-0.08 U/mL之间；（8）样品β-甘露聚糖酶测定：称取2g甘露聚糖溶液，加入2mL经过适当稀释的酶液，37℃精确反应30分钟，加入5mL DNS试剂，震荡摇匀，沸水浴5分钟，取出迅速冷却至室温，加水定容至25mL混匀，在540nm处测定吸光度（A），通过线性回归方程计算β-甘露聚糖酶酶活力；同样作样品空白管的吸光度：称取2g甘露聚糖溶液，加入5mL DNS试剂，37℃精确反应30分钟，加入2mL经过适当稀释的酶液，震荡摇匀，沸水浴5分钟，取出迅速冷却至室温，加水定容至25mL混匀，在540nm处测定吸光度（A

β-甘露聚糖酶酶活力（U/g）＝[（A－A

式中A－样品管的吸光度；

A

k－标准曲线的斜率；

b－标准曲线的截距；

M－称取的β-甘露聚糖酶质量；

1000－单位换算系数；

30－反应时间；

n－稀释倍数。

β-甘露聚糖酶酶活力单位定义：在37℃，pH5.0条件下，每分钟水解底物甘露聚糖产生1µg还原糖的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶酶活力单位（U）。

经多批次发酵后测定β-甘露聚糖酶酶活力均在4331U/g左右，平均≥4331U/g，所制备的β-甘露聚糖酶符合企业标准要求。

三、在玉米-豆粕型猪用日粮中添加β-甘露聚糖酶的应用实验

（1）试验动物：31日龄保育猪（品种：杜×长×大），随机分为2个处理，每个处理设3个重复，每个重复7头仔猪。

试验周期：30天。

保育猪饲料基础配方：膨化玉米56%，豆粕22%，发酵豆粕8%，鱼粉3，乳清粉7%，预混料4%，营养水平：消化能（MJ/kg）13.99，粗蛋白质18.9，钙0.68，磷0.52。

对照组饲喂饲料基础配方日粮，实验组在饲料基础配方日粮基础上添加β-甘露聚糖酶500U/kg。

表2 对保育猪生产性能的影响

试验结果：实验组较对照组，试验组保育猪的日采食量较对照组略有提高，平均提高26g，提高4.89%，但差异不显著（

（2）试验动物：7日龄乳猪（品种：杜×长×大），随机分为2个处理，每个处理设3个重复，每个重复5头仔猪。

试验周期：25天。

乳猪配合饲料基础配方：膨化玉米25%，玉米15%，大米10%，豆粕22%，发酵豆粕7%，鱼粉3%，乳清粉8%，血浆蛋白粉5%，奶粉1%，预混料4%，营养水平：消化能（MC/kg）3.81，代谢能（MC/kg）2.29，粗蛋白质20.1，钙0.56，有效磷0.38，赖氨基酸1.46。

对照组饲喂乳猪配合饲料基础配方，实验组在饲料基础配方日粮基础上添加β-甘露聚糖酶600U/kg。

表3对乳猪生产性能的影响

试验结果：实验组较对照组，实验组平均日采食量较对照组略有提高；平均日增重提高19.6%，达到显著水平（

由以上可以清楚看出，本发明固态发酵设备投资少，经计算，可节约投资30-40%，能耗低，能耗节约50%以上，制备工艺简单和没有废渣废水排出，无污染，对环境友好，采用豆腐渣、脱脂米糠农副产品下脚料为原料，原料丰富，成本低，利用新的一株真菌黑曲霉HKS016，固态发酵生产饲用β-甘露聚糖酶，变废为宝，高效节能环保，制备出的β-甘露聚糖酶活性高，在35-50℃下，pH2.5-6.0之间能保持高的酶活，活性达4331U/g左右，适合畜禽动物肠道等消化系统环境，在饲料中应用拥有巨大的市场，前景广阔，经济和社会效益巨大。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司

<120> 一种固态发酵制备饲用β-甘露聚糖酶的方法

<130> 2021

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 541

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillusniger）

<400> 1

ATTACCGAGT GCGGGTCCTT TGGGCCCAAC CTCCCATCCG TGTCTATTGT ACCCTGTTGC 1

TTCGGCGGGC CCGCCGCTTG TCGGCCGCCG GGGGGGCGCC TCTGCCCCCC GGGCCCGTGC 61

CCGCCGGAGA CCCCAACACG AACACTGTCT GAAAGCGTGC AGTCTGAGTT GATTGAATGC 121

AATCAGTTAA AACTTTCAAC AATGGATCTC TTGGTTCCGG CATCGATGAA GAACGCAGCG 181

AAATGCGATA ACTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAGTCTT TGAACGCACA 241

TTGCGCCCCC TGGTATTCCG GGGGGCATGC CTGTCCGAGC GTCATTGCTG CCCTCAAGCC 301

CGGCTTGTGT GTTGGGTCGC CGTCCCCCTC TCCGGGGGGA CGGGCCCGAA AGGCAGCGGC 361

GGCACCGCGT CCGATCCTCG AGCGTATGGG GCTTTGTCAC ATGCTCTGTA GGATTGGCCG 421

GCGCCTGCCG ACGTTTTCCA ACCATTCTTT CCAGGTTGAC CTCGGATCAG GTAGGGATAC 481

CCGCTGAACT TAAGCATATC AA 541