环异麦芽四糖、环异麦芽四糖生成酶和它们的制造方法以及用途

摘要

本发明的课题在于提供一种以D‑葡萄糖为构成糖的新型环状糖类、和生成该环状糖类的新型酶、它们的制造方法以及用途，本发明通过提供环异麦芽四糖、环异麦芽四糖生成酶、编码该酶的DNA、及它们的制造方法以及用途来解决上述课题，其中所述环异麦芽四糖具有四分子的D‑葡萄糖介由α‑1,6葡糖苷键以环状连接的结构。

说明书

技术领域

本发明涉及以D-葡萄糖为构成糖的新型环状糖类、生成该环状糖类的新型酶、它们的制造方法以及用途。

背景技术

在糖类领域中，已知有将以淀粉或淀粉的部分分解产物等D-葡萄糖为构成糖的α-1,4葡聚糖作为原料通过酶反应而制造的各种环状糖类。非专利文献1中公开了α-、β-或γ-环糊精，其为通过使马卡龙淀粉酶(macerans amylase)作用于淀粉而得到的、六至八分子的D-葡萄糖介由α-1,4糖苷键而形成环状结构的糖类。目前，这些环糊精可以由淀粉以工业规模生产，并可用于有效利用其为非还原性、无味、具有包合能力等各种特性的用途。另外，专利文献1中公开了一种通过使α-异麦芽糖基葡萄糖基糖类生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉或其部分分解产物而得到的环状四糖，所述环状四糖具有四分子的葡萄糖以α-1,3葡糖苷键和α-1,6葡糖苷键交替键合的环状结构，即，环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}的结构。进而，专利文献2中公开了一种通过使环状麦芽糖生成酶作用于淀粉或其部分分解产物而得到的环状四糖(别名，环状麦芽糖基麦芽麦芽糖)，所述环状四糖具有四分子的葡萄糖以α-1,4葡糖苷键和α-1,6葡糖苷键交替键合的环状结构，即，环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}的结构。另外，进一步地，专利文献3中公开了环状五糖(异环麦芽五糖)和环状六糖(异环麦芽六糖)，其中，所述环状五糖是麦芽五糖分子的还原性末端葡萄糖的1-位和非还原性末端葡萄糖的6-位羟基通过α-1,6葡糖苷键合而形成环状结构，所述环状六糖是麦芽六糖分子的还原性末端葡萄糖的1-位和非还原性末端葡萄糖的6-位羟基通过α-1,6葡糖苷键合而形成环状结构。这些环状糖类因具有环状结构而具有包容能力，且显现出稳定挥发性有机物的作用，并且，由于这些环状糖类为非还原性的糖类，因此，它们可以利用、加工而不会发生氨基羰基反应，不担心褐变、劣化，因此，可有效利用各种特性而用于或可期待用于各个领域。

另一方面，作为以D-葡萄糖为构成糖的另一种α-葡聚糖，已知有D-葡聚糖介由α-1,6葡糖苷键以链状连接的以α-1,6葡聚糖为基本结构的右旋糖酐，作为以右旋糖酐为原料通过酶反应而得到的环状糖类，报道有环异麦芽低聚糖(也称为“环状异麦芽低聚糖”、“环右旋糖酐”)。专利文献4、非专利文献2中公开了使源于芽孢杆菌(Bacillus)属微生物的酶作用于右旋糖酐而得到的环异麦芽七糖(CI-7)、环异麦芽八糖(CI-8)或环异麦芽九糖(CI-9)，这些环状糖类为七至九分子的D-葡萄糖介由α-1,6葡糖苷键而形成环状结构的糖类。另外，专利文献5、非专利文献3中公开了葡萄糖聚合度更大为10至16的CI-10～CI-16，专利文献6中公开了葡萄糖聚合度更大为13至33的CI-13～CI-33。然而，葡萄糖聚合度小于7的环异麦芽低聚糖还完全不为人所知。

如果能提供上述糖类以外的以D-葡萄糖为构成糖的环状糖类，则可期待应用于更多种用途。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2001/90338A1号小册子

专利文献2：国际公开WO2005/21564A1号小册子

专利文献3：国际公开WO2006/35725A1号小册子

专利文献4：日本特开平6-197783号公报

专利文献5：日本特开2004-166624号公报

专利文件6：日本特开2005-192510号公报

非专利文献

非专利文献1：美国化学会志(Journal of American Chemical Society)，美国，1949年，第71卷，第353-358页

非专利文献2：生物科学·生物技术·生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)第57卷，第1225-1227页(1993年)

非专利文献3：生物科学·生物技术·生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)第72卷，第3277-3280页(2008年)

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于提供一种以D-葡萄糖为构成糖的新型环状糖类、生成该环状糖类的新型酶、它们的制造方法以及用途。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人等期待由以α-1,6葡聚糖为基本结构的右旋糖酐或其部分分解产物生成新型环状糖类的全新的酶，从而广泛地检索了产生这种酶的微生物，其中，所述α-1,6葡聚糖为D-葡萄糖介由α-1,6葡糖苷键以直链状连接的葡萄糖聚合物。

其结果发现，从土壤中新分离出来的属于阿格雷氏属的微生物D1110菌株或属于微杆菌属的微生物D2006菌株产生新型酶，且通过该新型酶的作用，可由α-1,6葡聚糖或以α-1,6葡聚糖为基本结构的右旋糖酐或其部分分解产物大量生成新型糖类、环异麦芽四糖，所述新型糖类、环异麦芽四糖具有四分子的D-葡萄糖介由α-1,6葡糖苷键(以下，在本说明书中有时简称为“α-1,6键”)以环状连接的结构。

另外，本发明人等对具有生成该环异麦芽四糖的新型酶的产生能力的微生物进行了培养，由培养物纯化了环异麦芽四糖生成酶，揭示了其各种性质，并且确立了其制造方法，另外，确立了编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA及转化体，进而，确立了使用有该酶的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类的制造方法以及用途，从而完成了本发明。

即，本发明通过提供具有四分子的D-葡萄糖介由α-1,6葡糖苷键以环状连接的结构的新型糖类即环异麦芽四糖、生成该糖类的新型环异麦芽四糖生成酶、编码该酶的DNA和包含该DNA的重组DNA及转化体、它们的制造方法、以及包含环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类的食品饮料、奢侈品、饲料、饵料、化妆品、药品、工业用品等的组合物来解决上述课题。

发明的效果

根据本发明，可以供给以往未知的新型环状糖类即环异麦芽四糖、或含环异麦芽四糖的糖类，可以用于以食品饮料、化妆品、药品为代表的各个领域。

附图说明

[图1]图1是使源于微生物菌株D1110的粗制酶液作用于右旋糖酐底物而得到的酶反应物的TLC色谱图。

[图2]图2是未知糖类I纯化制备物的HPLC色谱图。

[图3]图3是未知糖类I纯化制备物的

[图4]图4是未知糖类I纯化制备物的

[图5]图5是未知糖类I纯化制备物的

[图6]图6是未知糖类I纯化制备物的HSQC谱图。

[图7]图7是未知糖类I纯化制备物的HMBC谱图。

[图8]图8是表示本发明的环异麦芽四糖的结构的图。

[图9]图9是环异麦芽四糖结晶的显微镜照片(放大倍数为400倍)。

[图10]图10是五水环异麦芽四糖结晶的粉末X射线衍射图。

[图11]图11是表示源于阿格雷氏菌种D1110的环异麦芽四糖生成酶的最适温度的图。

[图12]图12是表示源于阿格雷氏菌种D1110的环异麦芽四糖生成酶的最适pH的图。

[图13]图13是表示源于阿格雷氏菌种D1110的环异麦芽四糖生成酶的热稳定性的图。

[图14]图14是表示源于阿格雷氏菌种D1110的环异麦芽四糖生成酶的pH稳定性的图。

[图15]图15是表示源自解单端孢菌素微杆菌D2006的环异麦芽四糖生成酶的最适温度的图。

[图16]图16是表示源于解单端孢菌素微杆菌D2006的环异麦芽四糖生成酶的最适pH的图。

[图17]图17是表示源于解单端孢菌素微杆菌D2006的环异麦芽四糖生成酶的热稳定性的图。

[图18]图18是表示源于解单端孢菌素微杆菌D2006的环异麦芽四糖生成酶的pH稳定性的图。

[图19]图19是表示分别编码阿格雷氏菌种D1110及解单端孢菌素微杆菌D2006的环异麦芽四糖生成酶基因、ORF9038及ORF5328的氨基酸序列的同源性的图。

[图20]图20是表示重组DNA、pRSET A-ORF9038的图。图中，黑色粗线所示的部分为编码源于阿格雷氏菌种D1110的环异麦芽四糖生成酶的DNA。

[图21]图21是使细胞提取物的上清液作用于底物右旋糖酐而得到的反应液的HPLC色谱图，其中所述细胞提取物是通过培养具有重组DNA、pRSET A-ORF9038的重组大肠杆菌E9038而制备的。

[图22]图22是含环异麦芽四糖的葡萄糖基衍生物的糖类的HPLC色谱图，所述环异麦芽四糖的葡萄糖基衍生物是通过如下操作而得到的：通过以环异麦芽四糖为受体、α-环糊精为糖供体的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶的糖转移反应而得到反应物，对该反应物进行葡糖淀粉酶处理、碱处理。

[图23]图23是表示环异麦芽四糖的两种葡糖基衍生物的结构的图。

具体实施方式

本发明涉及一种作为新型环状糖类的环异麦芽四糖。本发明的环异麦芽四糖是指具有四分子的D-葡萄糖介由α-1,6葡糖苷键以环状连接的结构、即环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}的结构的环状葡萄糖四糖(参见图8)。

本发明的环异麦芽四糖是一种以往未知的新型糖类，本发明人等由土壤得到的微生物的培养液作为粗酶剂，使其作用于底物右旋糖酐，在由此得到的反应液中首次发现了它的生成，只要具有上述结构，无论其来源、制造方法，均包括在本发明中。

另外，作为另一个实施方式，本发明的环异麦芽四糖包括其结晶形态。本发明的环异麦芽四糖的结晶通常呈五水合物结晶的形态。

在本发明的环异麦芽四糖的五水合物结晶的粉末X射线衍射图中，在衍射角(2θ)9.0°、9.8°、11.8°、13.1°和19.1°处具有特征衍射峰。

作为另一个实施方式，本发明包括含环异麦芽四糖的糖类，其包含环异麦芽四糖及/或环异麦芽四糖的结晶以及其他糖类。含环异麦芽四糖的糖类的形态可以是糖浆、粉末、含结晶的粉末或固体中的任一种。

作为另一个实施方式，本发明包括环异麦芽四糖的葡糖基衍生物，其具有一分子或两分子的D-葡萄糖键合于环异麦芽四糖的结构。对该葡萄糖基衍生物中的D-葡萄糖与环异麦芽四糖的键合方式没有特别限制，可以是α-1,2键、α-1,3键或α-1,4键中的任一种。一分子的D-葡萄糖介由α-1,3键键合于构成环异麦芽四糖的四个葡萄糖残基的内1残基的葡糖基衍生物，微量存在于后述的基于酶的环异麦芽四糖生成反应的反应液中。另外，如后述的实施例所示例，也可以以环异麦芽四糖为受体、在适当的糖供体的存在下进行使适当的糖转移酶作用的糖转移反应、以及糖转移产物的酶分解，从而生成并收集环异麦芽四糖的葡糖基衍生物。作为糖转移酶，例如，可以使用α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、环麦芽糊精葡聚糖转移酶(CGTase)等。在糖转移产物的酶分解中，例如，可以使用葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶等。进而，通过选择糖供体和糖转移酶，也可以有效地实施生成并收集使D-葡萄糖以外的糖转移至环异麦芽四糖而得到的环异麦芽四糖的葡糖基衍生物，例如果糖基衍生物、半乳糖基衍生物等。

本发明的环异麦芽四糖生成酶，是指作用于葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或右旋糖酐的部分分解产物并催化生成环异麦芽四糖的反应的所有酶。催化上述反应的酶没有其来源、形式、粗酶或纯化酶的区别，另外不拘泥于作用于葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或其部分分解产物并生成环异麦芽四糖的反应的机理，都包括在本发明的环异麦芽四糖生成酶中。在本发明的环异麦芽四糖生成酶的一个例子中，可推测在使其作用于右旋糖酐时，在异麦芽四糖单元中切断α-1,6键，通过将该异麦芽四糖的还原末端葡萄糖的1位α-1,6转移至同一分子的非还原末端葡萄糖的6位羟基的分子内转移反应进行环化而生成环状异麦芽四糖。需要说明的是，在本发明的环异麦芽四糖生成酶的一个优选例中，还具有通过进一步作用于暂时生成的环异麦芽四糖来进行水解而打开环状结构并生成异麦芽四糖的活性。

本发明的环异麦芽四糖生成酶的酶活性可以如下操作来进行测定。使作为底物的右旋糖酐或右旋糖酐的部分分解产物溶解于20mM乙酸缓冲液(pH6.0)中以使其浓度为1.11w/v％，从而形成底物溶液。在该底物溶液0.9mL中，加入用20mM乙酸缓冲液(pH6.0)制备的酶液0.1mL，在40℃下开始反应，在反应0.5分钟和反应30.5分钟的时刻，分别取样0.4mL反应液，并在100℃的热水浴中加热10分钟，从而使酶失活而停止反应，然后，用后述的实验1中记载的HPLC对各个反应液中的环异麦芽四糖的量进行定量。通过从30.5分钟的时刻的环异麦芽四糖量中减去0.5分钟的时刻的环异麦芽四糖量，计算出反应30分钟所生成的环异麦芽四糖量。1单位环异麦芽四糖生成酶的活性(U)定义为在上述条件下1分钟生成1微摩尔环异麦芽四糖的酶量。

作为本发明的环异麦芽四糖生成酶的具体例，例如，可举出具有下述物理化学性质的环异麦芽四糖生成酶。

(1)分子量

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，分子量为86,000±10,000道尔顿；

(2)最适温度

在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度为35℃至40℃；

(3)最适pH

在40℃、反应30分钟的条件下，pH为5.5至6.0；

(4)热稳定性

在pH6.0、保持各温度30分钟的条件下，至40℃稳定；

(5)pH稳定性

在4℃、保持16小时的条件下，在pH为5.0至10.0稳定。

作为本发明的环异麦芽四糖生成酶的另一个具体例，例如，可举出具有下述物理化学性质的环异麦芽四糖生成酶。

(1)分子量

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，分子量为86,000±10,000道尔顿；

(2)最适温度

在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度为40℃；

(3)最适pH

在40℃、反应30分钟的条件下，最适pH为5.5左右；

(4)热稳定性

在pH6.0、保持各温度30分钟的条件下，至35℃稳定；

(5)pH稳定性

在4℃、保持18小时的条件下，在pH为5.0至7.0稳定。

另外，具有上述物理化学性质的本发明的环异麦芽四糖生成酶有时具有序列表中的序列编号5或6所示的氨基酸序列作为其N末端氨基酸序列。

然而，具有上述物理化学性质或N末端氨基酸序列的环异麦芽四糖生成酶只是一个例子，不言而喻，只要生成环异麦芽四糖，具有与上述不同的物理化学性质或N末端氨基酸序列的酶也包括在本发明的环异麦芽四糖生成酶中。

本发明的环异麦芽四糖生成酶通常具有规定的氨基酸序列，作为其一个例子，例如，可举出序列表中的序列编号7或8所示的氨基酸序列或与其同源的氨基酸序列。作为具有与序列表中的序列编号7或8所示的氨基酸序列同源的氨基酸序列的变异体酶，可举出：在保持作用于右旋糖酐或其部分分解产物并生成环异麦芽四糖的酶活性的范围内，具有序列编号7或8所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或两个以上氨基酸的氨基酸序列的酶，具有相对于序列编号7或8所示的氨基酸序列而言具有通常70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上的同源性的氨基酸序列的酶是合适的。

虽然本发明的环异麦芽四糖生成酶不受其来源的限制，但可举出微生物作为优选的来源。特别优选使用本发明人等从土壤中分离出来的微生物D1110菌株或其变异菌株或同样从土壤中分离出来的微生物D2006菌株或其变异菌株。作为在此提及的变异菌株，例如，可举出：通过人工引入变异，与亲本菌株相比，培养特性得到改善的变异菌株；与亲本菌株相比，环异麦芽四糖生成酶的产生能力得到提高的酶高产变异菌株；产生环异麦芽四糖生成酶的活性更高的变异菌株等。

如上所述，具有环异麦芽四糖生成酶产生能力的微生物D1110菌株和D2006菌株是本发明人等从土壤中新分离出来的微生物，但如后述的实验4记载，基于16S rRNA(16SrDNA)的碱基序列，研究其与已知菌的碱基序列的同源性，进行菌种的鉴定，结果将微生物D1110菌株鉴定为阿格雷氏菌种(Agreia sp.)，另外，将微生物D2006菌株鉴定为解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)。基于这些结果，本发明人等将微生物D1110菌株和D2006菌株分别命名为新型微生物阿格雷氏菌种D1110和解单端孢菌素微杆菌D2006，并于2018年12月28日将其寄存在位于日本千叶县木更津市风坂町2-5-6的独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)专利微生物寄存中心(NPMD)，并分别以委托号NITEBP-02815和NITE BP-02816委托。

本发明的具有环异麦芽四糖生成酶产生能力的微生物不仅包括上述菌株，还包括其变异菌株，以及本说明书中使用的、通过使作为粗酶液的培养液作用于底物右旋糖酐并调查环异麦芽四糖的生成的筛选方法从自然界中分离、选拔的属于其他属、种的具有环异麦芽四糖生成酶产生能力的微生物以及它们的变异菌株等。

本发明还涉及具有编码前述的本发明的环异麦芽四糖生成酶的氨基酸序列的完整碱基序列和与该碱基序列互补的完整碱基序列的DNA。本发明的DNA只要具有编码环异麦芽四糖生成酶的氨基酸序列的碱基序列即可，可以是天然来源的，也可以是人工合成的。作为天然来源，例如，可举出：包括阿格雷氏菌种D1110的阿格雷氏菌属微生物、包括解单端孢菌素微杆菌D2006的微杆菌属微生物等，可以由这些菌体得到含有本发明的DNA的基因组DNA。即，将上述微生物接种于营养培养基中，在有氧条件下培养约5至10天，然后从培养物中采集菌体，并用溶菌酶或β-葡聚糖酶等细胞壁溶解酶或超声波进行处理，从而使含有该DNA的基因组DNA溶出至菌体外。此时，可以并用蛋白酶等蛋白质分解酶或使SDS等表面活性剂共存来进行冻融。对于如此得到的处理物，只要应用例如苯酚萃取、醇沉淀、离心分离、核糖核酸酶处理等常规方法，则可得到目标基因组DNA。在人工合成本发明的DNA时，例如，只要基于并记于序列表中的序列编号9或10所示的碱基序列的氨基酸序列进行化学合成即可。另外，也可以有效地实施以含有该DNA的基因组DNA为模板、使用作为合适的引物的化学合成DNA来进行PCR合成。

作为本发明的DNA的一个例子，可举出具有序列表中的序列编号9或10所示的碱基序列、或与这些碱基序列同源的碱基序列、以及与这些碱基序列互补的碱基序列的DNA。作为具有与序列表中的序列编号9或10所示的碱基序列同源碱基序列的DNA，可举出：在保持所编码的环异戊四醇生成酶的活性的范围内，具有序列编号9或10所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个以上碱基的碱基序列的DNA，具有相对于序列编号9或10所示的碱基序列而言具有通常70％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上、更进一步优选95％以上的同源性(序列一致性)的碱基序列的DNA是合适的。另外，在编码这些环异麦芽四糖生成酶的DNA中，基于遗传密码的简并性将一个或两个以上碱基取代成其他碱基而不改变分别进行编码的环异麦芽四糖生成酶的氨基酸序列的DNA、以及具有与它们互补的碱基序列的DNA也包括在本发明的DNA中。

可以有效地实施将本发明的DNA插入能自主复制的适当的载体中而形成重组DNA。重组DNA通常由DNA和能自主复制的载体构成，如果能得到DNA，则能够比较容易地通过常规方法的重组DNA技术来制备重组DNA。作为这种载体的例子，可以使用质粒、噬菌体或粘粒等，可以根据要引入的细胞或引入方法来适当选择。对载体的具体种类没有特别限制，适当选择在宿主细胞中能表达的载体即可。根据宿主细胞的种类，选择适当启动子序列以可靠地表达上述基因，并将其和上述基因纳入各种质粒等的载体用作表达载体即可。作为这样的表达载体，例如，可以利用：噬菌体载体、质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体、染色体载体、附加型载体和源于病毒的载体(例如，细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒(例如，杆状病毒、乳多空病毒、痘苗病毒、腺病毒、痘病毒、伪狂犬病毒、疱疹病毒、慢病毒和逆转录病毒))以及源于它们的组合的载体(例如，粘粒和噬菌体)。

作为用于细菌的优选载体，例如，可举出：pRSET A、pQE-70、pQE-60、pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH6a、pNH18A和pNH46A；以及ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5等。另外，作为用于真核生物的优选载体，例如，可举出：pWLNE0、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL等。

在将本发明的DNA插入上述载体时，通常可采用本领域的常规方法。具体而言，首先，通过限制性酶和/或超声波将含有目标DNA的基因DNA和能自主复制的载体切断，然后，将生成的DNA片段和载体片段连接。如此得到的重组DNA引入适当的宿主而形成转化体，通过对其进行培养可以无限地进行复制。

如上所述得到的重组DNA可以引入以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母菌为代表的适当的宿主微生物中。为了得到转化体，可应用菌落杂交法，或选择在营养培养基中培养并产生环异麦芽四糖生成酶的微生物。

用于培养本发明的包含具有环异麦芽四糖生成酶产生能力的转化体的微生物的培养基，只要是能孵育微生物、能产生环异麦芽四糖生成酶的营养培养基即可，可以是合成培养基和天然培养基中的任一种。作为碳源，只要是能用于孵育微生物的物质即可，例如，可以使用：右旋糖酐或其部分分解产物、源于植物的淀粉或植物糖原、源于动物或微生物的糖原或支链淀粉，另外这些物质的部分分解产物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、糖蜜等糖类，以及柠檬酸、琥珀酸等有机酸。可以根据碳源的种类适当选择培养基中这些碳源的浓度。作为氮源，例如可以适当使用：铵盐、硝酸盐等无机氮化合物，以及例如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物等有机含氮物。另外，作为无机成分，例如可以适当使用：钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐等盐类。进而，根据需要也可以适当使用氨基酸、维生素等。

通常在选自温度为15℃至37℃、pH为5.5至10的范围、优选温度为20℃至34℃、pH为5.5至8.5的范围的条件下进行有氧培养。培养时间只要是该微生物能够繁殖的时间即可，优选为10小时至150小时。另外，对培养条件中的培养液的溶解氧浓度没有特别限制，通常优选为0.5ppm至20ppm。因此，可适当采用调节通气量或进行搅拌等方法。另外，培养方式可以是分批培养或连续培养中的任一种。

在如此培养微生物后，回收含有本发明的酶的培养物。环异麦芽四糖生成酶活性主要在培养物的灭菌液中观察，可以收集灭菌液作为粗酶液，也可以将整个培养物用作粗酶液。可采用已知的固液分离方法从培养物中去除菌体。例如，可适当采用：对培养物自身进行离心分离的方法、或者使用预涂过滤器等进行过滤分离的方法、通过平膜、中空纤维膜等的膜过滤进行分离的方法等。虽然可以将灭菌液直接用作粗酶液，但通常是浓缩后使用。作为浓缩方法，可以采用硫酸铵盐析法、丙酮和醇沉淀法、使用有平膜、中空膜等的膜浓缩法等。

进而，也可以使用具有环异麦芽四糖生成酶活性的灭菌液及其浓缩液，利用已知的方法固定环异麦芽四糖生成酶。例如，可以适当采用对离子交换体的结合法、与树脂和膜等的共价键合法·吸附法、使用有高分子物质的包容法等。

如上所述，本发明的环异麦芽四糖生成酶虽然可以直接使用粗酶液或将粗酶液浓缩后使用，但也可以根据需要通过已知的方法进一步分离·纯化后利用。例如，可以将对培养液的处理物进行硫酸铵盐析、浓缩而得到的粗酶剂进行透析，然后利用使用有“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶(TOSOH CORPORATION制造)的阴离子交换柱层析进行纯化，接下来利用使用有“Phenyl-Toyopearl 650M”凝胶(TOSOH CORPORATION制造)的疏水层析进行纯化，由此可以以电泳纯化至单一水平的纯化酶的形式得到本发明的环异麦芽四糖生成酶。

当环异麦芽四糖生成酶为重组酶时，根据宿主的种类，有时酶蓄积在菌体内。在这种情况下，虽然能够将菌体或培养液直接使用，但通常在使用之前，也可以根据需要通过渗压震扰法或表面活性剂从菌体中提取后，或者通过超声波或细胞壁溶解酶将菌体破碎后，通过过滤、离心分离等将重组型酶从菌体或菌体破碎物中分离后使用而进行有效实施。

如果使用通过上述方法得到的天然型或重组型环异麦芽四糖生成酶，则能够制造本发明的环异麦芽四糖和含环异麦芽四糖的糖类。

在制造环异麦芽四糖和含环异麦芽四糖的糖类时，作为使环异麦芽四糖生成酶作用的底物原料，可以使用右旋糖酐、或用酸或右旋糖酐酶等酶对右旋糖酐进行部分水解而得到的右旋糖酐的部分分解产物等α-1,6葡聚糖。另外，如后述的实验14所记载，可知由于本发明的环异麦芽四糖生成酶作用于异麦芽四糖并生成环异麦芽四糖，因此，至少葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖可以用作底物。进而，国际公开号WO2008/136331号小册子中公开的支链α-葡聚糖因为具有D-葡萄糖通过α-1,6键连接的α-1,6葡聚糖结构作为其分子的部分结构，因此可以用作使环异麦芽四糖生成酶作用的底物原料。

当使本发明的环异麦芽四糖生成酶作用于底物原料时，对其底物浓度没有特别限制，例如，当使用底物浓度为10质量％以上的浓度比较高的水溶液时，难以进行基于本发明的环异麦芽四糖生成酶的生成反应，因此，优选底物浓度为5质量％以下，在此条件下，可以有效地生成环异麦芽四糖。反应温度为反应进行的温度即可，即，在至55℃左右的温度下进行即可。优选使用30℃至45℃左右的温度。反应的pH通常调节至4.0至8.0的范围、优选pH为4.5至7.5的范围即可。酶的用量和反应时间密切相关，根据目标酶反应的进行适当调节酶的用量和反应时间即可。

如上所述，本发明的环异麦芽四糖生成酶由葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或具有α-1,6葡聚糖为部分结构的糖类生成环异麦芽四糖。因而，如果组合使用作用于淀粉或淀粉的部分分解产物并生成葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或具有α-1,6葡聚糖为部分结构的糖类的酶和本发明的环异麦芽四糖生成酶，则可以以淀粉或淀粉的部分分解产物为底物原料来制造环异麦芽四糖。作为作用于淀粉或淀粉的部分分解产物并生成葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖或右旋糖酐的酶，例如，可以使用糊精葡聚糖酶，另外，作为生成具有α-1,6葡聚糖为部分结构的糖类的酶，例如，可以使用国际公开号WO2008/136331号小册子中公开的α-葡糖基转移酶。

在通过上述酶的组合由淀粉或淀粉的部分分解产物制造环异麦芽四糖时，可以进行逐级反应：首先，使作用于淀粉或淀粉的部分分解产物并生成葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或具有α-1,6葡聚糖为部分结构的糖类的酶作用于淀粉或淀粉的部分分解产物，从而暂时生成葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或具有α-1,6葡聚糖为部分结构的糖类，然后，使本发明的环异麦芽四糖生成酶作用于该生成物而生成环异麦芽四糖。另外，也可以进行同时反应：使作用于淀粉或淀粉的部分分解产物并生成葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖、右旋糖酐或具有α-1,6葡聚糖为部分结构的糖类的酶和本发明的环异麦芽四糖生成酶同时作用于淀粉或淀粉的部分分解产物。

通过上述反应得到的反应液可以直接用作含环异麦芽四糖的糖液。另外，也可以根据需要使葡聚糖酶、α-葡糖苷酶、葡糖胺酶等作用于含环异麦芽四糖的糖液而使夹杂的异麦芽低聚糖水解，将由此得到的糖液用作含环异麦芽四糖的糖液。另外，也可以选择实施进一步的加工处理：进行加氢而使反应液中残留的还原性糖类转化为糖醇以消除还原力等。通常情况下，将含环异麦芽四糖的糖液进一步纯化后使用。作为纯化方法，适当采用用于纯化糖的常用方法即可，例如，可以适当采用下述一种或两种以上的纯化方法：基于活性炭的脱色；基于H型、OH型离子交换树脂的脱盐；基于离子交换柱层析、活性炭柱层析、硅胶柱层析等柱层析的分级；基于醇和丙酮等有机溶剂的分馏；基于具有适度分离性能的膜的分离；以及在不使用环异麦芽四糖的情况下通过基于使夹杂糖类同化、分解的微生物例如酵母等的发酵处理、及碱处理等分解去除残留的还原性糖类等。

作为大量生产方法，特别适合采用离子交换柱层析。例如，通过使用日本特开昭58-23799号公报、日本特开昭58-72598号公报等中公开的强酸性阳离子交换树脂的柱层析去除夹杂糖类，可以有效地制造目标物的含量得到提高的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类。此时，可选择采用固定床方式、流化床方式和模拟流化床方式中的任一种方式。

如此得到的包含环异麦芽四糖的溶液、或其含量得到提高的糖类水溶液，是通常含有相对于固体物质为10质量％以上、优选40质量％以上的环异麦芽四糖的糖类水溶液，通常将其浓缩而制成糖浆状产品。该糖浆状产品可选择进一步干燥而制成无定形固体产品或无定形粉末产品。

进而，通过利用常规方法纯化所述含有环异麦芽四糖的糖类水溶液，可以制成环异麦芽四糖高含量糖类或高纯度的环异麦芽四糖制剂。另外，通过以环异麦芽四糖高含量糖类或高纯度的环异麦芽四糖制剂为原料进行结晶化，可以制备环异麦芽四糖结晶和含结晶的粉末。

需要说明的是，本发明的环异麦芽四糖仅被小肠粘膜α-葡萄糖苷酶轻微分解，因此，可认为是即使口服也难以消化吸收的难消化的糖类，是无毒、无害的糖类。

本发明的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类，作为甜味剂、口味改良剂、品质改良剂、稳定剂、防变色剂、赋形剂、粉末化基材等，与其他成分组合，可以有效地用于食品饮料、奢侈品、饲料、饵料、化妆品、药品、工业产品等各种组合物。

本发明的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类可以直接用作甜味品的调味料。也可以根据需要与其他甜味剂以及糊精、淀粉、乳糖等增量剂混合后使用，其他甜味剂例如有：糖浆粉、葡萄糖、异构化糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、蜂蜜、枫糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、二氢查尔酮、甜菊糖苷、α-糖基甜菊糖苷、罗汉果甜味剂、甘草甜素、索马甜、三氯蔗糖、L-天门冬酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等。

另外，本发明的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类的粉末可选择直接使用，或根据需要与增量剂、赋形剂、耦合剂等混合后成型为颗粒、球状、棒状、板状、立方体、片剂等各种形状后使用。

另外，本发明的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类的甜味与具有酸味、咸味、涩味、鲜味、苦味等其他口味的物质良好地协调，而且，如后述的实验所示，本发明的环异麦芽四糖的耐酸性、耐热性均高，因此，可以有效地用于普通食品饮料的增甜、口味改良以及品质改良等中。

例如，可以有效地用作酱油、粉末酱油、面豉酱、粉末面豉酱、醪糟、酱、香松、蛋黄酱、调味汁、乙、三杯乙、寿司乙粉、中国菜、天妇罗汤、面条汤、酱汁、番茄酱、烤肉酱、咖喱酱、炖菜、汤底、大石底、复合调味料、味淋、新味淋、食糖、咖啡糖等各种调味料的甜味剂，以及口味改良剂、品质改良剂等。另外，可以有效地用于以下各种饮料食品的甜味剂、口味改良剂、品质改良剂等，各种饮料食品例如：仙贝、碎年糕、米花糖、皮糖点心、饼类、半球状灰饼、米粉糕、豆沙、羊羹、水羊羹、锦球、果冻、蛋糕、糖球等各种日式糕点；面包、饼干、饼干、薄脆饼干、小甜饼、馅饼、布丁、掺糖奶油、乳蛋糕、奶油泡芙、华夫饼干、海绵蛋糕、炸面饼圈、巧克力、口香糖、焦糖、牛根糖、糖果等各种西式糕点；冰淇淋、果子露等冰制点心；水果糖浆泡菜，冰蜜等糖浆类；花酱、花生酱、果酱等酱类、果酱、桔皮果酱、糖浆泡菜、糖果等水果、蔬菜加工食品类；福神咸菜、暴腌咸萝卜、千层咸菜、薤咸菜等咸菜类；黄萝卜咸菜精、腌菜精等咸菜精；火腿、香肠等畜肉产品类；鱼火腿、鱼肠、鱼糕、竹轮、天妇罗等鱼制品；海胆、咸鱿鱼、醋昆布、干鱿鱼条、鲀干、鳕鱼、刺鱼、虾等的鱼肉松等各种美食类；紫菜、野菜、干鱿鱼、小鱼、贝类等制作的用酱油和糖煮的小鱼紫菜类；煮豆、土豆沙拉、昆布卷等家常菜食品；奶制品、鱼肉、畜肉、水果、蔬菜的装瓶、罐头类；合成酒、酿造酒、清酒、果酒、气泡酒、啤酒等酒类；咖啡、可可、果汁、碳酸饮料、乳酸饮料、乳酸菌饮料等汽水饮料；布丁混合物、热饼混合物、速溶果汁、速溶咖啡、速溶泡菜、速溶汤等速食品；以及断奶食品、治疗食品、饮料、肽食品、冷冻食品等。

另外，也可用于改善家畜、家禽、蜜蜂、蚕、鱼等饲养动物的饲料、饵料的适口性。此外，可以有效地用作香烟、牙膏、口红、润唇膏、口服液、片剂、锭剂、肝油滴剂、口腔清新剂、口香制剂、漱口水等固体和糊状及液体等任意形式的嗜好物，化妆品、药品和准药品等各种组合物中的甜味剂，另外用作口味改良剂、调味剂，进而用作品质改良剂、稳定剂等。

作为品质改良剂、稳定剂，可以有效地应用于有效成分、活性等容易失去的各种生物活性物质或包含其的保健食品、功能性食品、药品等。对于包含各种生物活性物质的保健食品、功能性食品、药品等，通过使用本发明的环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类作为品质改良剂、稳定剂，可以在不损失其有效成分、活性的情况下容易地制造稳定且高品质的液体、糊状或固体的保健食品、功能性食品或药品等。所述生物活性物质例如有：含有干扰素-α、-β、-γ、肿瘤坏死因子-α、-β、巨噬细胞迁移抑制剂、集落刺激因子、转移因子、白介素II等淋巴细胞活素的液体；含有胰岛素、生长激素、催乳素、促红细胞生成素、促卵细胞激素等激素的液体；含有卡介苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎活疫苗、天花菌苗、破伤风类毒素、竹叶青属抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂的液体；含有青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素的液体；含有硫胺素、核黄素、L-抗坏血酸、鱼肝油、类胡萝卜素、麦角甾醇、生育酚等维生素的液体；EPA、DHA、花生四烯酸等高级不饱和脂肪酸或其酯衍生物；含有脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶的液体；药用人参提取物、甲鱼提取物、小球藻提取物、芦荟提取物、蜂胶提取物等提取物类；病毒、乳酸菌、酵母等活菌糊；蜂王浆等。

作为使如上所述的组合物含有环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类的方法，在直至其制品完成之前的工序中使其含有即可，例如，可适当选择混合、混捏、溶解、熔化、浸渍、渗透、分散、涂布、包覆、喷雾、注射、晶析、固化等已知的方法。其含量通常为0.1质量％以上、优选1质量％以上是合适的。

下面，通过实验详细地说明本发明。

<实验1：源于右旋糖酐的产物>

<实验1-1：粗酶液的制备>

将由市售的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)15g/L、酵母提取物(商品名“Powdery Yeast Extract SH”，日本制药株式会社制造)1.0g/L、多肽(商品名“HiPolypeptone”，日本制药株式会社制造)5.0g/L、磷酸二钾1.0g/L、二水合磷酸二氢钠0.6g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、五水硫酸锰0.01g/L、碳酸钙3.0g/L和水组成的液体培养基(pH 6.8)以各100mL的量加入20个容量500mL的锥形瓶中，在高压釜中、121℃下灭菌20分钟并进行冷却。然后，接种从土壤中分离的微生物D1110菌株，在27℃、240rpm的条件下进行旋转振荡培养4天。培养后，将培养液进行离心分离(12,000rpm，10分钟)以去除菌体，得到培养上清液。在所得到的培养物上清液约0.9L中添加硫酸铵以使其达到80％饱和，进行溶解、盐析，将盐析产物溶于20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中，在4℃下透析24小时，然后，在4℃、12,000rpm的条件下进行离心分离10分钟，回收得到的上清液作为粗酶液。

<实验1-2：粗酶液对右旋糖酐的作用>

在含有1％(w/v)的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)、0.006％(w/v)的作为防腐剂的桧醇的50mM乙酸缓冲液(pH 6.0)1L中，添加实验1-1中得到的粗酶液，使其在40℃下反应20小时。通过在100℃下对反应液进行热处理10分钟而使酶失活，使用蒸发器进行浓缩，并溶解在100mL去离子水中。通过向其中添加乙醇200mL，使反应液中残留的高分子(右旋糖酐、蛋白质等)沉淀，在4℃、12,000rpm的条件下进行离心分离20分钟，回收上清液。将得到的上清液进行截留分子量10,000的膜过滤以进一步去除残留的高分子，制成酶反应物。

为了研究所得到的酶反应物中的糖类，将异麦芽低聚糖标记物(林原株式会社制剂)、异麦芽三糖标准品(林原株式会社制剂)、异麦芽四糖标准品(林原株式会社制剂)与作为展开剂的2-丙醇：1-丁醇：水混合液(体积比12：3：4)一起供于使用作为薄层板的Merck公司制造的“KEISELGEL 60”(铝板，10×20cm)、进行两次展开的薄层层析(以下简称“TLC”)，分离糖类。用硫酸-甲醇法对得到的TLC板上分离的糖类进行着色检测。将结果示于图1中。如图1所示，在同时展开的异麦芽低聚糖标记物(道1)、异麦芽三糖标准品(道2)和异麦芽四糖标准品(道3)的对比中，在分离酶反应物的道4中，检测到迁移率低于葡萄糖聚合度为3的异麦芽三糖(图1中的符号“IG3”)、且迁移率高于葡萄糖聚合度为4的异麦芽四糖(图1中的符号“IG4”)的未知糖类的点(图1中的符号“I”)。将该未知糖类命名为“未知糖类I”。

<实验1-3：未知糖类I的制备>

在使用少量酶反应物的预备试验中，可确认未知糖类I不会被α-葡糖苷酶、葡糖胺酶分解，通过碱性处理不会被分解，接下来，进行将夹杂于未知糖类I中的右旋糖酐分解产物水解至D-葡萄糖的实验。即，用盐酸将实验1-2中得到的含有未知糖类I的酶反应物调节至pH5.0，然后，添加相对于每1克固体物质为100单位的α-葡萄糖苷酶(商品名“Transglucosidase L“Amylase””，Amano Enzyme Co.,Ltd.制造)和相对于每1克固体物质为1,000单位的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex Corporation销售)，使其在50℃下反应4天。反应后，通过在约100℃下进行热处理10分钟而使反应停止。用分析用的高效液相色谱(以下简称为分析HPLC)对所得到的反应液中的糖类进行分析，结果检测到洗脱时间为58.7分钟的D-葡萄糖、洗脱时间为49.4分钟的未知糖类I。反应液的糖组成为：D-葡萄糖为30.0质量％、未知糖类I为65.5质量％、含有其他异麦芽低聚糖的右旋糖酐的部分分解产物为4.5质量％。需要说明的是，分析HPLC在以下条件下进行：色谱柱，将两根“MCIgel CK04SS”(三菱化学株式会社制造)串联连接；洗脱液使用水；柱温80℃；流速0.4mL/分钟；使用差示折射率检测器RID-10A(株式会社岛津制作所制造)进行检测。

接下来，在通过α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶处理得到的上述反应液中添加氢氧化钠而将pH调节至12，并在98℃下保持1小时，由此将还原糖(D-葡萄糖和少量的右旋糖酐的部分分解产物)分解。将沉淀物过滤而去除后，通过添加三菱化学株式会社制造的阳离子交换树脂“DIAION SK-1B”来进行中和而成为pH 8左右，然后通过活性炭处理进行脱色。进一步使用“DIAION SK-1B”、三菱化学株式会社制造的阴离子交换树脂“DIAION WA30”和Organo制造的阴离子交换树脂“IRA411”对所得到的糖液进行脱盐，进行微滤，然后用蒸发器进行浓缩，并进行真空干燥，从而得到以固体物质计约60mg的未知糖类I的纯化制备物。用分析HPLC研究所得到的未知糖类I制剂的糖组成。如图2的HPLC色谱图所示，未知糖类I的纯度为99.1质量％，判明其为纯度非常高的制剂。

<实验2：未知糖类I的结构分析>

对于实验1中得到的未知糖类I的纯化制备物，进行LC/MS分析、各种NMR分析，进行未知糖类I的结构分析。

<实验2-1：LC/MS分析>

对于实验1中得到的未知糖类I的纯化制备物，使用LC/MS分析仪(商品名“Prominence”)(株式会社岛津制作所制造)，在与上述实验1-3中进行的HPLC相同的条件下进行液相色谱分析，结果未知糖类I的峰在保留时间49.5分钟洗脱，并且显著检测到质量数(m/z)为671的添加钠分子离子，判明未知糖类I的分子量为648。该分子量表明未知糖类I是具有四分子的D-葡萄糖以环状连接的结构的环状葡糖四糖。

<实验2-2：

为了确定未知糖类I的化学结构，将实验1中得到的未知糖类I的纯化制备物溶解于重水(D

如图3所示，在未知糖类I的

[表1]

d:双重峰

dd:双双重峰

t:三重峰

1H～6H:键合于D-葡萄糖的1～6位碳的质子

根据表1所示的各质子峰的耦合常数和化学位移的值，判明未知糖类I具有葡萄糖吡喃糖基结构，由在5.13ppm处观察到键合于异构碳的1位的质子的峰可知，未知糖类I中的D-葡萄糖的结合方式为α-异构体。

<实验2-3：

使用实验2-2中使用的NMR装置，接着进行

如图5所示，在未知糖类I的

基于表1所示的

[表2]

进而，在图7所示的HMBC谱图中，观察与1位质子显示相关的碳，结果可观察到1位质子与2、3、5、6位的碳相关，没有观察到与4位碳相关。由于除了与2、3、5位的碳显示相关之外还与6位碳之间显示相关，因此判明：在未知糖类I中，1位碳和6位碳之间存在葡糖苷键，即，未知糖类I中D-葡萄糖介由1,6-葡糖苷键结合。

根据以上结果判明，如图8所示，未知糖类I是具有四分子的D-葡萄糖介由α-1,6-葡糖苷键以环状连接的结构的环状葡糖四糖、即环异麦芽四糖。具有这种结构的糖类是以往完全未知的，环异麦芽四糖是一种新型的环状糖类。

<实验3：环异麦芽四糖的结晶>

尝试使用放大实验1的方法而再制备的环异麦芽四糖纯化制备物(25.9g，纯度：96.1质量％)，获得该糖类的结晶。

<实验3-1：结晶的制备>

将上述环异麦芽四糖纯化制备物悬浮于去离子水中，然后进行加热溶解，将调节至糖浓度(Brix值)53.2％的环异麦芽四糖水溶液静置而冷却至室温，结果析出了结晶。将结晶的显微照片示于图9中。通过过滤回收析出的结晶，并在25℃下进行减压干燥，由此得到8.6g环异麦芽四糖的结晶制剂。通过上述的分析HPLC测定该结晶的环异麦芽四糖纯度，结果为99.5质量％的高纯度。

<实验3-2：结晶环异麦芽四糖的分析>

对于实验3-1中得到的环异麦芽四糖的结晶制剂，通过常规方法测定水分含量，并且进行了热分析、粉末X射线衍射。

<水分含量>

对于实验3-1中得到的环异麦芽四糖的结晶制剂，用卡尔费休水分测定仪(商品名“AVQ-2200A”、平沼产业株式会社制造)测定水分含量，结果得到的数值为13.9质量％。由于假设结晶环异麦芽四糖为五水结晶或六水结晶时的水分含量的理论值为12.2质量％或14.3质量％，因此，可认为该结晶环异麦芽四糖是五水结晶或六水结晶。

<热分析(DSC、TG/DTA)>

用铝容器准确称量实验3-1中得到的环异麦芽四糖结晶制剂约5mg，在氮气气氛下、以5℃/分钟的升温速度由30℃升温至300℃，用热重-差热同步热分析仪(商品名“TG/DTA 6200”，Hitachi High-Tech Science Corporation制造)进行热分析，结果至116.5℃观察到重量损失为12.12质量％。认为该重量损失是由结晶水的解吸而造成的。结合上述关于水分含量的见解，认为该结晶环异麦芽四糖为五水结晶。

<粉末X射线衍射图>

如下进行环异麦芽四糖五水结晶的粉末X射线衍射分析：将试样载于硅制无反射板上，使用粉末X射线衍射仪“X’Pert Pro MPD”(使用CuKα射线)(Spectris Co.,Ltd.制造)来进行分析。将环异麦芽四糖五水结晶的粉末X射线衍射图示于图10。在衍射角(2θ)9.0°、9.8°、11.8°、13.1°和19.1°(图10中的符号“↓”)处观察到特征衍射峰。

<实验4：环异麦芽四糖生成酶生产菌的鉴定>

在土壤筛选中，作为环异麦芽四糖生成酶生产菌，分离出新型微生物D1110菌株和菌落形态与D1110菌株不同的新型微生物D2006菌株这两种菌株。进行各微生物的显微镜观察，结果可知微生物D1110菌株和D2006菌株均为杆菌。在本实验中，确定16S rRNA(16SrDNA)的碱基序列，基于该碱基序列进行了微生物D1110菌株和D2006菌株的菌种鉴定。

<实验4-1：由微生物D1110菌株和D2006菌株制备16S rDNA>

将由市售的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)1.5g/L、磷酸二钾1.0g/L、七水合硫酸镁1.0g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵2.0g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、七水合硫酸锰0.01g/L、七水合硫酸锌0.001g/L、结冷胶20.0g/L和水组成的培养基(pH 6.8)在高压釜中、121℃下灭菌20分钟后，分注于培养皿中并进行冷却，从而制备结冷胶平板培养基。然后，将从土壤中分离出的微生物D1110菌株和D2006菌株分别接种于该平板培养基，并分别在27℃下静置培养3天，形成单菌落。

分别钓取上述形成了单菌落的微生物D1110菌株和D2006菌株，并悬浮于50μL市售的DNA简易提取试剂(商品名“MightyPrep reagent for DNA”，Takara Bio Co.,Ltd.销售)中，在95℃下处理10分钟后，以15,000rpm离心分离2分钟，由此回收含有基因组DNA的上清液。对于回收的微生物D1110菌株的基因组DNA和微生物D2006菌株的基因组DNA，分别使用具有序列表中的序列编号1所示的碱基序列的正义链引物“8F”和具有序列表中的序列编号2所示的碱基序列的反义链引物“1512R”进行PCR，对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，结果可观察到源于各个菌株的约1.5kbp的PCR扩增产物，因此通过乙醇沉淀回收各个产物，制成16S rDNA。

<实验4-2：16S rDNA的碱基序列的确定>

实验4-1中得到的D1110菌株和D2006菌株的16S rDNA的每个碱基序列分别用常规方法测定。结果显示，D1110菌株和D2006菌株的16S rDNA的碱基序列分别为序列表中的序列编号3(1,447bp)和序列表中的序列编号4(1,485bp)。

<实验4-3：基于同源性检索的微生物D1110菌株和D2006菌株的鉴定>

基于实验4-2中确定的16S rDNA的碱基序列，使用基因分析软件(GENETYXVer.13)对数据库RDP(核糖体数据库项目，TheRibosomal Database Project)和EzTaxon进行了同源性检索。

作为实验4-2中得到的微生物D1110菌株的16S rDNA进行的同源性检索的结果，将检索到的同源性高的前20个条目内、前5个条目的微生物的属·种·株与它们的16S rDNA碱基序列的同源性示于表3中。另外，将对于微生物D2006菌株的16S rDNA同样进行的同源性检索的结果示于表4中。

[表3]

[表4]

如表3所示，D1110菌株的16S rDNA碱基序列与阿格雷氏菌(Agreia pratensis)VKM Ac-2510(T)之间显示出最高的同源性98.34％。通常情况下，基于16S rDNA碱基序列的细菌分类，如果有99％以上的同源性，则可以说很可能为同一菌种。虽然检索中没有显示出99％以上的同源性，无法完成菌种的鉴定，但显示D1110菌株属于阿格雷氏属。基于该结果，将D1110菌株鉴定为阿格雷氏菌种(Agreia sp.)，并命名为阿格雷氏菌种D1110。

另外，如表4所示，在D2006菌株的16S rDNA的碱基序列与解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)DSM8608菌株之间显示出最高的同源性99.17％。基于该结果，将D2006菌株的属·种鉴定为解单端孢菌素微杆菌，并命名为解单端孢菌素微杆菌D2006。

阿格雷氏菌种D1110菌株和解单端孢菌素微杆菌D2006均保藏在位于日本千叶县木更津市风坂町2-5-6的独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)专利微生物保藏中心(NPMD)，并于2018年12月28日分别以保藏号NITE BP-02815和NITE BP-02816保藏。

<实验5：源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的制备>

将与实验1-1中使用的液体培养基相同的液体培养基各3mL放入试管中，在高压釜中、121℃下灭菌20分钟并进行冷却，然后接种阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)，并在27℃、240rpm的条件下进行振荡培养96小时，将由此得到的培养物作为种子培养物。

将20个加入有组成与种子培养物相同的液体培养基100mL的容量500mL的锥形瓶在高压釜中、121℃下灭菌20分钟，进行冷却而成为27℃后，接种种子培养液各1mL，在温度27℃下旋转振荡培养66小时。培养后，进行离心分离(12,000rpm、15分钟)以去除菌体，得到约1.8L的培养上清液。对培养上清液测定环异麦芽四糖生成酶活性，结果可知在培养上清液中包含该酶活性0.112U/mL。

<实验6：源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的纯化>

通过在实验5中得到的约1.8L培养上清液(总活性202U)中添加硫酸铵以使其达到80％饱和、并在4℃下放置24小时而进行盐析，通过离心分离(12,000rpm、30分钟)回收生成的盐析沉淀物，将其溶解于20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)中，然后对同一缓冲液进行透析，得到153mL的透析酶液。透析酶液中的环异麦芽四糖生成酶活性为33.2U。将该酶液供于使用有TOSOH CORPORATION制造的“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶的阴离子交换层析(凝胶容量24.1mL)。对于环异麦芽四糖生成酶活性，使其吸附于用20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)进行了平衡的“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，结果在食盐浓度约0.25M左右洗脱。回收该活性组分，添加硫酸铵以使其最终浓度为1M，然后进行离心分离以去除沉淀物，供于使用有TOSOH CORPORATION制造的“Phenyl-Toyopearl650M”凝胶的疏水层析(凝胶容量11mL)。对于环异麦芽四糖生成酶活性，使其吸附于用包含1M硫酸铵的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)进行了平衡的“Phenyl-Toyopearl 650M”凝胶，以硫酸铵浓度1M～0M的线性梯度使其洗脱，结果在硫酸铵浓度约0.3M左右洗脱。将该纯化的各工序中的环异麦芽四糖生成酶的总活性、总蛋白、比活性和收率示于表5中。

[表5]

将通过使用有“Phenyl-Toyopearl 650M”凝胶的疏水层析纯化了的环异麦芽四糖生成酶制剂供于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(8～16w/v％浓度梯度)，检测纯度，结果显示出单一的蛋白带，判明为高纯度制剂。

<实验7：源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的性质>

<实验7-1：分子量>

将通过实验6的方法得到的环异麦芽四糖生成酶纯化制备物供于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(6～16w/v％浓度梯度)，与同时进行电泳的分子量标记物(商品名“PrecisionPlus Protein Uncolored Standard”，Japan Bio-Rad Laboratories K.K.,销售)进行比较来测定分子量，结果判明环异麦芽四糖生成酶的分子量为86,000±10,000道尔顿。

<实验7-2：酶反应的最适温度和最适pH>

使用通过实验6的方法得到的环异麦芽四糖生成酶纯化制备物，基于活性测定的方法研究温度、pH对酶活性的影响。将这些结果示于图11(最适温度)、图12(最适pH)。判明：在pH6.0、反应30分钟的条件下，环异麦芽四糖生成酶的最适温度为35至40℃；在40℃、反应30分钟的条件下，最适pH为5.5至6.0。

<实验7-3：酶的温度稳定性和pH稳定性>

使用通过实验6的方法得到的纯化环异麦芽四糖生成酶制剂，研究该酶的温度稳定性和pH稳定性。通过如下方法求出温度稳定性：将酶溶液(20mM乙酸缓冲液，pH6.0)在各温度下保持30分钟并进行水冷，然后测定残留的酶活性。通过如下方法求出pH稳定性：将该酶在各pH的100mM缓冲液中、4℃下保持16小时，然后将pH调节至6.0，测定残留的酶活性。将这些结果示于图13(温度稳定性)、图14(pH稳定性)中。如图13表明，判明环异麦芽四糖生成酶至40℃是稳定的。另外，如图14表明，判明环异麦芽四糖生成酶的pH稳定性在pH5.0至10.0的范围内是稳定的。

<实验7-4：N-末端氨基酸序列>

使用通过实验6的方法得到的环异麦芽四糖生成酶纯化制备物，利用蛋白质测序仪PPSQ-31A型(株式会社岛津制作所制造)来分析源于D1110的酶的N末端氨基酸序列，结果判明：具有序列表中的序列编号5所示的氨基酸序列，即丙氨酸-苏氨酸-缬氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-色氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-丙氨酸-精氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-脯氨酸。

<实验8：源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽酚四糖生成酶的制备>

将与实验1-1中使用的液体培养基相同的液体培养基各3mL放入试管中，在高压釜中、121℃下灭菌20分钟并进行冷却，然后接种解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)，并在27℃、240rpm的条件下进行振荡培养96小时，将由此得到的培养物作为种子培养物。

将15个加入有组成与种子培养物相同的液体培养基100mL的容量500mL的锥形瓶在高压釜中、121℃下灭菌20分钟，进行冷却而成为27℃后，接种种子培养液各1mL，在温度27℃下旋转振荡培养66小时。培养后，进行离心分离(12,000rpm、15分钟)以去除菌体，得到约1.4L的培养上清液。对培养上清液测定环异麦芽四糖生成酶活性，结果可知在培养上清液中包含该酶活性0.069U/mL。

<实验9：源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶的纯化>

通过在实验8中得到的约1.4L培养上清液(总活性96.6U)中添加硫酸铵以使其达到80％饱和、并在4℃下放置16小时而进行盐析，通过离心分离(12,000rpm、30分钟)回收生成的盐析沉淀物，将其溶解于含有1mM氯化钙的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)中，然后对同一缓冲液进行透析，得到110mL的透析酶液。透析酶液中的环异麦芽四糖生成酶活性为140.7U。将该酶液供于使用有TOSOHCORPORATION制造的“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶的阴离子交换层析(凝胶容量20mL)。对于环异麦芽四糖生成酶活性，使其吸附于用含有1mM氯化钙的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)进行了平衡的“DEAE-Toyopearl 650S”凝胶，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，结果在食盐浓度约0.2M左右洗脱。回收该活性组分，相对于含有1mM氯化钙的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)进行透析，供于使用有GeHealthcare Japan Corporation制造的“Mono Q 5/50GL”凝胶的阴离子交换层析(凝胶容量1.0mL)。对于环异麦芽四糖生成酶活性，使其吸附于用含有1mM氯化钙的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)进行了平衡的“Mono Q 5/50GL”凝胶，以食盐浓度0M～0.5M的线性梯度使其洗脱，结果在食盐浓度约0.3M左右洗脱。将该纯化的各工序中的环异麦芽四糖生成酶的总活性、总蛋白、比活性和收率示于表6中。

[表6]

将通过使用有“Mono Q 5/50GL”凝胶的疏水层析纯化了的环异麦芽四糖生成酶制剂供于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(8～16w/v％浓度梯度)，检测纯度，结果显示出单一的蛋白带，判明为高纯度制剂。

<实验10：源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶的性质>

<实验10-1：分子量>

将通过实验9的方法得到的环异麦芽四糖生成酶纯化制备物供于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(6～16w/v％浓度梯度)，与同时进行电泳的分子量标记物(商品名“PrecisionPlus Protein Uncolored Standard”，Japan Bio-Rad Laboratories K.K.,销售)进行比较来测定分子量，结果判明环异麦芽四糖生成酶的分子量为86,000±10,000道尔顿。

<实验10-2：酶反应的最适温度和最适pH>

使用通过实验9的方法得到的环异麦芽四糖生成酶纯化制备物，基于活性测定的方法研究温度、pH对酶活性的影响。将这些结果示于图15(最适温度)、图16(最适pH)。判明：在pH6.0、反应30分钟的条件下，环异麦芽四糖生成酶的最适温度为40℃；在40℃、反应30分钟的条件下，最适pH为5.5左右。

<实验10-3：酶的温度稳定性和pH稳定性>

使用通过实验9的方法得到的纯化环异麦芽四糖生成酶制剂，研究该酶的温度稳定性和pH稳定性。通过如下方法求出温度稳定性：将酶溶液(20mM乙酸缓冲液，pH6.0)在各温度下保持30分钟并进行水冷，然后测定残留的酶活性。通过如下方法求出pH稳定性：将该酶在各pH的100mM缓冲液中、4℃下保持18小时，然后将pH调节至6.0，测定残留的酶活性。将这些结果示于图17(温度稳定性)、图18(pH稳定性)中。如图17表明，判明环异麦芽四糖生成酶至35℃是稳定的。另外，如图18表明，判明环异麦芽四糖生成酶的pH稳定性在pH5.0至7.0的范围内是稳定的。

<实验10-4：N末端氨基酸序列>

使用通过实验9的方法得到的环异麦芽四糖生成酶纯化制备物，利用蛋白质测序仪PPSQ-31A型(株式会社岛津制作所制造)来分析源于D2006的酶的N末端氨基酸序列，结果判明：具有序列表中的序列编号6所示的氨基酸序列，即丙氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-色氨酸-苏氨酸-天冬氨酸。

<实验11：编码环异麦芽四糖生成酶的DNA的克隆以及包含其的重组DNA与转化体的制备>

由阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)和解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)分别克隆编码环异麦芽四糖生成酶的DNA，并进行能自主复制的重组DNA的制作、编码酶的DNA的碱基序列的确定和转化体的制备。

<实验11-1：基因组DNA的制备>

分别用一铂耳刮掉在平板琼脂培养基上继代培养的阿格雷氏菌种D1110(NITEBP-02815)或解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)，并植菌于加入有实验1中使用的液体培养基3mL的试管中，分别在27℃、240rpm的条件下振荡培养5天。培养完成后，对培养液进行离心分离而回收各个菌体，使用市售的全DNA纯化试剂盒(商品名“DNeasy Blood&Tissue Kit”，QIAGEN公司销售)，通过常规方法由各个菌体制备基因组DNA。

<实验11-2：使用有下一代测序仪的全基因组碱基序列的确定>

将实验11-1中得到的源于各个微生物的基因组DNA分别用市售的试剂盒(商品名“Nextera XT DNA Library Preparation Kit”，Illumina公司销售)进行酶促片段化,通过进行经片段化的DNA末端的平滑处理和向DNA末端添加接头序列而将DNA片段程序化,进而通过PCR进行扩增,使用市售的DNA纯化试剂盒(商品名“AMPure XP”，Beckman Coulter公司销售)进行纯化。接下来，使用下一代测序仪(装置名称“MiSeq”，Illumina公司制造)确定经程序化的DNA片段的碱基序列，并将确定的DNA片段的碱基序列(contig序列)在计算机上进行整合，由此得到了全基因组DNA的碱基序列。

接下来，使用基因区域预测软件(“Glimmer”)对全基因组DNA的碱基序列进行分析，并预测推测为编码蛋白质的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF：推测基因区域)，结果判明：阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的全基因组DNA中有9,139个ORF，同样地解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)中有11,068个ORF。

<实验11-3：编码环异麦芽四糖生成酶的ORF的鉴定>

以在实验11-2的全基因组分析中观察到的源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的基因组DNA的9,139个ORF为对象，检索编码与实验3-2中确定的源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的N末端氨基酸序列(序列表中的序列编号5所示的氨基酸序列)一致的氨基酸序列的ORF，结果判明，与同N末端氨基酸序列完全一致的氨基酸序列编码于ORF9038。根据该结果判明：ORF9038的碱基序列、即序列表中的序列编号9所示的碱基序列为环异麦芽四糖生成酶的结构基因DNA，且源于阿格雷氏菌种D1110(NITEBP-02815)的环异麦芽四糖生成酶包含序列表中的序列编号7所示的氨基酸序列、即从并记于序列表中的序列编号9所示的碱基序列的氨基酸序列中去除推测为分泌信号序列的N末端部分的31氨基酸残基而得到的氨基酸序列。

另外，以在实验11-2的全基因组分析中观察到的源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的基因组DNA的11,068个ORF为对象，检索编码与实验10-4中确定的环异麦芽四糖生成酶的N末端氨基酸序列(序列表中的序列编号6所示的氨基酸序列)一致的氨基酸序列的ORF，结果判明，与同N末端氨基酸序列完全一致的氨基酸序列编码于ORF5328。根据该结果判明：ORF5328的碱基序列、即序列表中的序列编号10所示的碱基序列为源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶的结构基因DNA，且源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶具有序列表中的序列编号8所示的氨基酸序列、即从并记于序列表中的序列编号10所示的碱基序列的氨基酸序列中去除推测为分泌信号序列的N末端部分的32氨基酸残基而得到的氨基酸序列。

顺便提及，分别计算出包含序列表中的序列编号7所示的氨基酸序列的源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的分子量为86,350，且包含序列表中的序列编号8所示的氨基酸序列的源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶的分子量为86,658，这些值与前述实验3-1和实验10-1中通过SDS-PAGE分别求出的分子量86,000±10,000很一致。使用市售的遗传信息处理软件(“GENETYXVer.13”，Genetyx Corporation销售)研究编码序列表中的序列编号9所示的源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的酶基因的氨基酸序列和序列表中的序列编号10所示的源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的酶基因的氨基酸序列的同源性，结果为71％(参见图19)。

<实验12：用于表达的重组DNA、pRSET A-ORF9038的制作和基于其转化体E9038的重组型环异麦芽四糖生成酶的产生>

利用常规方法通过PCR扩增源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的基因组DNA的ORF9038的环异麦芽四糖生成酶基因，并插入至用于表达的载体“pRSET A”(ThermoFisher Scientific K.K.制造)，研究了重组型环异麦芽四糖生成酶在大肠杆菌中的表达。

<实验12-1：用于表达的重组DNA、pRSET A-ORF9038的制作和转化体E9038的制备>

在将阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶基因插入用于表达的载体“pRSET A”时，使具有序列表中的序列编号11所示的碱基序列的正义链引物和具有序列表中的序列编号12所示的碱基序列的反义链引物组合，由此对阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的全基因组DNA进行PCR，得到扩增DNA片段。该PCR扩增DNA以如下方式进行设计：在5'末端和3'末端具有与pRSET A同源的15碱基的序列以使其通过In-fusion方插入载体pRSET A中，并且在启动密码子ATG之后配置编码环异麦芽四糖生成酶的成熟酶的氨基酸序列、即序列表中的序列编号7所示的氨基酸序列的DNA，在启动密码子ATG之后配置终止密码子TAA TAG。需要说明的是，T7启动子、核糖体结合位点(RBS)和启动密码子ATG使用了pRSET A上的那些。

将通过In-fusion法将上述扩增的DNA插入载体pRSET A中而得到的重组DNA命名为“pSET A-ORF9038”，将pRSET A-ORF-9038示于图20中。使用pSET A-ORF9038对大肠杆菌HST-08(Takara BioInc.销售)进行转化，并由所得到的转化体分离、制备pRSET A-ORF9038，对用于表达的宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Merck Co.,Ltd.销售)进行转化，从而制备转化体“E9038”。

<实验12-2：基于转化体E9038的重组型环异麦芽四糖生成酶的产生>

将由“Terrific Broth”(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)47g/L、甘油4g/L和水组成的液体TB培养基(pH6.8)各5mL放入玻璃试管中，在高压釜中、121℃下灭菌20分钟并进行冷却后，无菌地添加氨苄青霉素以使其最终浓度为100μg/mL，从而制备液体培养基。将实验12-1中得到的转化体E9038接种于该液体培养基，在于37℃下振荡培养8小时的时刻，添加异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)使其最终浓度为100μM，从而诱导环异麦芽四糖生成酶基因的表达，进一步培养16小时。通过离心分离从得到的培养物中回收菌体。按照常规方法对得到的菌体进行溶菌酶处理、冻融处理后，进行超声波破碎来制备细胞提取物。通过如下方法来进行超声波破碎：将菌体悬浮于20mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中后，将该菌体悬浮液一边在冰水浴中冷却一边用超声波匀浆器(“Model UH-600”，SMT Co.,Ltd.制造)进行细胞破坏。对得到的细胞破碎提取物进行离心分离，得到细胞提取物上清液。

以如此制备的细胞提取物上清液为重组环异麦芽四糖生成酶的粗酶液，通过将该粗酶液0.3mL与含有2.0％(w/v)的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)的200mM乙酸缓冲液(pH6.0)0.3mL混合、并在40℃下保持一夜而使其反应后，在100℃下加热10分钟而使反应停止。将得到的反应液供于实验1中使用的分析HPLC，将反应液的HPLC谱图示于图21中。需要说明的是，作为对照，将保持表达载体pRSET A的大肠杆菌BL21(DE3)在与上述转化体的情形相同的条件下进行培养，由培养物制备细胞提取物上清液，同样地研究环异麦芽四糖生成能。

如图21所示，在反应液的HPLC谱图中，可观察到在保留时间17分钟左右作为底物的右旋糖酐的峰(图21中的符号“Dex”)的洗脱，在保留时间49.4分钟左右可观察到环异麦芽四糖的峰(图21中的符号“CI-4”)。根据该结果，可定性地确认环异麦芽四糖生成酶基因在宿主大肠杆菌细胞内的表达，产生了环异麦芽四糖生成酶。另一方面，虽然省略了具体的谱图，但在宿主即对照的大肠杆菌的菌体提取上清液中，没有观察到环异麦芽四糖的生成，根本检测不到该酶活性。

需要说明的是，虽然省略了详细情况，但对于源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的酶而言，与上述源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的酶的情形同样地，制备重组DNA、转化体，使重组酶在宿主大肠杆菌的细胞内表达，结果可确认环异麦芽四糖生成酶的产生。

<实验13：环异麦芽四糖生成酶对异麦芽五糖的作用>

作为研究环异麦芽四糖生成酶的底物特异性的一部分，研究对异麦芽五糖的作用。在含有1％(w/v)异麦芽五糖(林原株式会社制剂，纯度98.1质量％)和0.006％(w/v)作为防腐剂的桧木醇的50mM乙酸缓冲液(pH 6.0)0.5mL中，添加相对于每1g异麦芽五糖为2.0单位的通过实验6的方法得到的源于阿格雷氏菌种D1110(NITEBP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的纯化制备物，并使其在40℃下进行反应24小时，通过将反应液在100℃下热处理10分钟而使酶失活。为了研究反应液中的产物，使用乙腈：水：乙酸乙酯：1-丙醇混合液(体积比85：70：20：50)作为展开溶剂，使用Merck公司制造的“KEISELGEL 60”(铝板，10×20cm)作为薄层板，进行两次展开的TLC来分离糖类。通过硫酸-甲醇法使其显色来检测分离出的糖类，并确认来自异麦芽五糖的酶反应产物。

其结果判明：环异麦芽四糖生成酶作用于异麦芽五糖，生成环异麦芽四糖，同时生成异麦芽四糖，而且生成少量的异麦芽三糖、异麦芽糖、葡萄糖和高分子葡萄糖。根据该结果，可认为该酶作用于葡萄糖聚合度至少为5以上的α-1,6葡聚糖。

<实验14：环异麦芽四糖生成酶的底物特异性>

使用各种糖类来研究环异麦芽四糖生成酶的底物特异性。制备含有D-葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、右旋糖酐T10(平均分子量10,000，Pharmacosmos公司制造)、右旋糖酐T70(平均分子量70,000，Pharmacosmos公司制造)或右旋糖酐T2000(平均分子量2,000,000，Pharmacosmos公司制造)的水溶液。在这些底物溶液中，加入最终浓度50mM的乙酸缓冲液(pH 6.0)和最终浓度1mM的氯化钙，然后添加相对于每1g底物固体成分为各20单位的通过实验6的方法得到的源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的纯化制备物，以使底物浓度达到1％(w/v)的方式进行调节，在40℃、pH6.0下使其作用24小时。为了研究酶反应前后的反应液中的糖类，使用2-丙醇、1-丁醇、水混合液(体积比12：3：4)作为展开溶剂，使用Merck公司制造的“KEISELGEL 60F

[表7]

-:未生成

+:少量生成

++:生成

+++:显著生成

如表7所示，在进行试验的糖类中，环异麦芽四糖生成酶未作用于D-葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等单糖、双糖、三糖。另一方面，相同酶作用于异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖和右旋糖酐，生成环异麦芽四糖，因此判明：相同酶作用于葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖，生成环异麦芽四糖。另外，相同酶通过对生成的环异麦芽四糖进行水解而生成异麦芽四糖。进而还判明：相同酶作用于葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖，并催化生成葡萄糖聚合度为2以上的一系列异麦芽低聚糖的歧化反应。而且，在作为受体的异麦芽糖共存的情况下，在使相同酶作用于环异麦芽四糖时，生成了异麦芽六糖，因此判明：在使环异麦芽四糖开环的同时还催化使异麦芽四糖结合于异麦芽糖的偶联反应。需要说明的是，对于源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶同样地研究了底物特异性，结果与源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的酶同样地，作用于葡萄糖聚合度为4以上的α-1,6葡聚糖，生成环异麦芽四糖。进而，在环异麦芽四糖的水解反应、α-1,6葡聚糖的歧化反应、催化偶联反应等方面，相同酶与源于D1110的酶相同，以整体计，相同酶的底物特异性与源于D1110的酶相同。

<实验15：环异麦芽四糖的基于小肠粘膜酶的消化试验>

将实验3-1中得到的纯度99.5质量％的环异麦芽四糖结晶制剂溶于50mM马来酸缓冲液(pH6.0)中以使其浓度为1质量％，制成底物溶液。在该底物溶液中，添加相对于每1g环异麦芽四糖为50单位的由大鼠小肠丙酮粉(Sigma-Aldrich公司销售)制备的小肠粘膜酶(α-葡萄糖苷酶)作为麦芽糖分解活性，在37℃下保持24小时后，在100℃下加热10分钟以使酶失活。通过HPLC法分别定量反应前和反应后的溶液中的环异麦芽四糖，并测定酶促反应后的环异麦芽四糖的残留率(％)，即(反应后的质量/反应前的质量)×100，结果酶促反应24小时后的残留率为91.6％。环异麦芽四糖是仅被小肠粘膜酶轻微分解的难消化的糖类。

<实验16：环异麦芽四糖的热稳定性>

将实验3-1中得到的纯度99.5质量％的环异麦芽四糖结晶制剂溶解于去离子水中，制备浓度为7w/v％的环异麦芽四糖水溶液。用带螺旋盖的玻璃制离心管采集该水溶液8ml并密封，然后在120℃下加热30分钟至90分钟。对于加热前和各加热时间后的水溶液，进行着色度的测定和基于HPLC法的环异麦芽四糖的纯度测定。着色度设定为1cm样品池的480nm处的吸光度。将结果示于表8中。

[表8]

由表8的结果表明，环异麦芽四糖水溶液即使在120℃的高温下加热也不会着色，也没有观察到因分解而导致的纯度降低，判明环异麦芽四糖是对热稳定的糖类。

<实验17：环异麦芽四糖的pH稳定性>

将实验3-1中得到的环异麦芽四糖结晶制剂溶解于各种缓冲液中，制备环异麦芽四糖浓度为4w/v％、将pH调节为3至9的7种环异麦芽四糖水溶液。用带螺旋盖的玻璃制离心管采集各个水溶液8ml并密封，然后在100℃下加热24小时。自然冷却后，与实验16同样地进行这些水溶液的着色度的测定和基于HPLC法的环异麦芽四糖的纯度测定。将结果示于表9中。

[表9]

由表9表明，环异麦芽四糖在100℃下加热24小时、在pH4至9的范围内实质上没有分解，可知在从弱酸性到弱碱性的宽范围内是稳定的。然而，在pH3时轻微分解，可观察到纯度降低。

下面，通过实施例进一步详细地说明本发明。然而，本发明并不受这些实施例限定。

实施例1

将由市售的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)15g/L、酵母提取物(商品名“Powdery Yeast Extract SH”，日本制药株式会社销售)1.0g/L、多肽(商品名“HiPolypeptone”，日本制药株式会社销售)5.0g/L、磷酸二钾1.0g/L、二水合磷酸二氢钠0.6g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、五水硫酸锰0.01g/L、碳酸钙3.0g/L和水组成的液体培养基(pH 6.8)以各100mL的量加入50个容量500ml的锥形瓶中，在高压釜中、121℃下灭菌20分钟并进行冷却。然后，接种阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)，在27℃、240rpm的条件下进行旋转振荡培养4天。培养后，将培养液进行离心分离(12,000rpm，10分钟)以去除菌体，得到培养上清液。进而，将该培养上清液约4.8L进行UF膜浓缩，回收含有0.70U/mL的本发明的环异麦芽四糖生成酶的浓缩酶液1,100mL作为粗酶液。

实施例2

将酵母提取物(商品名“Powdery Yeast Extract SH”，日本制药株式会社销售)变更为其它酵母提取物(商品名“Yeast Extract Meast Granule S”，Asahi Food&Healthcare Co.,Ltd.销售)，另外，将多肽(商品名“HiPolypeptone”，日本制药株式会社销售)变更为(商品名“Hyeast S”，不二制油株式会社销售),制备除此以外与实施例1相同组成的液体培养基(pH 6.8)，以各100mL的量加入50个容量500ml的锥形瓶中，在高压釜中、121℃下灭菌20分钟并进行冷却。然后，接种解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)，在27℃、240rpm的条件下进行旋转振荡培养4天。培养后，将培养液进行离心分离(12,000rpm，10分钟)以去除菌体，得到培养上清液。进而，将该培养上清液约4.7L进行UF膜浓缩，回收含有0.41U/mL的本发明的环异麦芽四糖生成酶的浓缩酶液920mL作为粗酶液。

实施例3

在含有2％(w/v)的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)、0.006％(w/v)的作为防腐剂的桧醇的50mM乙酸缓冲液(pH 6.0)10L中，添加相对于每1g右旋糖酐为5单位的通过实施例1的方法得到的含有源于阿格雷氏菌种D1110(NITE BP-02815)的环异麦芽四糖生成酶的粗酶液，使其在40℃下反应24小时，结果反应物含有相对固体成分为11.2质量％的环异麦芽四糖和1.8质量％的异麦芽四糖。通过将反应液在95℃下热处理30分钟而使酶失活并冷却后，用截留分子量10,000的UF膜进行过滤，进一步去除高分子，得到含有相对固体成分为62质量％的环异麦芽四糖和12.8质量％的异麦芽四糖的糖液。对于所得到的滤液，依照常规方法，用活性炭进行脱色，通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐来纯化，进一步进行浓缩，得到浓度60质量％的糖浆。以得到的糖浆为糖液，使用强酸性阳离子交换树脂(AMBERLITE CR-1310、Na型、Organo Co.,Ltd.制造)进行柱分级。将树脂填充于4根内径5.4cm的带夹套的不锈钢制柱中，并串联连接而使树脂层全长20m。在维持柱内温度60℃的同时，向树脂中加入5v/v％的糖液，以SV0.13向其中流入60℃的热水进行分馏，用HPLC法监测洗脱液的糖组成，采集含有环异麦芽四糖的馏分，进行浓缩而得到环异麦芽四糖溶液(环异麦芽四糖纯度98.6质量％)。接着，按照实验3-1记载的方法使环异麦芽四糖结晶，得到纯度99.8质量％的五水环异麦芽糖四糖结晶。本品不具有还原力，作为品质改良剂、稳定剂、赋形剂、粉末化基材等，可以有效地用于各种食品饮料、化妆品、药品等各种组合物中。

实施例4

在含有2.5％(w/v)的右旋糖酐(商品名“Dextran T70”，Pharmacosmos公司制造)、0.006％(w/v)的作为防腐剂的桧醇的50mM乙酸缓冲液(pH 6.0)20L中，添加相对于每1g右旋糖酐为5单位的通过实施例2的方法得到的含有源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITEBP-02816)的环异麦芽四糖生成酶的粗酶液，使其在35℃下反应48小时，结果反应物含有相对固体成分为9.7质量％的环异麦芽四糖和2.0质量％的异麦芽四糖。通过将反应液在95℃下热处理30分钟而使酶失活并冷却后，用截留分子量10,000的UF膜进行过滤，进一步去除高分子，得到含有相对固体成分为62质量％的环异麦芽四糖和12.8质量％的异麦芽四糖的糖液。将所得到的糖液进一步浓缩、粉末化，得到含环异麦芽四糖的粉末。本品含有相对固体成分为64质量％的环异麦芽四糖、13质量％的异麦芽四糖和25质量％的葡萄糖聚合度为7或以上的其他糖类。本品作为品质改良剂、稳定剂、赋形剂、粉末化基材等，可以有效地用于食品饮料、化妆品、药品等各种组合物中。

实施例5

将市售的玉米淀粉悬浮于含有1mM氯化钙的20mM乙酸缓冲液(pH5.5)中以使其浓度达到30质量％后，进行加热溶解，在将其冷却至50℃的原料溶液中，添加相对于底物固体成分分别为10单位、1,000单位和10单位的国际公开号WO2008/136331小册子中公开的α-葡糖基转移酶、异淀粉酶(淀粉脱支酶)和α-淀粉酶(商品名“KLEISTASE E5CC”，Amano EnzymeCo.,Ltd.销售)，使其在温度50℃下反应72小时，接下来，通过在100℃下加热15分钟而使酶失活，制备含有具有α-1,6葡聚糖作为部分结构的支链α-葡聚糖混合物的反应液。

用含有1mM氯化钙的100mM乙酸缓冲液(pH6.0)稀释上述得到的含有支链α-葡聚糖混合物的一部分反应液以使其浓度达到1.0质量％，添加相对于每1g底物固体成分为2.2单位的通过实验8的方法得到的源于解单端孢菌素微杆菌D2006(NITE BP-02816)的环异麦芽四糖生成酶，使其在40℃下反应48小时，结果反应物含有相对于固体成分为8.1质量％的环异麦芽四糖、5.7质量％的异麦芽四糖、4.2质量％的异麦芽三糖、5.0质量％的异麦芽糖。由此可知，通过组合使用由淀粉生成具有α-1,6葡聚糖作为部分结构的糖类的酶和环异麦芽四糖生成酶，可以由淀粉底物制造环异麦芽四糖。

实施例6

<环异麦芽四糖的葡糖基衍生物>

使用以无水物换算计为0.5g的通过实施例3的方法得到的五水环异麦芽四糖结晶和2.5g市售的α-环糊精(商品名“CAVAMAX W6food”、Cyclochem公司销售)分别作为糖转移反应的受体和糖供体，溶解于含有1mM氯化钙的50mM乙酸缓冲液(pH 5.5)50mL中，将所得到的溶液作为底物溶液。向该底物溶液中添加相对于每1g糖供体为2单位的源于diovatilusstearothermophyllus的CGTase作为糖转移酶，使其在50℃下反应24小时后，通过在100℃下加热10分钟而使酶促反应停止。接着，向得到的反应液中添加相对于每1g糖供体为10单位的市售的葡糖淀粉酶(商品名“Glucoteam#2000”，Nagase Chemtex Corporation销售)，进一步使其在50℃下反应24小时后，通过在100℃下加热10分钟而使酶促反应停止。在得到的葡糖淀粉酶处理液中添加氢氧化钠调节至pH13.0后，在105℃下高压灭菌1小时进行碱处理，使葡糖淀粉酶处理液中的还原糖分解。进而通过常规方法对碱处理液进行脱盐、浓缩、过滤，得到含有环异麦芽四糖的葡糖基衍生物的糖液。

将上述得到的含有环异麦芽四糖的葡糖基衍生物的糖液供于下述条件的HPLC分析，将得到的谱图示于图22中。

(HPLC条件)

色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ303(4.6mm×250mm)(YMC Co.,Ltd.制造)

洗脱液：水/甲醇(95:5，v/v)

柱温：40℃

流速：0.7mL/分钟

检测：差示折射率计

如图22所示，在保留时间6.47分钟处观察到环异麦芽四糖的峰，在保留时间9.12分钟和11.36分钟处观察到认为是环异麦芽四糖的葡萄糖基衍生物的两个糖类峰，另外，在保留时间19.1分钟处观察到作为糖供体的α-环糊精的峰，在保留时间47.7分钟处观察到认为是由α-环糊精生成的β-环糊精的峰。将在保留时间9.12分钟和11.36分钟处洗脱的糖类分别设定为葡糖基衍生物A和B。含有葡糖基衍生物的糖液中的葡糖基衍生物A的含量为31.6质量％，葡糖基衍生物B的含量为15.8质量％。

将含有葡萄糖基衍生物的糖液供于使用ODS柱(商品名“D-ODS-5”，YMC Co.,Ltd.制造)的分取HPLC，分别分取葡萄糖基衍生物A和B，由此得到229mg纯度99.2质量％的葡萄糖基衍生物A和117mg纯度98.0质量％的葡萄糖基衍生物B。将葡萄糖基衍生物A和B供于实验2中使用的LC/MS分析和NMR分析，结果判明：葡萄糖基衍生物A的分子量为810，是具有一分子D-葡萄糖介由α-1,4键键合于构成环异麦芽四糖的四个葡萄糖残基内一残基的结构的五糖，是环异麦芽四糖的单葡萄糖基衍生物。另外判明：葡萄糖基衍生物B的分子量为972，是具有两分子D-葡萄糖分别介由α-1,4键键合于构成环异麦芽四糖的四个葡萄糖残基内位于对角线的两个葡萄糖残基的结构的六糖，是环异麦芽四糖的二葡萄糖基衍生物。将环异麦芽四糖的葡萄糖基衍生物A和B的结构示于图23中。

实施例7

<硬糖果>

在100质量份浓度55％的蔗糖溶液中加热混合30质量份通过实施例3的方法得到的五水环异麦芽四糖结晶，然后，在减压下加热浓缩至水分低于2％，在其中混合0.6质量份柠檬酸和适量的柠檬香精、色素，按照常规方法进行成型，得到产品。本品是稳定、高品质的硬糖，其脆度、口感、风味均良好，由于含有环异麦芽四糖，因此不会出现蔗糖结晶，吸湿性低，不会发生流挂。

实施例8

<巧克力饼干>

使用140质量份小麦粉(蛋糕粉)、90质量份黄油、115质量份巧克力、360质量份砂糖、200质量份全蛋、200质量份杏仁、30质量份通过实施例4的方法制备的含环异麦芽四糖的粉末，通过常规方法制备巧克力饼干。将本品在室温下储存2周后，进行了品尝，结果没有吸湿或干燥，而且，环异麦芽四糖抑制油脂的氧化或分解，良好地保持了刚制造后的风味。

实施例9

<乳酸菌饮料>

将175质量份脱脂奶粉、30质量份通过实施例4的方法得到的含环异麦芽四糖的粉末和70质量份高含量乳糖粉末(林原株式会社销售，注册商标“NYUKA-OLIGO”)溶解于1500质量份水中，在65℃下灭菌30分钟，冷却至40℃后，按照常规方法在其中植菌30质量份乳酸菌的启动剂，并在37℃下培养8小时，得到乳酸菌饮料。本品适合作为乳酸菌饮料，其风味良好，含有低聚糖、环异麦芽四糖，不仅稳定地保持乳酸菌，而且具有双歧杆菌促生长作用、调节肠道作用。

实施例10

<沐浴露>

适量加入15质量份月桂酸钾、5.0质量份肉豆蔻酸钾，4.0质量份通过实施例4的方法得到的含环异麦芽四糖的粉末、2.0质量份丙二醇、0.5质量份聚乙烯粉末、0.5质量份羟丙基壳聚糖溶液、0.25质量份甘氨酸、0.25质量份谷氨酰胺、0.1质量份201号光敏染料、适量的苯酚、pH调节剂、薰衣草水后，加入纯净水而使其总量为100质量份，通过常规方法进行乳化而制备沐浴露。本品是起泡性好、使用感优异的沐浴露。另外，本品可有效地用于预防体臭、预防瘙痒、或用于治疗和预防皮肤老化等。另外，由于本品含有环异麦芽四糖，因此保湿性优异，而且对皮肤的刺激性小，因此，使用时无需担心过敏症。

实施例11

<化妆霜>

按照常规方法将2质量份聚氧乙二醇单硬脂酸酯、5质量份自乳化单硬脂酸甘油酯、2质量份通过实施例3的方法得到的五水环异麦芽四糖结晶、1质量份α-葡糖基芦丁(林原株式会社销售，商品名“αG rutin”)、1质量份液体石蜡、10质量份三辛酸甘油酯和适量防腐剂加热溶解，在其中加入2质量份L-乳酸、5质量份1,3-丁二醇和66质量份纯净水，用均质器进行乳化，进而加入适量香料后进行搅拌混合，制造化妆霜。本品的环异麦芽四糖可稳定α-葡糖基芦丁的抗氧化能力，可有效地用作高品质防晒霜、美肤剂、美白剂等。

实施例12

<牙膏>

将45质量份磷酸氢钙、1.5质量份十二烷基硫酸钠、25质量份甘油、0.5质量份聚氧乙烯山梨醇月桂酸酯、10质量份通过实施例3的方法得到的五水环异麦芽四糖结晶、0.02质量份糖精和18质量份水混合而得到牙膏。本品在不降低表面活性剂的去污力的情况下改善了不快感，且使用后的感觉也良好。

产业上的可利用性

根据本发明，能够使用环异麦芽四糖生成酶来制造、提供环异麦芽四糖或含环异麦芽四糖的糖类，所述环异麦芽四糖是具有四分子的D-葡萄糖介由α-1,6糖苷键以环状连接的结构的新型糖类。能够提供完全新型的环异麦芽四糖的本发明对食品饮料、化妆品、药品等各种应用领域都有贡献，其产业上的意义非常大。

符号的说明

在图1中，

道1：异麦芽低聚糖标记物

道2：异麦芽三糖标准品

道3：异麦芽四糖标准品

道4：使源于微生物D1110菌株的粗酶作用于右旋糖酐底物而得到的酶反应物

G：葡萄糖

IG2：异麦芽糖

IG3：异麦芽三糖

IG4：异麦芽四糖

I：未知糖类

在图中4、图6和图7中，

虚线是申请人添加的辅助线以方便信号归属

1H：键合于D-葡萄糖的1位碳的质子

2H：键合于D-葡萄糖的2位碳的质子

3H：键合于D-葡萄糖的3位碳的质子

4H：键合于D-葡萄糖的4位碳的质子

5H：键合于D-葡萄糖的5位碳的质子

6Ha和6Hb：键合于D-葡萄糖6位碳的质子

在图6和图7中，

1C：D-葡萄糖的1位碳

2C：D-葡萄糖的2位碳

3C：D-葡萄糖的3位碳

4C：D-葡萄糖的4位碳

5C：D-葡萄糖的5位碳

6C：D-葡萄糖的6位碳

在图10中，

↓:五水环异麦芽四糖结晶的粉末X射线衍射图中的特征衍射峰在图19中，

ORF9038：编码源于阿格雷氏菌种D1110的环异麦芽四糖生成酶基因的氨基酸序列

ORF5328：编码源于解单端孢菌素微杆菌D2006的环异麦芽四糖生成酶基因的氨基酸序列

在图20中，

f1ori：f1噬菌体复制起点

Ampicillin：氨苄青霉素抗性基因

pUC ori：pUC复制起点

P

RBS：核糖体结合位点

ATG：初始密码子

黑箭头：环异麦芽四糖生成酶基因

在图21中，

Dex:右旋糖酐

CI-4：环异麦芽四糖

在图22中，

CI-4：环异麦芽四糖

A：环异麦芽四糖衍生物A

B：环异麦芽四糖衍生物B

α-CD：α-环糊精

β-CD：β-环糊精。

在图23中，

(A)衍生物A：环异麦芽四糖的葡糖基衍生物；

(B)衍生物B：环异麦芽四糖的二葡糖基衍生物。

序列表

<110> 株式会社林原

<120> 环异麦芽四糖、环异麦芽四糖生成酶和它们的制造方法以及用途

<130> 10130502

<160> 12

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

AGAGTTTGAT CATGGCTCAG 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TACGGTTACC TTGTTACGAC TT 22

<210> 3

<211> 1447

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC GATGAAGCTC CAGCTTGCTG 60

GGGTGGATTA GTGGCGAACG GGTGAGTAAC ACGTGAGTAA CCTGCCCTTG ACTCTGGGAT 120

AAGCGTTGGA AACGACGTCT AATACCGGAT ATGACGACCG ATGGCATCAT CTGGTTGTGG 180

AAAGAATTTT GGTCAAGGAT GGACTCGCGG CCTATCAGGT AGTTGGTGAG GTAATGGCTC 240

ACCAAGCCTA CGACGGGTAG CCGGCCTGAG AGGGTGACCG GCCACACTGG GACTGAGACA 300

CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC GAAAGCCTGA 360

TGCAGCAACG CCGCGTGAGG GATGACGGCC TTCGGGTTGT AAACCTCTTT TAGTAGGGAA 420

GAAGCGAAAG TGACGGTACC TGCAGAAAAA GCACCGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG 480

GTAATACGTA GGGTGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGAGCT CGTAGGCGGT 540

TTGTCGCGTC TGCTGTGAAA ACTGGAGGCT CAACCTCCAG CCTGCAGTGG GTACGGGCAG 600

ACTAGAGTGC GGTAGGGGAG ATTGGAATTC CTGGTGTAGC GGTGGAATGC GCAGATATCA 660

GGAGGAACAC CGATGGCGAA GGCAGATCTC TGGGCCGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG 720

CATGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCATG CCGTAAACGT TGGGAACTAG 780

ATGTAGGGGC CATTCCACGG TTTCTGTGTC GCAGCTAACG CATTAAGTTC CCCGCCTGGG 840

GAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAG 900

CATGCGGATT AATTCGATGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ATACGAGAAC 960

GGGCTAGAAA TAGTCAACTC TTTGGACACT CGTAAACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG 1020

CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTCGT TCTATGTTGC 1080

CAGCACGTTA TGGTGGGAAC TCATAGGAGA CTGCCGGGGT CAACTCGGAG GAAGGTGGGG 1140

ATGACGTCAA ATCATCATGC CCCTTATGTC TTGGGCTTCA CGCATGCTAC AATGGCCGGT 1200

ACAAAGGGCT GCGATACCGT AAGGTGGAGC GAATCCCAAA AAGCCGGTCT CAGTTCGGAT 1260

TGAGGTCTGC AACTCGACCT CATGAAGTCG GAGTCGCTAG TAATCGCAGA TCAGCAACGC 1320

TGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CAAGTCATGA AAGTCGGTAA 1380

CACCCAACGC CAGTGGCCTA ACCCGTAAGG GAGGGAGCTG TCTAAGGTGG GATCGGTGAT 1440

TAGGACT 1447

<210> 4

<211> 1485

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

GAGTTTGATC ATGGCTCAGG ATGAACGCTG GCGGCGTGCT TAACACATGC AAGTCGAACG 60

GTGAAGCCAA GCTTGCTTGG TGGATCAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGAGCAACCT 120

GCCCTGGACT CTGGGATAAG CGCTGGAAAC GGCGTCTAAT ACTGGATATG AGCTCTCATC 180

GCATGGTGGG GGTTGGAAAG ATTTTTTGGT CTGGGATGGG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 240

TGGTGAGGTA ATGGCTCACC AAGGCGTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 300

ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC 360

AATGGGCGGA AGCCTGATGC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 420

CCTCTTTTAG CAAGGAAGAA GCTTTTGTGA CGGTACTTGC AGAAAAAGCG CCGGCTAACT 480

ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG CGCAAGCGTT ATCCGGAATT ATTGGGCGTA 540

AAGAGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCTGC TGTGAAATCC CGAGGCTCAA CCTCGGGCCT 600

GCAGTGGGTA CGGGCAGACT AGAGTGCGGT AGGGGAGATT GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 660

GGAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGA TGGCGAAGGC AGATCTCTGG GCCGTAACTG 720

ACGCTGAGGA GCGAAAGGGT GGGGAGCAAA CAGGCTTAGA TACCCTGGTA GTCCACCCCG 780

TAAACGTTGG GAACTAGTTG TGGGGTCCTT TCCACGGATT CCGTGACGCA GCTAACGCAT 840

TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGAC 900

CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC 960

TTGACATACA CGAGAACATC CCAGAAATGG GGGACTCTTT GGACACTCGT GAACAGGTGG 1020

TGCATGGTTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA 1080

CCCTCGTTCT ATGTTGCCAG CACGTAATGG TGGGAACTCA TGGGATACTG CCGGGGTCAA 1140

CTCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGTCTTG GGCTTCACGC 1200

ATGCTACAAT GGCCGGTACA AAGGGCTGCA ATACCGTGAG GTGGAGCGAA TCCCAAAAAG 1260

CCGGTCCCAG TTCGGATTGA GGTCTGCAAC TCGACCTCAT GAAGTCGGAG TCGCTAGTAA 1320

TCGCAGATCA GCAACGCTGC GGTGAATACG TTCCCGGGTC TTGTACACAC CGCCCGTCAA 1380

GTCATGAAAG TCGGTAACAC CTGAAGCCGG TGGCCCAACC CTTGTGGAGG GAGCCGTCGA 1440

AGGTGGGATC GGTAATTAGG ACTAAGTCGT AACAAGGTAA CCGTA 1485

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 阿格雷氏菌种

<400> 5

Ala Thr Val Gly Asp Ala Trp Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Pro

1 5 10 15

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 解单端孢菌素微杆菌

<400> 6

Ala Asp Leu Gly Asp Ala Trp Thr Asp

1 5

<210> 7

<211> 810

<212> PRT

<213> 阿格雷氏菌种

<400> 6

Ala Thr Val Gly Asp Ala Trp Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Pro Gly

1 5 10 15

Gln Gln Val Thr Val Thr Ala Glu Val Asp Gly Ser Gly Pro Val Glu

20 25 30

Phe Ser Leu Val His Leu Gly Glu Thr Val Arg Thr Gly Thr Val Gln

35 40 45

Ala Thr Gly Ser Gly Thr Val Thr Trp Thr Val Thr Pro Pro Thr Thr

50 55 60

Asp Phe Thr Gly Tyr Leu Val His Ala Asp Ala Gly Gly Ser Thr Ala

65 70 75 80

Gln Thr Ala Val Asp Val Ser Ser Thr Trp Thr Arg Phe Pro Arg Met

85 90 95

Gly Tyr Leu Asp Glu Tyr Pro Ala Asp Ser Thr Gln Ala Asp Arg Asp

100 105 110

Ala Ile Val Thr Asp Leu Ala Asn Lys Tyr His Leu Asn Ala Leu Gln

115 120 125

Phe Tyr Asp Trp Met Trp Arg His Glu Ala Pro Ile Glu Arg Asp Gly

130 135 140

Asn Gly Asp Leu Val Gly Thr Trp Thr Ala Trp Asn Gly Asp Val Ile

145 150 155 160

Ala Pro Ala Thr Val Ser Gly Leu Val Asp Ala Gly His Ala Val Asn

165 170 175

Val Ala Ala Leu Pro Tyr Ser Met Ser Tyr Ala Ala Leu Glu Gly Phe

180 185 190

Glu Ala His Gly Val Asp Ala Asp Trp Arg Leu Lys Tyr Arg Ser Asp

195 200 205

Ser Ser Asp Trp Lys Phe Gln Met Leu Pro Gly Arg Pro Asp Thr Asn

210 215 220

Leu Trp Ile Met Asn Pro Ser Asn Pro Asp Trp Arg Asp His Ile Ser

225 230 235 240

Ala Glu Tyr Gln Asp Gln Ile Asp Thr Phe Gly Phe Asp Gly Thr His

245 250 255

Leu Asp Gln Leu Gly Asn Trp Gly Ser Gly Ala Ser Asp Gly Gly Met

260 265 270

Asn Asp Val Ala Gly Asn Pro Val Asp Ile Pro Val Gly Phe Arg Asp

275 280 285

Leu Val Ala Glu Thr Lys Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Gly Phe Asn

290 295 300

Ala Val Asp Gly Phe Ala Gly Ser Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ser Asp

305 310 315 320

Tyr Leu Tyr Thr Glu Leu Trp Glu Asn His Glu Thr Tyr Ser Glu Val

325 330 335

Gln Ser Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Ala Ala

340 345 350

Val Thr Ala Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Ser Asn Thr Gly Asp Arg Tyr

355 360 365

Glu Ala Glu Asp Gly Thr Leu Ile Gly Val Gln Val Asn Ser Asn His

370 375 380

Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gln Phe Gly Asp Val Gly

385 390 395 400

Asp Ser Val Thr Leu Ser Val Thr Val Pro Glu Ser Arg Arg Tyr Gly

405 410 415

Ile Val Pro Ala Trp Ala Asn Asp Thr Ala Thr Thr Ala Thr Arg Thr

420 425 430

Val Arg Val Asp Gly Val Pro Ala Gly Lys Leu Lys Met Thr Pro Thr

435 440 445

Gly Ser Trp Asp Ser Trp Asn Thr Glu Ala Gly Phe Gly Thr Tyr Leu

450 455 460

Ser Ala Gly Ser His Thr Ile Glu Val Ser Leu Asp Ala Gly Asp Thr

465 470 475 480

Gly Phe Ala Asn Leu Asp Ser Ile Thr Leu Gly Thr Phe Asn Thr Pro

485 490 495

Ser Val Gln Leu Ala Asn Ala Ala Leu Ala Ala Ser Gly Ala Ser His

500 505 510

Ile Glu Met Gly Gln Gly Asp Gln Met Leu Val Ala Pro Tyr Phe Leu

515 520 525

Asp Asp Ser Lys Gln Met Ser Thr Glu Leu Gln Ala Trp Met Glu Ser

530 535 540

Tyr Tyr Asp Val Ile Thr Gly Tyr Glu Asn Leu Leu Tyr Gly Pro Thr

545 550 555 560

Leu Arg Gln Leu Pro Asn Ala Val Ser Ile Ala Gly His Thr Thr Ser

565 570 575

Thr Asp Gly Thr Gly Asp Thr Ile Trp Ala Thr Pro Met Arg Asn Asp

580 585 590

Gly Met Asp Val Leu His Leu Ile Asn Leu Glu Gly Asn Asp Gly Arg

595 600 605

Trp Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Thr Leu Ser Asn Leu Pro Val

610 615 620

Lys Tyr Tyr Leu Ala Asp Arg Pro Val Pro Ala Asp Val Arg Ile Ala

625 630 635 640

Ser Pro Asp Asn Gly Gly Arg Ser Ser Thr Leu Ala Phe Thr Ser Gly

645 650 655

Ser Asp Ala Gly Gly Asn Tyr Ile Ser Phe Thr Val Pro Glu Leu Lys

660 665 670

Asn Trp Ser Phe Val Tyr Leu Gly Asp Ser Thr Arg Gly Asn Gly Asn

675 680 685

Val Val Thr Gln Ala Ser Thr Cys Leu Asp Val Ala Gly Gly Asn Ser

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Ala Asp Gly Thr Ala Val Gln Val Trp Asn Cys Ala Ser Val Pro Ala

705 710 715 720

Met Gln Trp Thr Phe Gln Asn Asn Thr Leu Ser Ala Leu Gly Lys Cys

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Leu Asp Leu Val Ala Gly Gly Thr Ala Asp Gly Thr Leu Ala His Leu

740 745 750

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755 760 765

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Gly Ser Thr Ala Asn Gly Thr Arg Ala His Leu Trp Ser Cys His Ala

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Gly Ala Ser Gln Lys Trp Thr Leu Pro Gln

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<210> 8

<211> 811

<212> PRT

<213> 解单端孢菌素微杆菌

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65 70 75 80

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165 170 175

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Glu Gln Tyr Ala Asp Gln Ile Asp Ala Leu Gly Phe Asp Gly Thr His

245 250 255

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260 265 270

Asp Val Ala Gly Asp Pro Val Asp Ile Pro Gln Gly Phe Ala Asn Leu

275 280 285

Val Ala Ala Thr Lys Asp Ala Thr Gly Lys Thr Thr Gly Phe Asn Ala

290 295 300

Val Asp Gly Phe Gly Ser Asp Trp Leu Ala Gly Ser Glu Ser Asp Tyr

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

Leu Ala Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Ser Asn Thr Gly Asp Gln Tyr Glu

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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465 470 475 480

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485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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545 550 555 560

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565 570 575

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610 615 620

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625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

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690 695 700

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705 710 715 720

Ala Gln Asp Trp Asp Tyr Ala Gly Glu Lys Leu Ser Ala Leu Gly Lys

725 730 735

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740 745 750

Leu Trp Asp Cys Ala Asn Val Pro Ser Gln Gln Trp Val Arg Thr Ala

755 760 765

Gln Ser Gln Tyr Tyr Asn Pro Ala Ser Gly Arg Cys Leu Asp Thr Val

770 775 780

Gly Gly Gly Ala Ala Asn Gly Thr Arg Ile His Leu Trp Asp Cys His

785 790 795 800

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805 810

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<212> DNA

<213> 阿格雷氏菌种

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420 425 430

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755 760 765

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485 490 495

acg gcc gga acc cac acc atc acc ctc gcc gtg ggc tcc ggg gac acc 1536

Thr Ala Gly Thr His Thr Ile Thr Leu Ala Val Gly Ser Gly Asp Thr

500 505 510

ggc tac gtc aac ctc gac agc gtc acg ctg ggc act ttc gac aca ccc 1584

Gly Tyr Val Asn Leu Asp Ser Val Thr Leu Gly Thr Phe Asp Thr Pro

515 520 525

tca gta cag ctc gcc aac gcc gcg ttc gcg gcg aac ggg gca tcg cac 1632

Ser Val Gln Leu Ala Asn Ala Ala Phe Ala Ala Asn Gly Ala Ser His

530 535 540

atc gag atg ggc cag ggc gac cag atg ctc gtc gcg ccc tac ttc ctc 1680

Ile Glu Met Gly Gln Gly Asp Gln Met Leu Val Ala Pro Tyr Phe Leu

545 550 555 560

gac gaa acc aag cag atg aac cac gaa ctg caa ggg tgg ttg gag aag 1728

Asp Glu Thr Lys Gln Met Asn His Glu Leu Gln Gly Trp Leu Glu Lys

565 570 575

tac tac gac gtc atc acc ggc tac gag aac ctc ttc tac ggc ccc acc 1776

Tyr Tyr Asp Val Ile Thr Gly Tyr Glu Asn Leu Phe Tyr Gly Pro Thr

580 585 590

ctc cgt cag cta tcg aac gcc gtg acc atc agc ggt caa ccg aca agc 1824

Leu Arg Gln Leu Ser Asn Ala Val Thr Ile Ser Gly Gln Pro Thr Ser

595 600 605

acg gac ggc gct gcg aac acg gtc tgg acc aat gtg atg cgc aac gac 1872

Thr Asp Gly Ala Ala Asn Thr Val Trp Thr Asn Val Met Arg Asn Asp

610 615 620

ggc atc gac gtc atc cat ctc atc aac ttg aag ggc aac aac ggc agc 1920

Gly Ile Asp Val Ile His Leu Ile Asn Leu Lys Gly Asn Asn Gly Ser

625 630 635 640

tgg cgc gac ccg gcc gcg aca cca tcc acc ctc acc aac ctg ccc gtc 1968

Trp Arg Asp Pro Ala Ala Thr Pro Ser Thr Leu Thr Asn Leu Pro Val

645 650 655

aag tac tac ctc ggc gat agc cca gtg cct gca tcc gtg cac gtt gcg 2016

Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Ser Pro Val Pro Ala Ser Val His Val Ala

660 665 670

agc ccc gac cga gac ggc ggc cgt tcc acc gca ctg ccc ttc acc acg 2064

Ser Pro Asp Arg Asp Gly Gly Arg Ser Thr Ala Leu Pro Phe Thr Thr

675 680 685

gga tcg gac gcg aac ggc acg tac ctg agc ttc acc gtg ccc gag ctg 2112

Gly Ser Asp Ala Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Phe Thr Val Pro Glu Leu

690 695 700

aag agc tgg gac ttc gtc tac ctg ggc gat tcc acc gcc ggc aac ggc 2160

Lys Ser Trp Asp Phe Val Tyr Leu Gly Asp Ser Thr Ala Gly Asn Gly

705 710 715 720

aac gtc gtc acc aag gcg agc aag tgc ctc gac gtc gcc ggc gga agt 2208

Asn Val Val Thr Lys Ala Ser Lys Cys Leu Asp Val Ala Gly Gly Ser

725 730 735

gcg gcg aac gga acc gct gtc cag atc tgg gac tgc gcc agc gtg ccc 2256

Ala Ala Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Trp Asp Cys Ala Ser Val Pro

740 745 750

gcc cag gac tgg gac tac gcg ggc gag aag ctc tcc gcg ctg ggc aag 2304

Ala Gln Asp Trp Asp Tyr Ala Gly Glu Lys Leu Ser Ala Leu Gly Lys

755 760 765

tgc ctc gac ctg tat cag ggt ggc acc gcg aac ggg acc ctc gcg cac 2352

Cys Leu Asp Leu Tyr Gln Gly Gly Thr Ala Asn Gly Thr Leu Ala His

770 775 780

ctg tgg gac tgc gcc aac gtg ccc agc cag cag tgg gta cgg acc gcc 2400

Leu Trp Asp Cys Ala Asn Val Pro Ser Gln Gln Trp Val Arg Thr Ala

785 790 795 800

cag tcg cag tac tac aac ccc gcc agc ggc cgg tgc ctc gat acc gtc 2448

Gln Ser Gln Tyr Tyr Asn Pro Ala Ser Gly Arg Cys Leu Asp Thr Val

805 810 815

gga ggt ggt gcg gcg aac ggc acg cgc atc cac ctt tgg gat tgc cac 2496

Gly Gly Gly Ala Ala Asn Gly Thr Arg Ile His Leu Trp Asp Cys His

820 825 830

gcc gga ccc agc cag aaa tgg acg ctg ccg ggc 2529

Ala Gly Pro Ser Gln Lys Trp Thr Leu Pro Gly

835 840

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

GGAGATATAC ATATGGCAAC CGTCGGCGAC GCGTGG 36

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

GCTAGCCATA CCATGCTATT ACTGGGGCAG CGTCCACTTC TG 42

PCT/RO/134表