脑梗塞的功能恢复

摘要

本公开提供了治疗患有脑梗塞的受试者的方法，该方法包括向受试者全身性施用富含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)诸如STRO‑1+细胞或其子代的细胞群，以增强刺激诱导的皮质激活或减小梗塞体积。

说明书

技术领域

本公开涉及治疗人受试者的脑梗塞的方法。

背景技术

脑梗塞仍然是工业化世界内发病率和死亡率的主要原因。脑梗塞是第三大死亡原因。脑梗塞是由于大脑血液供应障碍引起的一种或多种大脑功能的迅速丧失。脑梗塞有两种常见类型：(i)缺血性脑梗塞，其由流向大脑的血液的暂时或永久阻塞引起，占脑梗塞病例的85％，和(ii)出血性脑梗塞，其由血管破裂引起，占剩余病例的大多数。脑梗塞常导致神经元细胞死亡，并可导致死亡。缺血性脑梗塞最常见的原因是大脑中动脉(颈内动脉下游的颅内动脉)闭塞，这损害了大脑(例如，大脑皮层)，例如大脑的运动和感觉皮层。这种损伤导致半身不遂、半身麻木，并根据受损的大脑半球，导致语言或视觉空间缺陷。受影响的大脑体积及其受损的功能可通过功能成像技术来可视化，所述成像技术是诸如血氧水平依赖(BOLD)磁共振成像(MRI)，该成像伴随着受影响大脑区域中的血流量的减少。

脑梗塞会影响受试者的身体、精神、情感或三者的结合。

脑梗塞可导致的一些身体残疾包括肌肉无力、麻木、压疮、肺炎、失禁、失用症(无法进行学习运动)、日常活动困难、食欲不振、失语、视力减退和疼痛。如果脑梗塞足够严重，或者在某一位置诸如脑干的部分，会导致昏迷或死亡。

脑梗塞导致的情绪问题可能是由于对大脑中情绪中心的直接损伤，也可能是因为沮丧和难以适应新的限制。脑梗塞后情绪困难包括抑郁、焦虑、惊恐发作、平面情感(无法表达情绪)、躁狂、冷漠和精神病。

脑梗塞导致的认知障碍包括知觉障碍、言语问题、痴呆以及注意力和记忆问题。脑梗塞患者可能没有意识到他或她自己的残疾，这种情况被称为疾病感失认症。在称为半空间忽视的疾患中，患者无法注意与受损的半球相对的空间一侧的任何事情。

如果在症状出现的三小时内施用，除了组织型纤溶酶原激活剂(TPA)外，还没有被批准的治疗脑梗塞的方法。鉴于缺乏用于治疗脑梗塞的治疗选择，迫切需要促进再灌注或具有神经保护作用的额外疗法。

发明内容

本公开基于本发明人的惊人发现，即全身性施用人间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)，例如STRO-1

因此，在本文所述的第一方面，是用于在脑梗塞后增加皮质激活或减少梗塞体积的方法，该方法包括向有此需要的人受试者全身性施用治疗有效量的富含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的人细胞群。

在一些实施方案中，脑梗塞是缺血性脑梗塞。在一些实施方案中，当脑梗塞是缺血性脑梗塞时，待治疗的受试者的脑梗塞是由缺氧缺血性脑病(HIE)引起的。在其它实施方案中，脑梗塞是出血性脑梗塞。

在一些实施方案中，脑梗塞位于运动皮层。在一些实施方案中，所述施用后受影响的体积减小。在一些实施方案中，皮质激活增加。在一些实施方案中，人受试者的运动功能得到改善。在一些实施方案中，治疗后皮质激活增加是对对侧触觉刺激的响应。在一些实施方案中，皮质激活在梗塞体积内增加。

在一些实施方案中，在脑梗塞后约24小时或更短时间内进行人细胞群的全身性施用。在其它实施方案中，全身性施用在脑梗塞后约12小时或更短时间内进行。

在一些实施方案中，MLPSC是STRO-1

在其它实施方案中，MLPSC是间充质干细胞。

在一些实施方案中，待施用的人细胞群是同种异体人细胞群。在其它实施方案中，所述人细胞群是自体人类细胞群。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用约2x10

在一些实施方案中，在施用前将待施用的人细胞群培养扩增。

在一些实施方案中，人细胞群来源于骨髓、牙髓、脂肪或多能干细胞。在一些实施方案中，人细胞群不来源于牙髓或脂肪。在一些实施方案中，人细胞群是经遗传修饰的人细胞群。

在一些实施方案中，细胞群的全身性施用是动脉内施用或静脉内施用。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括施用溶栓剂。在一些实施方案中，本文所述的方法避免了溶栓剂的施用。在其它实施方案中，在施用所述人细胞群之前或之后，不向受试者施用溶栓剂。在其它实施方案中，该方法包括施用甘露醇。在一些实施方案中，该方法包括将甘露醇和替莫唑胺作为单一制剂共施用或分开施用。在其它实施方案中，该方法包括施用抗炎剂。

在一些实施方案中，待施用的人细胞群被施用多次。在一些实施方案中，所述人细胞群每四周或更多周施用一次。

在其它实施方案中，单次施用所述人细胞群。

在一些实施方案中，所述人细胞群中的至少一部分细胞被标记用于体内检测。在一些实施方案中，当向受试者施用标记的细胞时，该方法还包括在施用后跟踪受试者中标记细胞的位置。

在任何上述方法的一些实施方案中，所述方法还包括确定施用后梗塞体积和/或梗塞体积内活性的变化。

本文所述的方法在细节上作必要的修改后适用于降低进一步脑梗塞风险的方法。

附图说明

图1.代表梗塞模型--颈内动脉闭塞(MCAO)后不同时间点各组大鼠前肢放置运动行为评分的线图。在MCAO治疗后的指定时间点，各组静脉内施用1x10

图2.代表MCAO后不同时间点各组大鼠后肢放置运动行为得分的线图。在MCAO治疗后的指定时间点，各组静脉内施用1x10

图3.代表MCAO之后不同时间点各组大鼠的身体摆动运动行为得分的线图。在MCAO治疗后的指定时间点，各组静脉内施用1x10

图4.代表MCAO之后体重的线图。MPC处理组与媒介物组相比，体重无显著差异。

图5.MCAO后大鼠中皮质对触觉刺激反应的MRI成像研究概要。

图6.MCAO大鼠研究的MRI成像设置的概要。

图7.显示第8天MRI时梗塞体积测量值(平均值±SEM)的条形图(上图)，以及梗塞体积占整个大脑的百分比(下图)。与媒介物处理组相比，MPC处理组具有统计学上更小的梗塞体积(p<0.05)。另外，MPC处理组中梗塞体积占全脑的百分比明显较小(p<0.05)。

图8.显示媒介物处理组和MPC处理组中由于左(对侧)前爪刺激导致的初级和次级运动皮层(下图)以及初级和次级体感皮层(下图)的激活的条形图。观察到MPC处理组中的初级运动皮层激活水平明显高于媒介物处理组(p<0.05)。

图9.显示了媒介物处理组和MPC处理组中，梗塞皮质体积内响应于对侧触觉刺激的皮质激活水平的条形图。MPC处理组中的梗塞区内皮质激活水平明显高于媒介物处理组(p<0.01)。

具体实施方式

在整个本说明书中，除非明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组成、步骤的组或物质组成的组的引用应被理解为涵盖这些步骤、物质组成、步骤的组或物质组成的组中的一个/种和多个/种(即一个/种或多个/种)。

除非另有明确说明，否则本公开的每个实例在经过必要修改之后都将被用于每个其它实例。

本领域技术人员将会理解，除了那些具体描述的以外，本公开易于进行变化和修改。应当理解，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或多个。

本公开在范围上不受本文所述的特定实例的限制，所述实例仅用于示例的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。

除非另有说明，否则使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术，在无需过度实验的情况下进行本公开。此类方法描述于例如以下文献中：Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Second Edition(1989)，整个第I、II和III卷；DNA Cloning:A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover，编辑，1985),IRL Press,Oxford,whole of text；Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait，编辑，1984)IRL Press,Oxford，全文，以及特别地其中的Gait的论文，第l-22页；Atkinson等人，第35-81页；Sproat等人，第83-115页；以及Wu等人，第135-151页；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑，1985)IRL Press,Oxford，全文；Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press,Oxford，全文；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan，编辑，Academic Press,Inc.)，整个系列；J.F.Ramalho Ortigao,"The Chemistry of Peptide Synthesis"In:Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website(Interactiva,Germany)；Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73 336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.和Merrifield,R.B.(1979)in The Peptides(Gross,E.和Meienhofer,J.编辑)，第2卷，第1-284卷，Academic Press,New York.12.Wünsch,E.，编辑(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden derOrganischen Chemie(Müler,E.，编辑)，第15卷，第14版，第1和2部分，Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.&Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑，1986,Blackwell Scientific Publications)；andAnimal Cell Culture:PracticalApproach，第3版(John R.W.Masters，编辑，2000),ISBN 0199637970，全文。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或诸如“包括”或“具有”的变型将被理解为暗示包括所述步骤或要素或整数或者步骤或要素或整数的组，但不排除任何其它步骤或要素或整数或者要素或整的组。

如本文所用，术语“脑梗塞”应理解为意指归因于流向大脑或脑干的血流的扰动的一个或多个大脑功能的丧失(通常迅速发展)。该扰动可以是由例如血栓形成或栓塞(在本文中称为“缺血性脑梗塞”)引起的局部缺血(缺乏血液)，或者可以是由于出血(在本文称为“出血性脑梗塞”)引起的。在一个实例中，大脑功能的丧失伴随着神经元细胞的死亡。在一个实例中，脑梗塞是由大脑或其区域的血液扰乱或流失引起的。在一个实例中，脑梗塞是持续超过24小时或在24小时内因死亡而中断的脑血管原因的神经功能缺损(根据世界卫生组织的定义)。症状持续时间超过24小时将脑梗塞与短暂性脑缺血发作(TIA)区分开来，后者的症状持续时间少于24小时。脑梗塞的症状包括偏瘫(身体一侧瘫痪)；轻偏瘫(身体一侧无力)；面部肌肉无力；麻木；感觉减退；嗅觉、味觉、听觉或视觉改变；嗅觉、味觉、听觉或视觉丧失；眼睑下垂(上睑下垂)；可察觉的眼肌无力；呕吐反射减少；吞咽能力下降；瞳孔对光的反应性降低；面部感觉下降；平衡下降(decreased balance)；眼球震颤；呼吸频率改变；心率改变；胸锁乳突肌无力(能力下降或不能将头转向一侧)；舌头无力；失语症(不能说话或理解语言)；失用症(随意运动改变)；视野缺陷；记忆减退；半忽略(hemineglect)或半侧空间忽略(hemispatial neglect)(对病灶对面视野一侧的空间注意不足)；思维混乱；意识错乱；性欲亢进姿势的发展(development of hypersexual gestures)；疾病失认症(持续否认存在缺陷)；行走困难；运动协调性改变；眩晕；不平衡；意识丧失；头痛；和/或呕吐。

技术人员将意识到“大脑”包括大脑皮层(或大脑半球的皮层)、基底神经节(或基底核)和边缘系统。

如本文所用，术语“梗塞”是指由脑梗塞过程直接损害的大脑区域或体积。

术语“大脑功能”包括：

推理、计划、词类、运动、情绪和问题解决(与额叶相关)；

运动、定向、识别、刺激感知(与顶叶相关)；

视觉处理(与枕叶相关)；以及

听觉刺激、记忆和言语的感知和识别(与颞叶相关)。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”应理解为足以减轻脑梗塞的一种或多种影响(例如运动功能降低)的富集了STRO-1

如本文所用，术语“低剂量”应理解为指少于1x10

如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”应理解为意指施用一定量的细胞(全身性的)并相对于未治疗的受试者中相应活动，响应于感觉输入增强刺激诱导的皮质活动(例如，初级皮质活动)。

如本文所用，术语“正常或健康个体”应理解为指未患过脑梗塞的受试者。

如本文所用，术语“STRO-1

如本文所用，涉及STRO-1

在本说明书中，术语“脑梗塞的影响”将被理解为包括增强皮质活动(例如，初级运动皮质活动)、增加梗塞体积内的皮质活动并且/或者减小梗塞体积中的一项或多项，并为其提供字面支持。

在一些实施方案中，待在本文所述方法中施用的富集了MLPSC的人细胞群来源于骨髓、牙髓、脂肪或多能干细胞。在一些实施方案中，人细胞群不来源于牙髓或脂肪。在一些实施方案中，人细胞群不来源于牙髓。在一些实施方案中，富含MLPSC的人细胞群富集了STRO-1

在一个实例中，STRO-1

在一个实例中，从获自人受试者(例如，待治疗的受试者或相关受试者或无关受试者)的样品中富集STRO-1

在一个实例中，从包含呈可选择形式的STRO-1

提及细胞或其群体的选择不需要是从特定的组织来源进行选择的。如本文所述，STRO-1

在一个实例中，细胞表达单独地或共同地选自TNAP

在一个实例中，细胞表达STRO-1

“单独地”意指本公开单独地包含所述标志物或标物的组，并且尽管单独的标志物或标志物的组可能没有在本文中单独列出，但所附权利要求可以单独以及彼此分开地限定这样的标志物或标志物的组。

“共同地”意指本公开涵盖任何数量或组合的所述标志物或肽组，并且尽管这样的数量或组合的标志物或标志物的组可能在本文中未被具体列出，但所附权利要求可以单独以及与标志物或标志物组的任何其他组合分开地限定这样的组合或子组合。

在一个实例中，STRO-1

例如，STRO-1

在一个实例中，间充质前体细胞是如WO 2004/85630中定义的血管周围间充质前体细胞。

对于给定标志物被称为“阳性”的细胞，其可以表达低(lo或dim)或高(亮，bri)水平的该标志物，这取决于该标记物在细胞表面存在的程度，其中该术语涉及荧光强度或细胞分选过程中使用的其它标志物。将在用于被分选的特定细胞群的标志物的上下文中理解lo(或暗淡(dim)或暗(dull))与bri的区别。对于给定的标志物被称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于该细胞中。该术语意味着该标志物由该细胞以相对非常低的水平表达，并且其在被可检测地标记时产生极低的信号，或者无法在背景水平(例如，使用同种型对照抗体检测到的水平)之上检测到。

当本文中使用时，术语“亮”是指细胞表面上当被可检测地标记时产生相对高的信号的标志物。虽然不希望受到理论的限制，但提出“亮”细胞比样品中的其它细胞表达更多的靶标志物蛋白(例如STRO-1识别的抗原)。例如，当用缀合有FITC的STRO-1抗体标记时，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析所测定的，STRO-1

如本文所用，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，该术语涵盖肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，本文所用的TNAP指的是能够结合由根据布达佩斯条约的规定于2005年12月19日在ATCC保藏的保藏号为PTA-7282的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。

此外，在本公开的一个实例中，STRO-1

在一个实例中，相当大比例的MLPSC，例如STRO-1

在另一个实例中，MLPSC，例如STRO-1

在一个实例中，细胞取自待治疗的受试者，使用标准技术体外培养扩增，并用于获得扩增的细胞，以作为自体或同种异体组合物的形式向受试者施用。在另一个实例中，使用一种或多种已建立的人细胞系的细胞。在一些实施方案中，通过多能干细胞例如人诱导多能干细胞(hiPSC)的分化获得MLPSC，例如细胞。参见例如Dayem等人(2019),InternationalJournal of Molecular Science,20(8):E1922。

在一些实施方案中，在亲代群体经过约2代、约3代、约4代、约5代、约6代、约7代、约8代、约9代或约10代后获得后代(扩增)细胞。然而，后代细胞可以在亲代群体中经过任何次数的传代后获得。

后代细胞可通过在任何合适的培养基中培养获得。术语“培养基”，当用于细胞培养时，包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气体或相和材料的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不能维持细胞生长的液体培养基。术语“培养基”也指旨在用于细胞培养的材料，即使其还没有与细胞接触。换句话说，为细菌培养而制备的营养丰富的液体是培养基。当与水或其它液体混合时变得适合细胞培养的粉末混合物可称为“粉末培养基”。

在一个实例中，通过使用标记有STRO-3抗体的磁珠从骨髓中分离或富集TNAP

在一些实施方案中，扩增的MLPSC可表达共同或单独地选自LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、3G5、CD49a/CD49b/CD29,CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD 90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R(STRO-2＝瘦素-R)、RANKL、STRO-4(HSP-90β)、STRO-1

WO 01/04268和WO 2004/085630中描述了用于制备一些MLPSC(例如STRO-1

例如，后代可从收获的、未扩增的、基本上纯化的STRO-1

STRO-1

应当理解，在实施本公开中描述的方法时，携带任何给定细胞表面标志物的细胞的分离可以通过多种不同的方法来实现，然而，示例性方法依赖于将结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与相关标志物结合，然后将表现出结合(可以是高水平结合或低水平结合或无结合)的那些分离。最方便的结合剂是抗体或基于抗体的分子，例如单克隆抗体或基于单克隆抗体(例如，包含其抗原结合片段的蛋白质)，因为后面这些试剂具有特异性。抗体可用于两个步骤，然而也可使用其它试剂，因此这些标志物的配体也可用于富集携带它们或缺乏它们的细胞。

可将抗体或配体附接在固体支持物上，以便进行粗分离。在一个实例中，分离技术最大限度地保留了待收集的级分的活力。可采用具有不同功效的各种技术来获得相对粗的分离。所采用的具体技术将取决于分离的效率、相关的细胞毒性、操作的简易性和速度，以及对复杂设备和/或技术技能的需要。分离程序可包括但不限于磁性分离、使用抗体包被的磁珠、亲和色谱和利用附接至固体基质的抗体的“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。进行FACS的方法对技术人员来说是显而易见的。

针对本文所述的每种标志物的抗体可商购获得(例如，针对STRO-1的单克隆抗体可从R&D Systems,USA商购获得)，可从ATCC或其它保藏组织获得，并且/或者可使用本领域公认的技术生产。

在一个实例中，分离STRO-1

在一些实施方案中，MLSC是间充质干细胞(MSC)。MSC可以是均质的组合物，也可以是富含MSC的混合细胞群。可通过培养粘附的骨髓或骨膜细胞获得均质的MSC组合物，并且可通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标志物来鉴定MSC。例如，在美国专利5,486,359中描述了使用塑料粘附技术获得富含MSC的细胞群的方法。通过常规塑料粘附分离制备的MSC依赖于CFU-F的非特异性塑料粘附特性。MSC的替代来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。

可在向受试者施用之前冷冻保存间充质谱系前体或干细胞。

一种用于获得MLPSC(例如，间充质干细胞)的方法还可包括在第一富集步骤之前使用已知技术收获细胞源。因此，将通过手术切取组织。然后将构成来源组织的细胞分离成所谓的单细胞悬液。这种分离可以通过物理和/或酶方法实现。

一旦获得了合适的MLPSC群体，就可以通过任何合适的方法进行培养或扩增。

在一些实施方案中，细胞取自待治疗的受试者，使用标准技术在体外培养，并用于获得扩增的细胞，以作为自体组合物向所述受试者施用，或者作为同种异体组合物向不同的受试者施用。

可在使用前储存可用于本发明方法的细胞。保存和储存真核细胞，特别是哺乳动物细胞的方法和方案是本领域已知的(参考，例如，Pollard,J.W.和Walker,J.M.(1997)Basic Cell Culture Protocols，第2版，Humana Press,Totowa,N.J.；Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells，第4版，Wiley-Liss,Hoboken,N.J.)。保持分离的干细胞诸如间充质干细胞/祖细胞或其后代的生物活性的任何方法都可与本公开组合使用。在一个实例中，通过使用低温保存来维持和储存所述细胞。

在一个实例中，对MLPSC和/或其后代细胞进行遗传修饰，例如以表达并且/或者分泌目标蛋白质。例如，对所述细胞进行工程化以表达可用于治疗运动障碍或脑梗塞的其它效应的蛋白质，诸如血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素、脑源性生长因子(BDNF)或胰岛素样生长因子(IGF-1)，如例如Larpthaveesarp等人(2015),Brain Science 5(2):165-177中所综述的。

对技术人员来说，遗传修饰细胞的方法是显而易见的。例如，要在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。例如，核酸连接至可在受试者的多种细胞中操作的启动子，例如病毒启动子，例如CMV启动子(例如，CMV-IE启动子)或SV-40启动子。其它合适的启动子在本领域是已知的，并且应被视为在细节上作必要的修改后适用于本公开的本实施例。

在一个实例中，核酸以表达构建体的形式提供。如本文所用，术语“表达构建体”是指在细胞中具有赋予与其可操作连接的核酸(例如报告基因和/或负选择报告基因)表达的能力的核酸。在本公开的说明书中，应当理解表达构建体可以包含或可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段，或能够以可表达的形式维持和/或复制异源DNA的其它核酸。

用于构建用于实施本公开的合适表达构建体的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且描述于例如Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience,ISBN 047 150338,1987)或Sambrook等人(Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,NewYork，第3版2001)中。例如，使用例如PCR从合适的模板核酸中扩增表达构建体的每个组分，随后将其克隆到合适的表达构建体(例如质粒或噬菌粒)中。

适用于这种表达构建体的载体是本领域已知的和/或本文中此描述的。例如，适用于在哺乳动物细胞中进行本发明方法的表达载体是例如由Invitrogen提供的pcDNA载体组的载体、pCI载体组的载体(Promega)、pCMV载体组的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体组的载体(Invitrogen)。

本领域技术人员将会知道额外的载体和此类载体的来源，例如LifeTechnologies Corporation、Clontech或Promega。

将分离的核酸分子或包含该核酸分子的基因构建体引入细胞进行表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定生物体的技术取决于已知的成功技术。将重组DNA引入细胞的方法包括显微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染(例如通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击(诸如通过使用DNA包被的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA))等等。

或者，本公开的表达构建体是病毒载体。合适的病毒载体在本领域是已知的，并且是商购可得的。用于递送核酸并将该核酸整合入宿主细胞基因组的常规基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体可用于将保持游离型的核酸引入宿主细胞。病毒载体是在靶细胞和组织中进行基因转移的高效和通用的方法。此外，在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

例如，逆转录病毒载体通常包含顺式作用的长末端重复序列(LTR)，其包装能力可容纳高达6-10kb的外源序列。最小的顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后所述载体用于将表达构建体整合到靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的载体(例如，参见Buchscher等人，J Virol.56:2731-2739(1992)；Johann等人，J.Virol.65:1635-1640(1992)；Sommerfelt等人，Virol.76:58-59(1990)；Wilson等人，J.Virol.63:274-2318(1989)；Miller等人，J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700；Miller和Rosman BioTechniques 7:980-990,1989；Miller,A.D.Human GeneTherapy 7:5-14,1990；Scarpa等人Virology 75:849-852,1991；Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:8033-8037,1993)。

也已开发了各种腺相关病毒(AAV)载体系统用于核酸递送。可使用本领域已知的技术容易地构建AAV载体。参见例如美国专利第5,173,414号和第5,139,941号；国际公布第WO 92/01070号和第WO 93/03769号；Lebkowski等人Molec.Cell.Biol.5:3988-3996,1988；Vincent等人(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；CarterCurrent Opinion in Biotechnology 5:533-539,1992；Muzyczka.Current Topics inMicrobiol,and Immunol.158:97-129,1992；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801,1994；Shelling和Smith Gene Therapy 7:165-169,1994；和Zhou等人J Exp.Med.179:1867-1875,1994。

用于递送本公开的表达构建体的其它病毒载体包括，例如，衍生自痘科病毒(诸如痘苗病毒和禽痘病毒)或α病毒的那些载体，或结合病毒载体(例如，在Fisher-Hoch等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 56:317-321,1989中描述的那些载体)。

在一些实施方案中，标记至少一部分待施用的细胞，以便于在其施用后对施用的标记细胞进行非侵入性检测、定位和/或追踪。在一些实施方案中，对细胞进行遗传修饰以表达可在体内被非侵入性检测的报告蛋白，例如单体远红色荧光蛋白。参见例如Wannier等人(2018),PNAS,115(48)E11294-E11301。在其它实施方案中，待施用的细胞通过非遗传手段，例如使用生命追踪标记物进行标记，可将所述生命追踪标记物引入至少一部分待施用的细胞的，随后在体内进行非侵入性检测。合适的跟踪标记物的一个实例是Molday ION

有各种已知的技术用于在非人动物受试者中诱导缺血性脑梗塞，诸如主动脉/腔静脉闭塞、外颈部压血带或袖带(external neck torniquet or cuff)、出血或低血压、颅内高压或颈总动脉闭塞、双血管闭塞(two-vessel occlusion)和低血压、四血管闭塞、单侧颈总动脉闭塞(仅在某些物种中)、内皮素-1诱导的动脉和静脉收缩、大脑中动脉闭塞、自发性脑梗塞(在自发性高血压大鼠中)、巨球栓塞(macrosphere embolization)、血凝块栓塞或微球栓塞。出血性脑梗塞可通过将胶原酶输注入大脑来模拟。

在一个实例中，脑梗塞模型包括大脑中动脉闭塞以产生缺血性脑梗塞。

为了测试群体和/或后代治疗脑梗塞影响的能力，在诱导脑梗塞后，例如在脑梗塞后1小时至1天内，施用该群体和/或后代。施用后，例如，在若干情况下，对大脑功能和/或运动障碍进行评估。

评估大脑功能和/或运动障碍的方法对本领域技术人员来说是显而易见的，包括例如转棒法(rotarod)、高架十字迷宫、旷场、Morris水迷宫、T迷宫(T-maze)、八臂迷宫、评估运动(例如，一段时间内覆盖的区域)、甩尾或De Ryck行为测试(De Ryck等人，Cerebralinfarction.20:1383-1390,1989)。另外的测试对于本领域技术人员来说是显而易见的并且/或者描述于本文中。同样，HIE的模型在本领域中是已知的。参见例如Millar等人(2017),Frontiers in Cellular Neuroscience,11(78):1-36。

在另一个实例中，通过成像技术观察施用的细胞对感觉刺激诱发的皮质活动、梗塞体积或梗塞范围内的皮质活性的影响。在一些优选实施方案中，磁共振成像(MRI)，特别是功能性MRI(fMRI)技术，诸如血氧水平依赖(BOD)成像，对于进行这种评估是有用的。PET和CT也可用来进行此类评估。

运动行为测定功能评估可单独地或与成像技术组合地用于评估本文所述的细胞组合物的治疗效果。此类行为测定包括但不限于肢体放置、转棒、网格行走(grid walking)和抬高的身体摆动。参见例如Schaar等人(2010),Experimental&Translational StrokeMedicine,2:13；和Borlongan等人(1995),Physiology&Behavior,58(5):909-917。

在本公开的一个实例中，以组合物的形式施用MLPSC，例如STRO-1

术语“载体”和“赋形剂”指的是本领域中常规用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质组合物(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mac Publishing Company(1980))。载体还可减少活性化合物的任何不希望的副作用。合适的载体例如是稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不会对受者产生显著的局部或全身副作用。

用于本公开的合适载体包括常规使用的那些，例如水、盐水、葡萄糖水溶液、乳糖、林格氏溶液、缓冲溶液、透明质酸和二醇类是示例性的液体载体，特别是(当等渗时)用于溶液。合适的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一个实例中，载体是例如细胞在其中生长或悬浮的培养基组合物。在一个实例中，这种培养基组合物不会对施用其的受试者产生任何不良影响。另外的实例包括冷冻保存介质，例如包含一种或多种冷冻保护剂诸如冷冻保护性多元醇(诸如二甲基亚砜(DMSO)、海藻糖或其组合)的生理介质。

示例性载体和赋形剂不会不利地影响细胞的活力和/或细胞减少、预防或延迟脑梗塞影响的能力。

在一个实例中，载体或赋形剂提供缓冲活性，以将细胞保持在合适的pH下，从而发挥生物活性，例如，载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表了有吸引力的载体或赋形剂，因为其与细胞和因子的相互作用最小，并且允许细胞和因子的快速释放，在这种情况下，本公开的组合物可以作为液体产生，用于例如通过注射直接施加至血流或施加到组织或组织周围或邻近的区域中。

可用于本文所述方法的细胞组合物可以单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。可与本公开的组合物结合施用的细胞包括但不限于其它多能或多潜能细胞或干细胞，或骨髓细胞。可将不同类型的细胞在施用前立即或不久与本公开的组合物混合，或者可将它们在施用前共同培养一段时间。

在一个实例中，该组合物包含有效量或者治疗或预防有效量的细胞。例如，该组合物包含约1x10

在一些实施方案中，对受试者全身施用低剂量的细胞。示例性剂量包括约0.1x10

在其它实施方案中，全身性给药基于梗塞的评估体积，例如约2x10

在本公开的一些实例中，在用细胞组合物开始治疗之前，可能没有必要或不希望对患者进行免疫抑制。因此，在一些情况下，可以耐受输注同种异体MLPSC，例如STRO-1

然而，在其它情况下，在开始细胞疗法和/或降低受试者对抗细胞组合物的免疫反应之前，可能需要或适宜对患者进行药理学免疫抑制。这可通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现。作为替代方案，可对细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。

可将MLPSC或其后代与其它有益药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其它药剂一起施用时，可将它们在单一药物组合物中一起施用，或者在分开的药物组合物中，与另一种药剂同时或依次施用(在另外的药剂施用之前或之后)。可以共施用的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如，EPO、EPO模拟体、TPO、IGF-1和IGF-II、HGF、胱天蛋白酶抑制剂)；抗炎剂(例如，p38 MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST、TRANILAST、REMICADE、SIROLIMUS和NSAID(非甾体抗炎药；例如，TEPOXALIN、TOLMETIN、SUPROFEN)；免疫抑制剂/免疫调节剂(例如，钙神经素抑制剂，诸如环孢菌素、他克莫司；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUS、EVEROLIMUS)；抗增殖药(例如，硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体诸如单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如巴西利昔单抗、达珠单抗)、多克隆抗T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如肝素、肝素衍生物、尿激酶)、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如，普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉剂。在一些实施方案中，待施用的细胞组合物包括抗炎剂。在其它实施方案中，待施用的细胞组合物包括溶栓剂。

在一些实施方案中，细胞组合物包含瞬时破坏血脑屏障(BBB)的药剂。在一些实施方案中，待施用的细胞组合物包含甘露醇。或者，在施用细胞组合物之前或之后不久，例如在约一小时内施用甘露醇。

在一些实施方案中，根据任何实例的本文所述的组合物包含用于改善大脑功能和/或再生大脑神经元和/或治疗运动功能障碍的因子，例如营养因子。

可选地或另外地，将本文根据任何实例所述的细胞和/或组合物与已知的脑梗塞效应治疗，例如物理疗法和/或言语疗法相结合。

在一个实例中，根据任何实例的本文所述的药物组合物包含用于治疗脑梗塞影响的化合物。或者，根据本公开的任何实例的本文所述的治疗/预防方法还包括施用用于治疗脑梗塞的影响的化合物。本文描述了示例性化合物，并且所述示例性化合物应被视为在细节上作必要修改后适用于本公开的这些实例。

在另一个实例中，根据任何实例的本文所述的组合物另外包含诱导或增强祖细胞分化为血管细胞的因子。示例性因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(VEGF；例如，PDGF-BB)和FGF。

本公开还提供了用于本文根据任何实例所述的方法的医疗装置，或者当用于所述方法时提供了医疗装置。例如，本公开提供了注射器或导管或其它合适的递送装置，其包含STRO-1

在一些实施方案中，待治疗的受试者患有缺血性脑梗塞。在特定实施方案中，待治疗的受试者是患有缺氧缺血性脑病的新生儿受试者。在其它实施方案中，脑梗塞是出血性脑梗塞。在一些优选实施方案中，待治疗的受试者是人受试者。

在优选实施方案中，全身性施用MLPSC，例如STRO-1

在优选实施方案中，MLPSC被例如肠胃外递送至受试者的血流中。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于动脉内、静脉内、腹膜内或鞘内途径。在一些优选实施方案中，富集了MLPSC或其后代的细胞群被动脉内递送至主动脉、心脏的心房或心室中。

在将细胞递送到心脏的心房或心室的情况下，可以将细胞施用到左心房或心室，以避免可能因将细胞快速递送到肺部而引起的并发症。

在一个实施方案中，将该群体施用到颈动脉中。

选择治疗制剂的施用方案取决于几个因素，包括实体的血清或组织周转率、症状水平和实体的免疫原性。

在一个实例中，MLPSC或其后代以单次推注剂量递送。或者，STRO-1

在一些实施方案中，在脑梗塞后约24小时或更短时间内，例如在约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、12小时、16小时、18小时或约1小时至约24小时中的另一时间，全身性施用本文所述的细胞组合物(例如富集了MLPSC、例如STRO-1

在一些实施方案中，如本文中所述，在向受试者施用适当地标记用于体内检测的细胞后，在施用标记细胞后约6小时至1个月，例如在12小时、24小时、2天、3天、4天、1周、2周、3周、4周、6周、7周或约6小时至约2个月中的另一个时间点，测定受试者在1个或多个时间点上的体内细胞分布。

在一些实施方案中，施用后，在至少12小时至6个月，例如18小时、1天、2天、3天、4天、1周、2周、3周、4周、2个月、3个月、4个月、5个月或约12小时至约6个月的一段时间内或约12小时至约6个月的另一段时间内，测定接受治疗的受试者的梗塞体积和/或梗塞活动的变化。梗塞体积和/或梗塞范围内的活性可以用本领域已知的许多方法(例如，用于体积测定的非增强头部计算机断层扫描(NCCT)和梗塞区内的血氧水平依赖(BOLD)信号的fMRI和分析)中的任一种来测定。

本公开包括以下非限制性实施例。

实施例

动物、居住和饮食

84只250g至275g的雄性裸鼠(RNU鼠，Taconic,IBU051001C)手术前7-10天抵达。在整个研究过程中，它们被允许自由获取食物和水。用尾巴上的永久标志物给动物分配连续的标识号。手术前一天观察了这些动物，那些看起来健康状况不佳的动物被排除在研究之外。

动物被安置在温度为21±2℃、相对湿度为50％±20％的过滤空气的房间里。房间里有自动计时器，亮/暗周期为12小时亮、12小时暗，没有微光。

在手术前后每个笼子里关两只动物，除非表现出严重的攻击或伤害，或者笼子里的同伴死亡，在这种情况下，将动物单独关起来。

学习设计

动物准备

72只如上所述的成年雄性裸鼠用于研究。为了适应环境，在手术前七天，所有的大鼠都被关起并处理以进行行为评估。在处理期结束时，大鼠被随机分配到不同的组。

手术准备

中部大脑动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)，Tamura模型

使用Tamura等人的方法的改进，通过永久闭塞近端右侧中部大脑动脉(middlecerebral artery，MCA)产生局灶性脑梗死。雄性裸鼠(手术时为250-350g)用于N

给药

细胞(hMPC,TAN 2178,批号2011CC043)和载体(Cryomedia,批号2012CC034)由干式托运人从赞助商处发送，并储存在液氮蒸气相中。冷冻保存的hPMC在即将注射前按照以下方案解冻。MCAO后6小时、12小时、24小时、48小时或7天，通过尾静脉注射施用hMPC(1x10

随机化和盲法

使用可在www.graphpad.com/quickcalcs/randomize2.cfm在线获得的quickcalcs，将在24小时时接受治疗的动物被随机分配接受细胞或媒介物。以将治疗均等地分配到手术日，并最大化可从单个小瓶的解冻细胞中施用细胞的动物数量的方式将另外的动物分配到处理组。同一个研究者进行了所有的动物手术和行为评估，并且不知道每只动物的研究时间表和处理分配。

行为测试

使用肢体放置和身体摆动行为测试评估功能活动。这些测试在MCAO前一天(第-1天)、MCAO(第0天＝MCAO的当天)后1天(第1天)和3天(第3天)、7天(第7天)、14天(第14天)、21天(第21天)和28天(第28天)进行。

1.肢体放置

肢体放置测试分为前肢和后肢测试。在前肢放置测试中，检查者将大鼠放在靠近桌面的地方，并对大鼠响应于触须、视觉、触觉或本体感受刺激而将前肢放置在桌面上能力进行评分。类似地，对于后肢放置测试，检查者评估了大鼠响应触觉和本体感受刺激而将后肢放置在桌面上的能力。针对每种感觉输入模式获得单独的子分数(可能指定为半分)，并相加得出总分数(前肢放置测试：0＝正常，12＝最大程度受损；对于后肢放置测试：0＝正常；6＝最大程度受损)。

2.身体摆动测试

大鼠被放在其离尾巴底部大约一英寸的地方。然后，其被提升到离桌子表面一英寸的高度。大鼠被固定在垂直轴上，定义为向左侧或右侧不超过10°。每当大鼠将其头移出垂直轴向两边时，就记录到一次摆动。大鼠必须回到垂直位置，以便计数下一次摆动。总共计数了三十(30)次摆动。一只正常的大鼠通常向两侧摆动相同的次数。局灶性缺血后，大鼠倾向于向对侧(左侧)摆动。

处死

在MCAO后28天，将大鼠腹腔内用氯胺酮(50-100mg/kg)和赛拉嗪(5-10mg/kg)混合物深度麻醉。然后用生理盐水(2单位/ml肝素)经心脏灌注大鼠，接着用10％福尔马林灌注。取出大脑并储存在10％福尔马林中。大脑被送到HistoTechnologies,Inc.，并进行梗塞体积测量(H&E染色)。

数据分析

所有数据均以平均值±S.E.M表示。行为和体重数据通过重复测量ANOVA(处理X时间)进行分析。包括所有组在内的总体ANOVA的F-统计的正p值使得组间ANOVA成对进行。

在图1至图3中：*＝与媒介物处理组不同，p<0.05；

**＝与媒介物处理组不同，p<0.01；

*＊*＝与媒介物处理组不同，p<0.001；

对于行为测试，中风前一天，第-1天，被故意排除在分析之外，以确保数据的正态分布。

结果

如图1所示，与接受媒介物施用的动物相比，在MCAO后6小时(p<0.01)、12小时(p<0.01)、24小时(p<0.001)、48小时(p<0.01)和7天(p<0.01)施用hMPC显著改善了前肢恢复。如图2所示，与媒介物施用相比，在MCAO后6小时(p<0.001)、12小时(p<0.01)、24小时(p<0.001)和48小时(p<0.001)施用hMPC显著改善了后肢恢复。与媒介物施用相比，在MCAO后6小时(p<0.05)、12小时(p<0.05)、48小时(p<0.01)和7天(p<0.01)施用hMPC显著改善了身体摆动恢复(图3)。MPC处理组与媒介物组之间的体重没有显著差异(图4)。

梗塞模型

将动物在诱导室内用于N

通过钻孔和骨钳(颞下骨瓣切除术)取出一小块骨，露出MCA。使用解剖显微镜，切开硬脑膜，使用微双极电烙术，将MCA从嗅束近端电凝至大脑下静脉来永久性闭塞(注意不要使该静脉破裂)。然后横断MCA。然后使颞肌复位，并用缝线在皮下闭合切口。皮肤切口用手术钉(需要2-3个)封闭。手术后，动物待在加热垫上，直到从麻醉恢复。然后将他们送回干净的笼子里。在MCAO手术当天(第0天)频繁观察它们，此后每天观察至少一次，直至第8天被转移到Ekam Imaging,Inc.进行成像。所有成像分析都是在没有任何处理信息的情况下盲测完成的。完成图像分析后，将代码解盲。

成像方案-功能性磁共振成像(Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI)

Rowlett裸(RNU)大鼠获自Taconic。第8天运输时提供了动物健康证明。在成像的每一天(第15天)，将动物运送到气候控制车辆中的成像设施。总共研究了两组，盲标为A组和B组(n＝9/组)。另外，包括未接受手术的两只动物，并在第一个成像日进行成像，并用作正常对照进行比较。

使用了Bruker Biospec 7.0T/20-cm USR水平磁体(Bruker，Billerica，MAU.S.A)和20-G/cm磁场梯度插件(ID＝12cm)进行成像研究，上升时间为120-μs(Bruker)。射频信号通过内置于动物约束器中的四线圈电子设备发送和接收。将所有动物麻醉并置于限制器中进行成像，获得以下解剖和功能扫描。

1)飞行员扫描(RARE三联扫描)

2)全脑T2加权参考解剖扫描(T2 weighted reference anatomy scan of wholebrain)。(22张切片；1.2mm；FOV 3cm

3)fMRI(96x96x22,T2加权快速采集与重聚焦回波(RARE)图像；电刺激引起脚休克，0.6mA，基线3分钟，然后在左后爪上刺激3分钟，接着再基线3分钟，然后在左前爪上刺激3分钟。也就是说，刺激施加到中风对侧的爪子(和对照上的匹配爪子)。

4)fMRI(96x96x22,T2加权RARE图像；10％CO2挑战)。

成像实验方案和设置的示意性概述示于图5和图6中。在成像过程中，使用多动物监测和门控系统(SAII,Stony Brook,NY)监测呼吸。

图像分析

该研究由六种不同的磁共振成像模式，因此使用了各种软件和平台来分析数据。将数据以由数字/图像和表格(其中报告了数字)组成的文件格式进行汇编。

使用内部软件MIVA对功能性MR图像(fMRI)进行分析，其中每个受试者被登记到分割的大鼠脑图谱(Ekam Imaging)。交互式图形用户界面促进了比对过程。使用逆变换矩阵建立复合统计量。将每个复合像素位置(即行、列和切片)预先乘以[T

每个区域的时间历程图的复合百分比变化基于每个受试者的加权平均值，如下所示：

其中N是受试者的数量。

组织样本收集

在MCAO后第8天，在成像后，用CO

结果

梗塞体积

图7显示了第8天MRI时梗塞体积的测量值(平均值±SEM)(上图)，以及梗塞体积占整个大脑的百分比(下图)。与媒介物处理组相比，MPC处理组具有统计学上更小的梗死体积(p<0.05)。另外，MPC处理组中梗死体积占全脑的百分比明显较小(p<0.05)。

爪子刺激引起的皮质激活

图8显示了在与梗塞同侧的初级和次级运动皮层以及初级和次级体感皮层中，在媒介物和hMPC处理组中，由于梗塞对侧的前爪刺激导致的通过BOLD成像显示的激活。如图8(上图)所示，hMPC处理组的初级皮层(但非次级运动皮层)中的激活体积明显更高。各组间体感皮层的激活没有显著差异(下图)。同样，没有观察到梗塞对侧的运动或体感皮层激活的差异(数据未显示)。

缺血核心和半暗带中神经元活动的fMRI分析

对于事后图像分析，解剖扫描用于识别缺血区域。梗塞对侧前爪刺激后测量fMRI激活。在MPC处理的动物中，活化体积明显更大(图9)。