一种快速显色孤雌生殖诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用

摘要

本发明公开了一种快速显色孤雌生殖诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用。构建PZmBD1或PZmBD1、2RS5GPA启动子驱动控制花青素合成调控基因ZmC1，ZmR2的表达载体，创制了胚/籽粒富集花青素的转基因玉米，利用含有控制玉米孤雌生殖单倍体诱导的两主效基因Zmpla1/Zmmtl和Zmdmp的单倍体诱导系与上述花青素富集材料杂交，利用自交或回交的方式获得分离后代，最后利用分子标记检测同时含有纯合主效基因的单株，获得孤雌生殖单倍体诱导系。本发明的孤雌生殖单倍体诱导系可实现单倍体幼胚的提前鉴别与直接鉴别，显著提高单倍体幼胚鉴别效率，同时实现不同生育时期单倍体的鉴别，为提高单倍体育种效率提供了可行性方案。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速显色孤雌生殖单倍体诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用。

背景技术

玉米单倍体育种技术作为提升育种效率的重要技术之一，被广泛应用于玉米商业化育种当中（Andorf C, et al. 2019.）。玉米单倍体育种技术主要包括单倍体的诱导，鉴别，加倍和DH评价四个部分（陈绍江等2012）。其中单倍体的鉴别作为单倍体获得的直接方式而广受关注，如何在幼胚发育早期（授粉后15天左右）高效挑选单倍体幼胚是组培加倍单倍体的技术难题。目前最具实用价值的单倍体鉴别方法主要包括颜色标记鉴别和油分。油分鉴别单倍体已实现自动化，但需结合高油型诱导系和核磁共振技术而限制了其发展。利用颜色标记鉴别单倍体以其直观、简便的优点成为目前单倍体鉴别应用最为广泛的方法之一。Chase and Nanda (1965)将首次将

另外单倍体组培鉴别与加倍技术不断发展。常规孤雌生殖单倍体诱导系颜色标记表达不稳定大大限制了单倍体幼胚的鉴别效率，幼胚离体培养可实现单倍体幼胚的鉴别，但幼胚的剥取工作大大降低了组培鉴别单倍体幼胚的效率，若能在剥取幼胚时即使杂合幼胚显色，可避免所有幼胚离体培养，实现单倍体幼胚的直接鉴别，从而有效提高组培鉴别单倍体效率。孤雌生殖单倍体诱导系颜色标记要求共同驱动多个花青素合成相关基因，同时可在籽粒中特异性表达，若用于单倍体幼胚鉴别还对花青素表达时期有一定要求，目前尚无具备实际应用价值的利用花青素标记无需额外培养，直接鉴别单倍体幼胚的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速显色孤雌生殖单倍体诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用。

本发明利用胚或胚乳启动子驱动花青素合成相关基因，转化玉米得到花青素仅在玉米籽粒的胚和糊粉层积累的花青素富集玉米。将控制玉米籽粒花青素富集的目的基因转育到玉米孤雌生殖单倍体诱导系中，得到快速显色标记孤雌生殖单倍体诱导系。

一种快速显色孤雌生殖单倍体诱导系，其是利用含有控制玉米孤雌生殖单倍体两主效基因

所述快速显色孤雌生殖单倍体诱导系在鉴别玉米单倍体中的应用，在不进行离体培养的情况下，授粉后12天以上，直接根据花青素表达情况鉴别单倍体，杂交二倍体糊粉层和盾片均表现为有色；单倍体籽粒表现为糊粉层有色而盾片无色，杂交二倍体表现为有色糊粉层和盾片；单倍体芽苗表现为绿色或浅红色芽鞘和白色根，杂交二倍体表现为深紫色芽鞘和根；单倍体幼苗和植株叶片表现为绿色，杂交二倍体表现为紫色叶尖；无需借助任何设备直接鉴别获得单倍体幼胚、籽粒、芽苗、幼苗和植株。

所述快速显色孤雌生殖单倍体诱导系在鉴别玉米单倍体中的应用，用于鉴别常规种质及携带颜色抑制基因

所述快速显色孤雌生殖单倍体诱导系在鉴别玉米单倍体中的应用，用于单倍体诱导基因明确，可顺利表达玉米MYB家族转录因子，例如

一种胚特异积累花青素的玉米材料，利用含有参与调控花青素合成的MYB家族转录因子Zm

一种幼胚快速显色玉米孤雌生殖单倍体诱导系，利用含有控制玉米孤雌生殖单倍体诱导两主效基因

本发明的有益效果：利用本发明的孤雌生殖单倍体诱导系与常规玉米杂交，授粉后12天以上花青素即可大量生物合成与积累而有效鉴别单倍体。与常规孤雌生殖单倍体诱导系相比，利用本发明所创制孤雌生殖单倍体诱导系可实现单倍体幼胚的直接鉴别，且大大提高单倍体幼胚鉴别效率，减少取胚工作量及培养材料消耗。此外可对不同生育时期的单倍体，包括幼胚、籽粒、芽苗、幼苗和植株进行鉴别，实现单倍体的全方位多重鉴别，可大大提高单倍体鉴别的准确性。另外，本发明所创制孤雌生殖单倍体诱导系颜色标记可在不同母本材料背景中稳定表达，可用于常规孤雌生殖单倍体诱导系

附图说明

图1 为pBD-C1R2载体结构图。

图2为快速显色孤雌生殖单倍体诱导系选育流程。

图3为快速显色孤雌生殖单倍体诱导系诱导表现。

图4为快速显色孤雌生殖单倍体诱导系鉴别单倍体。

图5为分子标记鉴别单倍体（单倍体仅含有母本染色体组，表现为1条带，杂交二倍体既含有父本染色体组，又含有母本染色体组，表现为2条带）。

图6为流式细胞检测单倍体。

图7为K22单倍体幼胚鉴别。

图8为豫87-1单倍体幼胚鉴别。

图9 为p2Seed-C1R2载体结构图。

图10 为Lx103-1背景诱导郑单958单倍体鉴别效果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米（Zea mays L.）杂交种郑单958为本发明实施例中的母本（公众可从北京德农种业有限公司处获得）；玉米孤雌生殖单倍体诱导系：常规单倍体孤雌生殖诱导系CAU5，和CAU6, 在文献“董昕，2014，玉米单倍体诱导基因

实施例1 玉米孤雌生殖单倍体诱导系创制

一、玉米材料准备

2018年7月于北京上庄中国农业大学实验基地种植单倍体孤雌生殖诱导系CAU5和CAU6，中国农业科学院转基因基地种植Lx59，携带载体pBD-C1R2，载体结构见图1，当年进行组配F1，而后创制具有单倍体诱导能力同时含有目标表达载体的孤雌生殖单倍体诱导系。利用该孤雌生殖单倍体诱导系与母本材料郑单958进行杂交，进行单倍体鉴别准确率和单倍体诱导率统计，花青素颜色标记表达之后即可进行单倍体鉴别，本发明所创制孤雌生殖单倍体诱导系可鉴别授粉后12天至完全成熟单倍体，包括幼胚和成熟籽粒。

二、快速显色孤雌生殖单倍体诱导系的创制

分别用孤雌生殖单倍体诱导系与含有目标表达载体pBD-C1R2的Lx59植株杂交，而后采取回交的方式，同时结合分子标记逐代筛选同时含有表达载体和控制单倍体诱导主效基因

三、单倍体鉴别

常规孤雌生殖单倍体诱导系诱导鉴别单倍体幼胚可参考文献“Chen C , Xiao Z, Zhang J , et al. Development of in Vivo Haploid Inducer Lines for ScreeningHaploid Immature Embryos in Maize[J]. Plants, 2020, 9(6):739.”，常规孤雌生殖单倍体诱导系杂交后，

欧洲硬粒及部分温热带种质，因含有色素合成抑制基因，在单倍体诱导过程中，杂交果穗出现不同程度的盾片或糊粉层着色差的问题，大大限制单倍体育种技术在这些种质中的应用。本发明所创制孤雌生殖单倍体诱导系颜色标记不受材料背景影响，可直接用于这些因携带Zm

实施例2 玉米单倍体幼胚鉴别方法

一、单倍体的产生

1、杂交

（1）杂交亲本

以郑单958为母本，常规孤雌生殖单倍体诱导系CAU5为父本，杂交，得到杂交子代1；

以郑单958为母本，常规孤雌生殖单倍体诱导系CAU6为父本，杂交，得到杂交子代2；

以郑单958为母本，快速显色孤雌生殖单倍体诱导系为父本，杂交，得到杂交子代3；

（2）杂交具体方法

待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；花丝吐出后，同一时间剪花丝，第二天统一授粉，授粉15天左右，得到胚长为2.0-4.0 mm的杂交子代。

2、玉米幼胚的获得

取授粉后15天左右天杂交果穗，将果穗进行消毒剥取幼胚，具体步骤参考文献“Chen C , Xiao Z , Zhang J , et al. Development of in Vivo Haploid InducerLines for Screening Haploid Immature Embryos in Maize[J]. Plants, 2020, 9(6):739.”，所剥取的玉米幼胚，具有一片较大的子叶，即盾片，呈弧形隆起；近轴侧，面平，有较小的胚体，由胚芽、胚轴、胚根组成。

二、单倍体鉴别

孤雌生殖单倍体诱导系为CAU5或CAU6时，授粉后15天果穗籽粒无花青素合成，均表现为黄色籽粒，幼胚均无着色，需进行培养后，可根据幼胚盾片有无色素积累进行单倍体鉴别，杂交二倍体有色而单倍体幼胚无色。

孤雌生殖单倍体诱导系为快速显色诱导系时，授粉后12天即有可见花青素标记，在授粉后15天左右，即单倍体幼胚常规鉴别时期时，杂交二倍体幼胚及糊粉层已有大量花青素积累，因此在实际应用过程中可直接剥取无色幼胚即拟单倍体进行培养（图3，4）。

三、单倍体诱导率统计

取授粉后15天左右的杂交果穗，剥取幼胚，分别统计单倍体数（不显色幼胚）胚败育籽粒数（无胚但胚乳发育正常）和杂合籽粒数（显色幼胚），从而计算单穗单倍体诱导率=单倍体数/（单倍体数+胚败育籽粒数+杂合籽粒数）*100%。

表1 单倍体幼胚诱导率统计

四、单倍体准确率检测

随机选取192和194单株诱导郑单958单倍体61和51个，利用两对多态性分子标记检测单倍体，单倍体一条带，杂合二倍体两条带。（图5）结果显示，192和194诱导所得单倍体错选数分别为1和2株，单倍体准确率=（拟单倍体数-错选单倍体数）/拟单倍体数*100%，单倍体鉴别准确率均在95%以上，分别高达96.08%和98.36%。随机选取155株有色幼胚鉴定为拟二倍体，利用分子标记检测发现均为两条带，因此二倍体鉴别准确率为100%，单倍体漏选率为0。

分子标记检测：

Chr5-214.6-F(5’-3’): AGCAGCACATCTTGTGGATGAGA；

Chr5-214.6-R(5’-3’): CATCATGTTGAAGGGGCATTTGT；

Chr6-163.9-F(5’-3’): GGATGGGAGAACTGGGTGAGG；

Chr6-163.9-R(5’-3’): GCTCGGAAGGCAATGAAATCG；

表2 分子标记检测鉴别单倍体

细胞流式倍性检测：

选取分子标记筛选后单倍体幼胚进行成苗，而后随机选取20株进行流式细胞检测发现，均为单倍体（图6）。检测仪器：Partec CyFlow Space，试剂盒：Partec CyStain UVPrecise P。结果判定方法：样本峰值的荧光强度X-Mean（横坐标）与细胞DNA含量成正比，所以由各样本X-Mean之间的比例关系判断倍性。

五、单倍体是否还有孤雌生殖单倍体诱导系载体检测

利用Bar基因检测引物，对分子标筛选所得109棵单倍体进行检测，发现均为阴性，由此说明所得单倍体不携带转基因筛选标记Bar基因。所用引物：

Bar-F (5’-3’): GGCGGTCTGCACCATCGTC；

Bar-R (5’-3’): CATGCCAGTTCCCGTGCTTGA。

实施例3 对于含有

颜色抑制基因检测

对多个自交系进行

C1-IF(5’-3’): TACACTCGCCCTCATAGCAG

C1-IR(5’-3’): CAAACCTGCACCCACACAC

一、单倍体幼胚鉴别

2020年5月于北京中国农业大学实验站，种植

实施例4 单倍体的全方位多重标记鉴别

一、快速显色材料创制

在pBD-C1R2载体的基础上，添加2RS5GPA启动子携带控制花青素合成调控基因

二、快速显色孤雌生殖单倍体诱导系的创制

利用孤雌生殖单倍体诱导系CAU6与籽粒快速显色材料Lx103-1，进行杂交获得F

三、单倍体鉴别评价

利用携带p2Seed-C1R2载体的快速显色孤雌生殖单倍体诱导系，诱导郑单958，而后分别对授粉后15天左右单倍体幼胚、成熟籽粒、芽长1-3 cm芽苗，幼苗及植株进行鉴别，具体表现如下（见图10）：

单倍体幼胚的鉴别：利用携带p2Seed-C1R2载体的快速显色孤雌生殖单倍体诱导系与郑单958杂交后，在授粉后15天左右取胚，结果发现，杂交二倍体幼胚已有明显可见花青素累积，变现为紫色，单倍体幼胚变现为无色，即可实现单倍体幼胚的直接鉴别。

单倍体成熟籽粒的鉴别：利用携带p2Seed-C1R2载体的快速显色孤雌生殖单倍体诱导系与郑单958杂交后，收获成熟籽粒，结果发现，无论是杂交二倍体还是单倍体糊粉层均表现出明显的颜色标记，而籽粒胚部方面，杂交二倍体胚表现为紫红色，单倍体胚为无色，籽粒纵切可发现两者胚部花青素含量差异显著，即可实现单倍体的成熟籽粒的鉴别。

单倍体芽苗的鉴别：对利用携带p2Seed-C1R2载体的快速显色孤雌生殖单倍体诱导系与郑单958杂交后代成熟籽粒，进行催芽发苗，结果发现杂合二倍体表现出明显的紫色叶鞘和紫色根，而单倍体芽鞘表现为绿色或浅紫色，根为白色，因此根据胚芽鞘和根部颜色标记表现，可实现单倍体芽苗的鉴别。

单倍体幼苗及植株的鉴别：前述杂交二倍体与单倍体芽苗继续发育至两叶一心，杂交二倍体幼苗芽鞘及根仍表现为紫色，叶片尖部表现为紫色；而单倍体幼苗芽鞘仍为绿色或浅紫色，根为白色，叶片绿色，与杂合二倍体具备明显差异颜色标记表型，幼苗移栽田间，单倍体植株表现为绿色，杂交二倍体叶片及叶鞘表现为浅紫色，因此可实现单倍体幼苗及植株的鉴别。