免疫原性癌症筛选试验

摘要

本公开涉及用于确定人类受试者将发展癌症的风险的方法，所述方法包括定量受试者的HLA三联体(HLAT)，所述HLA三联体能够结合肿瘤相关抗原的氨基酸序列中的T细胞表位。本公开还涉及治疗确定具有升高的发生癌症的风险的受试者的方法。

说明书

技术领域

本文提供了基于受试者的HLA I类基因型确定受试者将发展癌症的风险的方法。本文进一步提供治疗癌症的方法，特别是对已确定具有升高的发生癌症的风险的受试者的预防性治疗。

背景技术

可能的筛选和早期诊断对于预防转移性疾病和改善许多癌症的预后是至关重要的。

可遗传的突变可增加发生癌症的风险，但已知的遗传因子不完全解释对癌症发生风险的遗传贡献。例如，在一般群体中5％的乳腺癌病例中已鉴定了BRCA1、BRCA2中的突变，但接近50％的这些病例发生乳腺癌。在过去十年中，解释发展癌症的遗传力的努力集中于高风险基因的发现和常见遗传变体的鉴定。

然而，本领域仍然需要更好地鉴定处于发展癌症的升高的遗传风险的个体。

发明内容

本文提供了涉及受试者的人白细胞抗原(HLA)I类基因型作为癌症发展的预测因子的方法。

在抗原呈现细胞(APC)中，蛋白抗原，包括肿瘤相关抗原(TAA)，被加工成肽。这些肽与HLA分子结合，并作为肽-HLA复合物呈递到细胞表面的T细胞上。不同的个体表达不同的HLA分子，不同的HLA分子呈递不同的肽。结合到个体中表达的单个HLA I类等位基因的TAA表位是必需的，但不足以诱导肿瘤特异性T细胞应答。相反，当TAA的表位被由个体的至少三个HLA I类基因(本文称为HLA三联体或“HLAT”)编码的HLA分子识别和呈递时(PCT/EP2018/055231、PCT/EP2018/055232、PCT/EP2018/055230、EP 3370065和EP 3369431)，肿瘤特异性T细胞应答被最佳地激活。

发明人已经开发了能够将患有癌症的受试者与背景群体分开的二元分类器。使用这种分类器，发明人能够证明HLA基因型和癌症风险之间的明确关联。这些发现证实了肿瘤特异性T细胞应答在肿瘤生长控制中的核心作用，并意味着HLA基因型分析可用于改进早期鉴定具有高风险发生癌症的受试者的诊断试验。

因此，在第一方面，本公开提供了用于确定人类受试者将发展癌症的风险的方法，所述方法包括定量受试者的能够结合肿瘤相关抗原(TAA)的氨基酸序列中的T细胞表位的HLA三联体(HLAT)，其中HLAT的每个HLA能够结合相同的T细胞表位，并且确定受试者将发展癌症的风险，其中，关于TAA，较少数目的能够结合TAA的T细胞表位的HLAT对应于受试者将发展癌症的较高风险。

本文所述的发现还提示，癌症的风险可以通过使用个性化的疫苗来降低，所述疫苗有效地激活受试者的免疫系统以杀死肿瘤细胞。

因此，在另一方面，本公开提供了治疗受试者的癌症的方法，其中受试者已经使用上述方法确定具有升高的发生癌症的风险，并且其中治疗方法包括向受试者施用一种或多种肽或一种或多种多核酸或编码一种或多种肽的载体，所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)是TAA的片段；且(ii)包含能够结合所述受试者的HLAT的T细胞表位。

在其他方面，本发明提供了

-一种肽或编码肽的多核酸或载体，其用于治疗特定人受试者中的癌症的方法中，其中所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)是TAA的片段；且(ii)包含能够结合所述受试者的HLAT的T细胞表位；以及

-肽、或多核酸或编码肽的载体，其用于制造治疗特定人类受试者的癌症的药物，其中所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)是TAA的片段；且(ii)包含能够结合所述受试者的HLAT的T细胞表位。

在另一方面，本公开提供了用于确定人类受试者将发展癌症的风险的系统，所述系统包括：

(i)存储模块，配置为存储包括受试者的HLA I类基因型和TAA的氨基酸序列的数据；

(ii)计算模块，配置为定量所述受试者的能够结合所述TAA的氨基酸序列中的T细胞表位的HLAT，其中HLAT的每个HLA能够结合相同的T细胞表位；以及

(iii)输出模块，配置为显示所述受试者将发展癌症的风险的指示和/或针对所述受试者的推荐治疗。

(iv)

现在将通过举例而非限制的方式并参考附图更详细地描述本公开的方法和组合物。当给出本公开时，许多等同的修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，所阐述的本发明的示范性实施例被认为是说明性的而非限制性的。在不脱离本公开的范围的情况下，可以对所描述的实施例进行各种改变。本文引用的所有文献，无论是上文还是下文，均明确地以全文引用的方式并入本文中。

本公开包括所描述的方面和优选特征的组合，除了这种组合明显是不允许的或被声明为明确避免的情况之外。如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种(a、an)”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“一种肽(a peptide)”包括二或更多种这样的肽。

本文中使用的章节标题仅仅是为了方便，而不应被解释为以任何方式进行限制。

附图说明

图1

HLA限制性PEPI生物标志物的ROC曲线。

图2

测定诊断准确性的≥1PEPI3+测试的ROC曲线。AUC＝0.73为PEPI生物标志物分类了合理的诊断价值。

图3

在不同种族群体中48种TSA的平均总HLAT分数。远东亚洲和太平洋地区的族群明显比世界的其余部分具有更高的HLAT数。可以与国家相关联的种族群用黑色突出显示。y轴上的编码：1：爱尔兰；2：北美(Eu)；3：捷克；4：芬兰；5：格鲁吉亚；6：墨西哥；7：乌干达；8：北美(Hi)；9：新德里，10：库尔德，11：保加利亚，12：巴西(Af、Eu)，13：阿拉伯德鲁兹，14：北美(Af)，15：泰米尔，16：美洲印第安，17：赞比亚，18：肯尼亚，19：图瓦，20：瓜拉尼—南德瓦，21：肯尼亚低地，22：绍纳，23：瓜拉尼—凯奥瓦，24：祖鲁，25：多贡，26：赛夏，27：以色列犹太，28：卡农西托，29：北美(As)，30：朝鲜，31：格鲁特岛，32：太鲁阁，33：西拉雅，34：约克角，35：冲绳，36：巴厘，37：肯尼亚高地，38：客家，39：泰雅，40：中国，41：菲律宾，42：闽南，43：尤皮克，44：金伯利，45：印度尼西亚爪哇，46：伊万特，47：泰，48：马来，49：邹，50：阿美，51：布农，52：云都姆，53：巴宰，54：邵，55：美属萨摩亚，56：鲁凯，57：排湾，58：卑南，59：雅美

图4

在具有低HLAT分数(s<75)和高HLAT分数(s>75)的国家中的发病率。平均值用水平黑条表示。标准误差用竖线表示。发生率之间的差异非常显著(p<0.0001)。

图5

将黑素瘤患者与一般群体进行分类的免疫学预测因子的ROC曲线(HLAT分数)。AUC＝0.645；黑色实线是ROC曲线，为了比较，x＝y线用点灰色指示。

图6

在五个同样大的亚群中发生黑素瘤的相对免疫风险。定义亚群的HLAT分数范围在水平轴上呈现。黑色条指示95％置信区间。第一和最后一个亚组之间的差异是显著的(p＝0.001)。

图7

在五个同样大的亚群中发生癌症的相对免疫风险。定义亚群的HLAT分数范围在水平轴上呈现。黑色条指示95％置信区间。非小细胞肺癌；B.肾细胞癌；结肠直肠癌。

图8

在五个大小相等的亚组中发生黑素瘤的相对风险(RR)。定义亚组的HLA分数范围显示在x轴上。黑色条指示95％置信区间。第一和最后亚组之间的差异是显著的(p<0.05)。

图9

导致疫苗特异性T细胞应答(在10名患者中)的抗原数目(n＝7)与针对48TSA的组计算的HLAT分数之间正相关。

图10

59个不同国家和种族群体中的平均HLA分数。可以与国家相关联的种族组作为国家的主要种族以黑色突出显示。在y轴上编码的族群：1，爱尔兰；2，北美(Eu)；3，捷克；4，芬兰；5，巴西(Af、Eu)；6，格鲁吉亚；7，阿拉伯德鲁兹；8，瓜拉尼—凯奥瓦；9，乌干达；10，北美(Hi)；11，新德里；12，保加利亚；13，北美(Af)；14，瓜拉尼—南德瓦；15，库尔德；16，以色列犹太；17，墨西哥；18，泰米尔；19，肯尼亚；20，肯尼亚低地；21，赞比亚；22，多贡；23，美洲印第安；24，绍纳；25，肯尼亚高地；26，祖鲁；27，卡农西托；28，图瓦；29，赛夏；30，印尼爪哇；31，菲律宾；32，北美(As)；33，约克角；34，马来；35，朝鲜；36，泰；37，客家；38，冲绳；39，中国；40，格鲁特岛；41，闽南；42，伊万特；43，巴厘；44，金伯利(澳大利亚)；45，太鲁阁；46，尤努杜姆；47，泰雅；48，西拉雅；49，美属萨摩亚；50，尤皮克；51，巴宰；52，布农；53，雅美；54，邹；55，阿美；56，邵；57，鲁凯；58，排湾；59，卑南。这里Eu表示欧裔非西班牙裔，Hs表示西班牙裔，Af表示非裔，As表示亚裔。

图11

在种族群体中黑素瘤发病率和平均HLA分数之间的相关性。相关性是显著的(p<0.001，变换的T评分是4.25，df＝18)。ASRW：以世界标准人口年龄标准化的比率。

图12

单一HLA等位基因或非完全HLA基因型在UNPC群体与非UNPC群体的基于基因型的分离中具有限制。A*02:01/B*18:01AUC＝0.556(不显著)。

图13

OBERTO试用设计(NCT03391232)

图14

在OBERTO试验的CRC组体中的抗原表达(n＝10)。A：基于2391活检组织测定的PolyPEPI1018来源抗原的表达频率。B：指定为7种TSA中的3种的PolyPEPI1018疫苗设计在CRC肿瘤中以高于95％的概率表达。C：平均来说，10名患者中有4名预先存在针对每种靶抗原的免疫应答，这是指TSA在患者肿瘤中的真实表达。D：10名患者中有7名预先存在的针对最少1种TSA、平均针对3种不同TSA的免疫应答。

图15

PolyPEPI1018在CRC患者中的免疫原性证实了适当的靶抗原和靶肽选择。上部：PolyPEPI1018疫苗组合物的靶肽选择和肽设计。选择来自CRC特异性CTA(TSA)的两个15mer，其在代表性模型群体中含有9mer PEPI3+优势。表：在CRC群体的临床前研究期间，已经回顾性地测试了PolyPEPI1018疫苗，并且通过产生PEPI3+s证明其在所有测试个体中对至少一种抗原是免疫原性的。在90％的患者中测定对至少一种抗原特异的临床免疫应答，在90％的患者中也发现了针对至少2种抗原的多抗原免疫应答，在80％的患者中也发现了针对至少3种抗原的多抗原免疫应答，如用对包含疫苗的肽特异测定的IFNγ荧光斑点测定法所测试的。

图16

PolyPEPI1018治疗的临床应答。A：OBERTO试验(NCT03391232)的临床应答的泳池分布图。B：无进展存活(PFS)和AGP关联计数。C：肿瘤体积和AGP关联计数。

图17

患者A肿瘤细胞中疫苗抗原表达的可能性。疫苗方案中13种靶抗原中有5种在患者肿瘤中表达的概率超过95％。因此，13种肽疫苗可以一起以95％的概率诱导针对至少5种卵巢癌抗原的免疫应答(AGP95)。每种肽在患者A中诱导免疫应答的概率为84％。AGP50是平均值(期望值)＝7.9(它是疫苗攻击患者A肿瘤的有效性的量度)。

图18

患者A的治疗方案。

图19

患者A的T细胞应答。左：疫苗肽特异性T细胞应答(20mer)。右：CD8+细胞毒性T细胞应答(9mer)。预测的T细胞应答通过生物测定证实。

图20

用个性化(PIT)疫苗治疗患者A的MRI表现。这种晚期、高度预处理的卵巢癌患者在PIT疫苗治疗后具有意想不到的客观应答。这些MRI表现表明，PIT疫苗与化疗相结合可显著降低肿瘤负荷。

图21

疫苗抗原在患者B的肿瘤细胞中表达的可能性和患者B的治疗方案。A：疫苗中13种靶抗原中的4种在患者肿瘤中表达的可能性超过95％。B：因此，12种肽疫苗可以一起以95％的概率诱导针对至少4种乳腺癌抗原的免疫应答(AGP95)。每种肽在患者B中诱导免疫应答的概率为84％。AGP50＝6.45；它是疫苗攻击患者A肿瘤的有效性的量度。C：患者B的治疗方案。

图22

患者A的T细胞应答。左：疫苗肽特异性的T细胞应答P(20mer)。右：疫苗特异性CD8+细胞毒性T细胞应答的动力学(9mer)。预测的T细胞应答通过生物测定证实。

图23

患者C的治疗方案。

图24

患者C的T细胞应答。A：疫苗肽特异性T细胞应答(20mer)。B:B：疫苗肽特异性CD8+T细胞应答(9mer)。C–D:分别为疫苗特异性CD4+T细胞和CD8+细胞毒性T细胞应答(9mer)的动力学。14个月后存在CD4和CD8 T细胞特异性的长期免疫应答。

图25

患者D的治疗方案。

图26

用于PIT治疗的患者D的免疫应答。A：CD4+特异性T细胞应答(20mer)和B：CD8+T细胞特异性T细胞应答(9mer)。0.5至4个月是指最后一次疫苗接种之后的时间跨度，直到PBMC样本采集。

序列描述

SEQ ID No:1至13列出了患者A的个性化疫苗的序列，并描述于表23中。

SEQ ID No:14至25列出了患者B的个性化疫苗的序列，并描述于表25中。

SEQ ID No:26列出了30个氨基酸的CRC_P3肽，图15。

具体实施方式

HLA基因型

HLA由人基因组的大多数多态性基因编码。每个人具有三种HLA I类分子(HLA-A*，HLA-B*，HLA-C*)和四种HLA II类分子(HLA-DP*，HLA-DQ*，HLA-DRB1*，HLA-DRB3*/4*/5*)的母系和父系等位基因。实际上，每个人表达6种HLA I类分子和8种HLA II类分子的不同组合，它们呈递来自相同蛋白质抗原的不同表位。

用于表示HLA分子的氨基酸序列的命名法如下：基因名称*等位基因：蛋白质编号，例如，其可以看起来像：HLA-A*02:25。在该实例中，“02”指等位基因。在大多数情况下，等位基因由血清型C定义，这意味着给定等位基因的蛋白质在血清学测定中不会相互反应。蛋白质编号(上述实例中的25)在发现蛋白质时连续分配。为具有不同氨基酸序列的任何蛋白质指定新的蛋白质编号(例如，甚至序列中的一个氨基酸改变被认为是不同的蛋白质编号)。关于给定基因座的核酸序列的进一步信息可以附加到HLA命名法，但是这种信息对于本文所述的方法不是必需的。

个体的HLA I类基因型或HLA II类基因型可以指个体的每种I类或II类HLA的实际氨基酸序列，或者可以指如上所述的命名法，其最低限度地指定每个HLA基因的等位基因和蛋白质编号。在一些实施方案中，通过测定来自个体的生物样本获得或确定个体的HLA基因型。生物样本通常含有受试者DNA。生物样本可以是例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、呼气、细胞或组织样本。在一些实施方案中，生物样本是唾液样本。在一些实施方案中，生物样本是口腔拭子样本。可以使用任何合适的方法获得或确定HLA基因型。例如，可以使用本领域已知的方法和方案通过对HLA基因座测序来确定序列。在一些实施方案中，使用序列特异性引物(SSP)技术确定HLA基因型。在一些实施方案中，使用序列特异性寡核苷酸(SSO)技术确定HLA基因型。在一些实施方案中，使用基于序列的分型(SBT)技术确定HLA基因型。在一些实施方案中，使用下一代测序确定HLA基因型。或者，可以将个体的HLA组存储在数据库中，并使用本领域已知的方法进行访问。

HLA表位结合

给定的受试者的HLA将仅向T细胞呈递通过在APC中加工蛋白质抗原产生的有限数量的不同肽。如本文所用，当与HLA相关使用时，“显示(display)”或“呈递(present)”是指肽(表位)和HLA之间的结合。在这方面，“显示”或“呈递”肽与“结合(binding)”肽同义。

如本文所用，术语“表位(epitope)”或“T细胞表位(T cell epitope)”是指包含在蛋白质抗原内的连续氨基酸序列，其具有对(能够结合)一种或多种HLA的结合亲和力。表位是HLA和抗原特异性的(HLA表位对，用已知方法预测)，但不是受试者特异性的。

本文所用的术语“个人表位”或“PEPI”将受试者特异性表位与HLA特异性表位区分开。“PEPI”是由多肽的连续氨基酸序列组成的多肽片段，所述多肽是能够结合特异性人受试者的一种或多种HLA I类分子的T细胞表位。换句话说，“PEPI”是被特定个体的HLA I类组识别的T细胞表位。与“表位”相反，PEPI是个体特异性的，因为不同个体具有各自结合不同T细胞表位的不同HLA分子。在适当情况下，PEPI也可以指由多肽的连续氨基酸序列组成的多肽片段，所述多肽是能够结合特异性人受试者的一种或多种HLA II类分子的T细胞表位。

本文所用的“PEPI1”是指可与个体的一种HLA I类分子(或在特定情况下，HLA II类分子)结合的肽或多肽片段。“PEPI1+”是指可以与个体的一种或多种HLA I类分子结合的肽或多肽片段。

“PEPI2”指能够结合个体的二种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段。“PEPI2+”是指可以结合个体的二或更多种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段，即根据本公开的方法鉴定的片段。

“PEPI3”是指能够结合个体的三种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段。“PEPI3+”是指可以结合个体的三或更多种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段。

“PEPI4”是指能够结合个体的四种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段。“PEPI4+”是指可以结合个体的四或更多种HLA I类(或II)分子的肽或多肽片段。

“PEPI5”是指能够结合个体的五种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段。“PEPI5+”是指能够结合个体的五或更多种HLA I类(或II类)分子的肽或多肽片段。

“PEPI6”是指能够结合个体的所有六种HLA I类(或六种HLA II类)分子的肽或多肽片段。

一般而言，HLA I类分子呈递的表位长度为约9个氨基酸。然而，为了本公开的目的，只要表位能够结合HLA，表位长度可以多于或少于9个氨基酸。例如，能够被一个或多个HLA I类分子呈递(结合至)的表位的长度可以在7个、或8个、或9个和9个、或10个、或11个氨基酸之间。

一般而言，HLA I类分子呈递的表位长度为约9个氨基酸。然而，为了本公开的目的，只要表位能够结合HLA，表位长度可以多于或少于9个氨基酸。例如，能够被一个或多个HLA I类分子呈递(结合至)的表位的长度可以在7个、或8个、或9个和9个、或10个、或11个氨基酸之间。

使用本领域已知的技术，可以确定将与已知HLA结合的表位。可以使用任何合适的方法，条件是使用相同的方法来确定直接比较的多种HLA表位结合对。例如，可以使用生化分析。也可以使用已知由给定HLA结合的表位列表。还可以使用预测或建模软件来确定哪些表位可以被给定的HLA结合。表1中提供实例。在一些情况下，如果T细胞表位的IC50或预测的IC50小于5000nM、小于2000nM、小于1000nM或小于500nM，则T细胞表位能够与给定HLA结合。

表1 用于确定表位—HLA结合的示例软件

HLA分子调节T细胞应答。直到最近，对单个表位的免疫应答的触发被认为是通过由单个HLA等位基因的产物，即HLA限制性表位对表位的识别来确定的。然而，HLA限制性表位仅在一部分个体中诱导T细胞应答。尽管HLA等位基因匹配，在一个个体中激活T细胞应答的肽在其他个体中是无活性的。因此，以前不知道个体HLA分子如何呈递正激活T细胞应答的抗原衍生表位。

发明人发现，个体表达的多种HLA需要呈递相同的肽以触发T细胞应答。因此，对特定个体具有免疫原性(PEPI)的多肽抗原(表位)的片段是那些可以与该个体表达的多个I类(激活的细胞毒性T细胞)或II类(激活的辅助性T细胞)HLA结合的片段。该发现描述于PCT/EP2018/055231、PCT/EP2018/055232、PCT/EP2018/055230、EP 3370065和EP 3369431中。

本文所指的“HLA三联体”或“HLAT”或“任何组合HLAT”是由人类受试者表达的六个HLA I类等位基因中的三个的任何组合。如果三联体的所有三个HLA等位基因都能够结合PEPI，则HLAT能够结合特异性PEPI。“HLAT数”是HLAT的总数，由受试者的三个HLA等位基因的任意组合组成，其能够结合一个或多个确定的多肽或多肽片段，例如一个或多个抗原或PEPI。例如，如果受试者的六个HLA I类等位基因中的三个能够结合特定的PEPI，则HLAT数是一。如果受试者的六个HLA I类等位基因中的四个能够结合特定PEPI，则HLAT数为四(四个结合HLA等位基因中的任何三个的四个组合)。如果受试者的六个HLA I类等位基因中的五个能够结合特定PEPI，则HLAT数是十(五个结合HLA等位基因中的任何三个的十种组合)。如果受试者的六个HLA I类等位基因中的三个能够结合多肽中的第一个PEPI，并且受试者的六个HLA I类等位基因中的三个的相同或不同组合能够结合多肽中的第二个PEPI，则HLAT数为二，等等。

一些受试者可以具有编码相同HLA分子的二个HLA等位基因(例如，在纯合性的情况下HLA-A*02:25的二个拷贝)。由这些等位基因编码的HLA分子结合所有相同的T细胞表位。为了本公开的目的，由不同等位基因编码的HLA是不同的HLA，即使两个等位基因是相同的。“换言之，“与受试者的至少三个HLA分子结合”等可以另外表达为“与由受试者的至少三个HLA等位基因编码的HLA分子结合”。

确定癌症风险

本文提供了基于受试者的HLA I类基因型及其识别肿瘤相关抗原的能力来确定受试者将发展癌症的风险的方法。由于HLAT调节T细胞应答的方式，受试者的I类HLA基因型可以代表固有的遗传癌症风险决定因素：一些从父母遗传某些HLA基因的受试者可以发动广泛的T细胞应答，其有效地杀死肿瘤细胞；具有仅能识别少数肿瘤抗原的HLA基因的其它人对肿瘤细胞的防御较差。基于6个遗传的HLA等位基因，亲本和后代具有不同的HLA等位基因集合。由于HLAT结合性PEPI在受试者中诱导T细胞应答，亲本的肿瘤特异性T细胞应答不直接遗传给后代。

根据本公开内容，TAA中存在的能够结合受试者HLAT的T细胞表位(PEPI)的氨基酸序列表明TAA在受试者中的表达将引发T细胞应答。能够结合TAA表位的HLAT的数量越多，受试者对TAA表达的T细胞应答越有效，并且受试者将越有效地杀死表达TAA的癌细胞。相反，能够结合TAA表位的HLAT的数量越低，受试者对TAA表达的T细胞应答越低效，并且受试者杀死表达TAA的癌细胞的效力越低。肿瘤仅在表达TAA的癌细胞未被受试者的免疫应答检测到并杀死时才在受试者中出现。因此，HLA基因型可以代表受试者中癌症发展的遗传风险或保护因素。能够结合TAA的T细胞表位的HLAT的数目越多，对应于受试者发生表达TAA的肿瘤(癌症)的风险越低。能够结合TAA的T细胞表位的HLAT的数量越低，可能对应于受试者将发展表达TAA的肿瘤(癌症)的风险越高。

在一些情况下，癌症是特定类型的癌症或特定细胞类型的组织的癌症。在一些情况下，癌症是实体瘤。在一些情况下，癌症是癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤或胚细胞瘤。癌症可能是激素相关或依赖性癌症(例如雌激素或雄激素相关癌症)或非激素相关或依赖性癌症。肿瘤可以是恶性的或良性的。癌症可以是转移性或非转移性的。癌症可以与病毒感染或病毒癌基因相关或不相关。在一些情况下，癌症是选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、头颈癌、卵巢癌、非黑素瘤皮肤癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、子宫体癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、神经系统癌、胆囊癌、喉癌、咽癌、骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、肝细胞癌、儿科癌和卡波西肉瘤的一种或多种。

在其他情况下，该方法可用于确定受试者将发展任何癌症或本文公开的癌症的任何组合的风险。

在其它情况下，该方法可用于确定受试者将发展表达一种或多种特异性TAA的癌症的风险。可以选择合适的TAA用于本公开的方法中，如下文进一步描述的。

术语“T细胞应答(T cell response)”和“免疫应答(immune response)”在本文中可互换使用，并且是指在鉴定一种或多种HLA表位结合对之后T细胞的激活及/或一个或多个效应子功能的诱导。在一些情况下，“免疫应答”包括抗体应答，因为HLA II类分子刺激参与诱导持久CTL应答和抗体应答的辅助应答。效应子功能包括细胞毒性、细胞因子产生和增殖。

本公开的方法可用于确定发生癌症的免疫学风险。具体地，本文所述的方法可用于确定受试者识别和启动针对TAA或表达那些TAA的癌细胞的免疫应答的能力。许多其它因素可能促成受试者发生癌症的总体风险。因此，在一些情况下，本文公开的方法可以与其他风险决定因素组合或并入用于癌症风险预测的更广泛的模型中。例如，在一些实施方案中，本公开的方法还包括确定其他癌症风险因素，例如环境因素、生活方式因素、其他遗传风险因素和促成受试者发展癌症的总体风险的任何其他因素。

不是所有的受试者的HLAT和/或不是所有的TAA在癌症的免疫学控制中可能起同样重要的作用。因此，在根据本发明的一些情况下，可以对不同的HLA等位基因(例如使用本文实例7至9中所述的基于“HLA分数”的方法)、不同的HLAT和/或能够结合不同TAA的T细胞表位的HLAT(例如使用本文实例5和6中所述的基于“HLAT分数”的方法)应用不同的权重。示例本发明的基于HLAT分数和HLA分数的方法在技术计算上不同，但是在两种情况下，如果受试者产生针对TSA的免疫应答的预测能力更好，则他/她拥有更大的分数。两种方法都使用统计学习算法。在HLAT分数的情况下，学习算法基于针对TSA的免疫应答对抗某些癌症的重要程度来给TSA分配权重。然后，最终HLAT分数是对象可以针对TSA生成的HLA三元组的加权和。在HLA分数的情况下，学习算法基于在拥有HLA等位基因的受试者中HLAT针对TSA可以产生的程度来为个体HLA等位基因分配分数。那么受试者的最终HLA分数是他/她拥有的HLA等位基因的权重的总和。

在一些情况下，可以根据经验确定要应用的加权。例如，在一些情况下，可以使用本文所述的方法，基于或关联每个TAA独立地将患有(所述)癌症的受试者与未患有(所述)癌症的受试者或包括患有(所述)癌症的受试者的背景群体分开的能力，确定应用于HLAT的能够结合特定TAA的T细胞表位的权重。

或者或另外，可以通过、基于或关联于癌症或癌症类型中TAA表达的频率来确定应用于HLAT的能够结合特定TAA的T细胞表位的权重。TAA在不同癌症中的表达频率可从公开的图和科学出版物中确定。

在一些情况下，应用于特定HLAT的权重可以通过、基于或关联HLAT在患有癌症的受试者或患有癌症的受试者和/或疾病匹配的受试者亚群中存在的频率来确定。

在一些情况下，应用于HLAT的能够结合到每个TAA的T细胞表位的权重被定义为或使用以下权重(w(c))：

其中t(c)表示对有和没有癌症的群体的TAA c的HLAT分数的单侧t检验的p值，B是Bonferroni校正(TAA的数量)。该加权用于本文所述的基于HLAT分数的方法。

在一些情况下，HLA等位基因(h)的显著性评分(权重)定义为

其中u(h)是等位基因h的双侧u检验的p值，其确定两个个体亚组中HLAT的数目是否不同：一个亚组中的个体具有HLA h，一个亚组中的个体不具有HLA h。B是Bonferroni校正，如果具有h等位基因的亚群中HLAT的平均数大于不具有h的亚群中HLAT的平均数，则sign(h)为+1，否则为-1。该加权用于本文所述的基于HLA分数的方法。

在一些情况下，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来进一步优化初始加权。在一些情况下，这些显著性得分的总和用于确定受试者将发展癌症的风险与受试者将发展癌症的风险相关。

例如，在一些情况下，受试者将发展癌症的风险与受试者将发展癌症的风险相关或受试者将发展癌症的风险使用以下HLAT分数(s(x))确定：

其中C是TAA的集合，c是特定的TAA，w(c)是TAA c的权重，p(x,c)是受试者x中TAAc的HLAT数。

在本文的实施例中描述的基于HLAT分数的方法和基于HLA分数的方法是根据本发明的方法的两个实例。通过使用个体的HLA I类基因型数据，可以开发进一步的评分方案。要使用的具体分数取决于适应症和先验数据。在一些情况下，将基于对可用测试数据集的不同计算的性能来做出选择。性能可以通过AUC值(ROC曲线下的面积)或通过本领域技术人员已知的任何其它性能优度评分来评价。

肿瘤相关抗原(TAA)

癌症或肿瘤相关抗原(TAA)是在癌症或肿瘤细胞中表达的蛋白质。TAA的实例包括新的抗原(新抗原，其在肿瘤发生过程中被表达并在正常或健康细胞中从类似蛋白改变)、癌基因和肿瘤抑制基因的产物、过表达或异常表达的细胞蛋白(例如HER2、MUC1)、致癌病毒(例如EBV、HPV、HCV、HBV、HTLV)产生的抗原、癌睾丸抗原(CTA，例如MAGE家族，NY-ESO)、细胞类型特异性分化抗原(例如MART-1)和肿瘤特异性抗原(TSA)。TSA是由特定类型的肿瘤产生的抗原，其不出现在肿瘤在其中发展的组织的正常细胞上。TSA包括共有抗原、新抗原和独特抗原。TAA序列可以通过实验、或已发表的科学论文、或公众可获得的数据库找到，如路德维希癌症研究所(www.cta.lncc.br/)，癌症免疫数据库(cancerimmunity.org/peptide/)和TANTIGEN肿瘤T细胞抗原数据库(cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)。示例性TAA列于表2和11中。

表2任选地排除Ropporin-1A Q9HAT0和/或WBP2NL Q6ICG8.1。

在一些情况下，本文所述的方法用于确定受试者将发展表达一种或多种特定TAA的癌症的风险。在其它情况下，该方法用于确定受试者将发展任何癌症或特定类型的癌症的风险。在一些情况下，不同的TAA可能与不同类型的癌症相关，但不是每种特定类型的癌症都表达相同的TAA组合。因此，在一些情况下，在多个TAA中对结合表位性HLAT进行定量，在一些情况下，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45或更多个TAA。通常，如果TAA在较高比例癌症或癌症患者或所选类型的癌症中表达，则可以使用较少的TAA。如果TAA在较低比例的癌症或癌症患者或选择类型的癌症中表达，则可以使用更多的TAA。在一些情况下，可以使用一组TAA，它们一起以最小比例的癌症、癌症患者或所选类型的癌症表达或过表达，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多。TAA在不同癌症中的表达频率可从公开的图和科学出版物中确定。

根据本公开内容选择使用的TAA通常是在高比例的癌症或特定类型的癌症中表达或过表达的TAA。在一些情况下，一种或多种或每种TAA可以在至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的癌症中或在疾病和/或受试者匹配的人群的癌症中表达或过表达。例如，受试者可以根据种族、地理位置、性别、年龄、疾病类型或阶段、基因型、一种或多种生物标志物的表达等或其任何组合来匹配。

在一些情况下，一种或多种或每种TAA是肿瘤特异性抗原(TSA)或癌睾丸抗原(CTA)。CTA通常不会在健康细胞的胚胎发育之外表达。在健康成人中，CTA表达限于不表达HLA且不能向T细胞呈递抗原的雄性生殖细胞。因此，当在癌细胞中表达时，CTA被认为是表达的新抗原。CTA的表达(i)对肿瘤细胞是特异性的，(ii)在转移瘤中比在原发肿瘤中频率更高，以及(iii)在同一患者的转移肿瘤中是保守的(Gajewski ed.TargetedTherapeutics in Melanoma.Springer New York.2012)。

在一些情况下，该方法包括选择和/或鉴定用于本文公开的方法中的合适的TAA或合适的TAA组的步骤。

治疗方法

在一些情况下，本文所述的方法包括选择、制备和/或施用受试者中癌症的治疗。使用本文所述的方法，受试者可能已经被确定为具有升高的发生癌症的风险。本文所用的“治疗”是采取的任何动作，以预防或延迟癌症的发作，以改善一种或多种症状或并发症，诱导或延长缓解，以延迟复发、再发或恶化，或以其他方式改善或稳定受试者的疾病状态或癌症风险。通常，治疗是预防性治疗，旨在延迟或预防癌症或与癌症相关的任何症状或并发症的发作。治疗可以是免疫疗法或疫苗接种。

本文所用的术语“治疗”在一些情况下可以包括关于受试者的行为、环境暴露或生活方式的建议，其旨在降低受试者将发展癌症或与癌症相关的任何症状或并发症的风险。例如，对于确定具有发展黑素瘤的升高的风险的受试者，治疗可以包括推荐受试者暴露于UV辐射的减少。例如，这可以包括避免人造紫外线源，减少一天中的某些时间的日光照射或避免日光照射，使用可提供适当保护的防晒霜，穿着防护服，避免晒伤和/或服用维生素D。治疗方法可能包括与饮食相关的建议，包括使用膳食补充剂(例如抗氧化剂补充剂或增加钙的摄入量)，药物使用(包括减少烟草和/或酒精的摄入量)，运动或接触潜在的致癌物，传染源和/或辐射。

在其它情况下，治疗可以包括额外的或增加的频率的筛选或检查，以实现癌症的早期诊断。在其它情况下，治疗可包括施用抗炎药物，例如阿司匹林或非甾体抗炎药物，或避免或减少施用免疫抑制药物。在一些情况下，治疗可以包括增加对作为潜在危险因素的其它病症的处理的注意，所述其它病症例如肥胖症，或与慢性炎症相关的病症例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。

在其它情况下，治疗可以是任何已知的癌症治疗或预防性治疗，例如手术、化疗、细胞毒性或非细胞毒性化疗、放疗、靶向治疗、激素治疗或施用靶向小分子药物或抗体，例如单克隆抗体或共刺激抗体，并且包括本文所述的任何癌症治疗。

旨在增强受试者对癌细胞的免疫应答的治疗可能在使用本文所述的方法确定具有升高的癌症风险的受试者中预防或延迟癌症发展中特别有效。因此，在一些情况下，治疗可以是免疫疗法或检查点阻断疗法或检查点抑制剂疗法。在一些情况下，所述方法包括向受试者施用一种或多种肽或一种或多种多核酸或编码一种或多种如下所述的肽的载体，所述肽或载体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为(i)与癌症中的表达相关的抗原的片段；和(ii)能够结合所述受试者的HLAT的T细胞表位。

个性化治疗方法

根据本发明，受试者的HLAT识别TAA的能力预示了受试者发生癌症的风险。因此，通过用与被受试者HLAT识别的TAA表位相对应的肽刺激受试者的免疫应答，可以降低受试者发生癌症的危险。

因此，在一些情况下，本公开涉及癌症的预防性治疗方法，其中所述方法包括向受试者施用一种或多种肽，或一种或多种多核酸或编码一种或多种肽的载体，所述肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列(i)是TAA的片段；且(ii)能够结合受试者的HLAT的T细胞表位(即PEPI3+)。在一些情况下，使用本文所述的方法已经确定受试者处于发展癌症的升高的风险中。

可以如本文所述选择一种或多种合适的TAA和TAA中与受试者HLAT结合的合适表位。在某些情况下，该方法可以包括鉴定和/或选择合适的TAA、表位和/或肽的步骤。通常，一种或多种TAA是在癌细胞中频繁表达的TAA。

在一些情况下，确定受试者处于发展癌症的升高的风险中，在所述癌症中癌细胞表达特异性TAA。如果TAA包含少数对于特定受试者为PEPI3+的表位，或TAA的表位被受试者的少数HLAT识别，则可能是这种情况。对受试者的治疗可以包括施用包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列(i)是TAA的片段且(ii)包含能够结合受试者的一个或多个HLAT的T细胞表位。

在其他情况下，确定受试者处于发展一种或多种特定类型的癌症的升高的风险中，例如本文公开的任何类型的癌症。对受试者的治疗可以包括施用包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列(i)是与在该癌症类型中的表达相关的TAA的片段且(ii)包含能够结合受试者的一个或多个HLAT的T细胞表位。

在某些情况下，TAA是被受试者的少数HLAT识别的TAA。这种处理将增强T细胞对TAA的应答。在其它情况下，TAA可以是被多个HLAT识别的TAA。受试者通常已经能够发动针对这种TAA的广泛T细胞应答。这可能特别有助于杀死经常与可能不能被受试者的HLAT很好地识别的其它TAA共表达靶TAA的癌细胞。

肽可以是工程化的或非天然存在的。片段和/或肽的长度可以是至多50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10或9个氨基酸。通常，肽的长度可以是15或20至30或35个氨基酸。在某些情况下，对应于TAA的片段的氨基酸序列在N和/或C末端的侧翼是非TAA连续序列的一部分的其它氨基酸。在一些情况下，序列在N和/或C末端侧翼有多至41或35或30或25或20或15或10，或9或8或7或6或5或4或3或2或1个额外的氨基酸。在其它情况下，每个肽可以由TAA的片段组成，或者由两个或多个首尾相连(在肽中首尾相连地顺序排列)或在单个肽中重叠的这样的片段组成。

在一些情况下，治疗方法包括向受试者施用一种或多种肽，或编码一种或多种肽的一种或多种核酸或载体，所述肽包含至少2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15、或20、或25、或30、或35、或40、或45、或50或更多种不同的T细胞表位(PEPI)，所述T细胞表位各自(i)包含在TAA的片段中并且(ii)能够结合受试者的HLAT。在一些情况下，两个或多个PEPI包含在至少2、或3、或4、或5、或6、或7、或8、或9、或10、或11、或12或更多不同TAA的片段中。在一些情况下，一种或多种或每种TAA是TSA和/或CTA。

在一些情况下，肽片段中的一种或多种包含氨基酸序列，该氨基酸序列是能够结合受试者的至少三个或至少四个HLA II类等位基因的T细胞表位。这种治疗可在接受治疗的受试者中引发CD8+T细胞应答和CD4+T细胞应答。

在一些情况下，治疗方法包括向受试者施用任何一种或多种肽，或编码一种或多种肽的一种或多种核酸或载体，或施用如PCT/EP2018/055231、PCT/EP2018/055232、PCT/EP2018/055230、EP 3370065和EP 3369431中任一项所述的任何药物组合物。在一些具体情况下，所述治疗用于预防乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌，并且包括施用PCT/EP2018/055230和/或EP 3369431中所述的组合物。

如本文所用，术语“多肽”是指全长蛋白质、蛋白质的一部分、或表征为一串氨基酸的肽。术语“肽”指短多肽。如本文所用，术语“片段”或“多肽的片段”是指氨基酸串或氨基酸序列，它们相对于上述或一种参考多肽通常具有减少的长度并且在共同部分上包含与参考多肽相同的氨基酸序列。在适当的情况下，根据本公开的这种片段可以包括在其作为组分的较大多肽中。在一些情况下，片段可以包含多肽的全长，例如整个多肽，例如9个氨基酸的肽，是单个T细胞表位。在一些情况下，肽或多肽片段的长度可以在7、或8、或9、或10、或11、或12、或13、或14、或15和10、或11、或12、或13、或14、或15、或20、或25、或30、或35、或40、或45、或50个氨基酸之间。

药物组合物和给药方式

在一些情况下，本公开涉及治疗方法，其包括向受试者施用一种或多种如本文所述的肽。所述一种或多种肽可以一起或顺序地施用于受试者。例如，治疗可以包括在例如长达一年的时间内施用许多肽。在一些情况下，也可以重复治疗周期，以加强免疫应答。

除了一种或多种肽之外，用于向受试者施用的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或本领域技术人员熟知的其他材料。这样的物质优选是无毒的，并且优选不干扰活性成分的药物活性。药物载体或稀释剂可以是例如含水溶液。载体或其他物质的确切性质可取决于给药途径，例如口服途径、静脉途径、皮肤或皮下途径、鼻内途径、肌内途径、皮内途径和腹膜内途径。

为了增加组合物的免疫原性，药物组合物可以包含一种或多种佐剂及/或细胞因子。

合适的佐剂包括铝盐如氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是钙、铁或锌的盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性悬浮液，或者可以是阳离子或阴离子衍生的糖、聚磷腈、生物可降解的微球、单磷酰脂质A(MPL)、脂质A衍生物(例如毒性降低)、3-O-脱酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)、Quil A、皂苷、QS21、弗氏不完全佐剂(Difco实验室，密歇根州底特律市)、Merck佐剂65(默克公司，新泽西州罗威市)、AS-2(史克必成公司，宾夕法尼亚州费城)、CpG寡核苷酸、生物粘合剂和粘膜粘着剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁酰肽或咪唑并喹诺酮化合物(例如咪喹莫特及其同系物)。适合用作本公开的佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也可用作佐剂。

在一些实施例中，所述组合物包含佐剂，选自由Montanide ISA-51(赛比克公司，美国新泽西州费尔菲尔德)、QS-21(安奎拉(Aquila)生物制药公司，美国马萨诸塞州列克星敦)、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、环磷酰胺、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(corynbacterium parvum)、左旋咪唑、azimezone、异丙吡酮、二硝基氯苯(DNCB)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶、氢氧化铝、溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、油乳剂、二硝基苯酚、白喉毒素(DT)所组成的群组。

Esseku&Adeye(2011)和Van den Mooter G(2006)中提供了多肽片段的合适组合物和施用方法的实例。47.疫苗和免疫疗法组合物的制备一般描述于《疫苗设计》(“Thesubunit and adjuvant approach”(eds Powell M.F.&Newman M.J.(1995)Plenum PressNew York))中。Fullerton在美国专利4,235,877中描述了脂质体内的包封，这也是可设想的。

治疗方法可包括向受试者施用包含一种或多种如本文所述的肽作为活性成分的药物组合物。本文所用的术语“活性成分”是指旨在在可施用药物组合物的受试者中诱导免疫应答的肽。在一些情况下，活性成分肽可以是在施用于受试者后在体内产生的疫苗或免疫治疗组合物的肽产物。对于DNA或RNA免疫治疗组合物，该肽可以由施用该组合物的受试者的细胞在体内产生。对于基于细胞的组合物，多肽可由所述组合物的细胞加工及/或呈递，例如自体树突细胞或用该多肽脉冲的或包含编码多肽的表达构建体的抗原呈递细胞。

在一些实施方案中，本文公开的组合物可以制备为核酸疫苗。在一些实施例中，核酸疫苗是DNA疫苗。在一些实施例中，DNA疫苗或基因疫苗包含具有启动子和合适的转录和翻译控制元件的质粒以及编码本公开的一种或多种多肽的核酸序列。在一些实施例中，质粒还包括增强例如表达水平、细胞内靶向或蛋白酶体加工的序列。在一些实施例中，DNA疫苗包含含有编码本公开的一种或多种多肽的核酸序列的病毒载体。在另外的方面，本文公开的组合物包含一种或多种编码经测定与生物样本具有免疫反应性(immunoreactivity)的肽的核酸。例如，在一些实施方案中，组合物包含一种或多种编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种肽的核苷酸序列，所述肽包含片段，所述片段是能够结合患者的至少三种HLA I类分子的T细胞表位。在一些实施例中，DNA或基因疫苗还编码免疫调节分子以操纵产生的免疫应答，例如增强疫苗效力、刺激免疫系统或减少免疫抑制。增强DNA或基因疫苗免疫原性的策略包括异种抗原的编码，抗原与激活T细胞或触发缔合识别分子的融合，用DNA载体引发、然后用病毒载体加强，以及免疫调节分子的利用。在一些实施例中，DNA疫苗通过针头、基因枪、气溶胶注射器、贴片、微针、磨擦以及其他形式导入。在一些形式中，将DNA疫苗掺入脂质体或其他形式的纳米抗体中。在一些实施例中，DNA疫苗包括递送系统，选自由转染剂、鱼精蛋白、鱼精蛋白脂质体、多糖颗粒、阳离子纳米乳液、阳离子聚合物、阳离子聚合物脂质体、阳离子纳米颗粒、阳离子脂质和胆固醇纳米颗粒、阳离子脂质、胆固醇和PEG纳米颗粒、树枝状聚合物纳米颗粒所组成的群组。在一些实施例中，DNA疫苗通过吸入或摄取施用。在一些实施例中，将DNA疫苗导入血液、胸腺、胰腺、皮肤、肌肉、肿瘤或其他部位。

在一些实施例中，本文公开的组合物被制备为RNA疫苗。在一些实施例中，RNA是非复制mRNA或病毒来源的自扩增RNA。在一些实施例中，非复制mRNA编码本文公开的肽，并含有5′和3′非翻译区(UTR)。在一些实施例中，病毒来源的自扩增RNA不仅编码本文公开的肽，而且编码能够进行细胞内RNA扩增和大量蛋白质表达的病毒复制机制。在一些实施例中，将RNA直接导入个体。在一些实施例中，RNA在体外化学合成或转录。在一些实施例中，使用T7、T3或Sp6噬菌体RNA聚合酶从线性DNA模板产生mRNA，所得产物含有编码本文公开的肽的可读框、侧翼UTR、5′帽和poly(A)尾。在一些实施例中，使用痘苗病毒加帽酶或通过掺入合成帽或抗逆转录帽类似物，在转录反应期间或之后添加各种形式的5′帽。在一些实施例中，将poly(A)尾的最佳长度直接从编码DNA模板或通过使用poly(A)聚合酶添加到mRNA中。所述RNA编码一种或多种肽，所述肽包含能够结合患者的至少三种HLA I类分子的T细胞表位的片段。在一些实施例中，RNA包括增强稳定性和翻译的信号。在一些实施例中，RNA还包括增加半衰期的非天然核苷酸或改变免疫刺激谱的修饰核苷。在一些实施例中，RNA通过针头、基因枪、气溶胶注射器、贴片、微针、磨擦以及其他形式导入。在一些形式中，将RNA疫苗掺入脂质体或其他形式的纳米抗体中，所述纳米抗体促进RNA的细胞摄取并保护其免于降解。在一些实施例中，RNA疫苗包括递送系统，选自由转染剂、鱼精蛋白、鱼精蛋白脂质体、多糖颗粒、阳离子纳米乳液、阳离子聚合物、阳离子聚合物脂质体、阳离子纳米颗粒、阳离子脂质和胆固醇纳米颗粒、阳离子脂质、胆固醇和PEG纳米颗粒、树枝状聚合物纳米颗粒，及/或裸mRNA、体内电穿孔的裸mRNA、鱼精蛋白复合mRNA、与带正电荷的水包油阳离子纳米乳液相关的mRNA、与化学修饰的树枝状聚合物缔合并与聚乙二醇(PEG)—脂质复合的mRNA、PEG—脂质纳米颗粒中的鱼精蛋白复合的mRNA、与阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)缔合的mRNA、与阳离子聚合物如PEI和脂质组分缔合的mRNA、与多糖(例如壳聚糖)颗粒或凝胶缔合的mRNA、阳离子脂质纳米颗粒(例如，1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)脂质)中的mRNA、与阳离子脂质和胆固醇复合的mRNA，或与阳离子脂质/胆固醇和PEG—脂质复合的mRNA所组成的群组。在一些实施例中，RNA疫苗通过吸入或摄取施用。在一些实施例中，将RNA导入血液、胸腺、胰腺、皮肤、肌肉、肿瘤或其他部位，及/或通过皮内、肌内、皮下、鼻内、结节内、静脉内、脾内、肿瘤内或其他递送途径。

多核苷酸或寡核苷酸组分可以是裸核苷酸序列或与阳离子脂质、聚合物或靶向系统组合。它们可以通过任何可用的技术递送。例如，多核苷酸或寡核苷酸通过针头注射导入，优选皮内、皮下或肌内注射。或者，使用递送装置如颗粒介导的基因递送将多核苷酸或寡核苷酸直接递送穿过皮肤。多核苷酸或寡核苷酸可以局部施用于皮肤或粘膜表面，例如通过鼻内、口服或直肠内施用。

多核苷酸或寡核苷酸构建体的摄取可以通过几种已知的转染技术增强，例如那些包括使用转染剂的技术。这些试剂的实例包括阳离子试剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖以及脂质转染剂，例如lipofectam和transfectam。可以改变施用的多核苷酸或寡核苷酸的剂量。

施用通常为“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防可被视为治疗)，这足以导致临床应答或对个体显示临床益处，例如预防或延迟疾病或病症发作、改善一种或多种症状、诱导或延长缓解或延迟复发或再发的有效量。在一些情况下，根据本公开的治疗方法可以被执行用于在具有治愈的原发性癌症疾病的人中，预防癌症复发或转移。

剂量可以根据各种参数，特别是根据所使用的物质，待治疗个体的年龄、体重和状况，给药途径，以及所需的方案来确定。选择各剂量中抗原的量作为诱导免疫应答的量。医生能够确定任何特定个体所需的给药途径和剂量。剂量可以作为单剂量提供或可以作为多剂量提供，例如以规则的间隔服用，例如每小时施用2、3或4剂。通常，肽、多核苷酸或寡核苷酸通常在1pg至1mg，更通常1pg至10μg的范围内施用用于颗粒介导的递送，以及在1μg至1mg，更通常1μg至100μg，更通常5μg至50μg的范围内施用用于其他途径。通常，预期每种剂量将包含0.01mg至3mg抗原。特定疫苗的最佳量可以通过涉及观察受试者中免疫应答的研究来确定。

上述技术和方案的实例可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,20

给药途径包括但不限于鼻内、口服、皮下、皮内和肌内。通常，给药是皮下给药。皮下给药可以例如通过注射到腹部、上臂或大腿的侧面和前面、背部的肩胛区域或上腹部臀肌区域。

本领域技术人员将认识到，组合物也可以以一个或多个剂量施用，以及通过其它施用途径施用。例如，这些其他途径包括皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、心内、叶内、髓内、肺内和阴道内。根据的治疗期望持续时间，根据本公开的组合物可以一次或多次给药，也可以间歇给药，例如每月给药数月或数年，并且以不同的剂量给药。

根据本公开的治疗方法可以单独进行或与其他药理学组合物或治疗组合进行，例如行为或生活方式改变、化学疗法、免疫疗法和/或疫苗。其他治疗组合物或治疗可以是例如本文所讨论的那些中的一种或多种，并且可以与本公开的组合物或治疗同时或相继(之前或之后)施用。

在一些情况下，治疗可以与手术、化疗、细胞毒性或非细胞毒性化疗、放疗、靶向治疗、激素治疗或靶向小分子药物或抗体(例如单克隆抗体)或共刺激抗体的施用组合施用。已经证明化疗使肿瘤对疫苗接种诱导的特异性细胞毒性T细胞杀死致敏(Ramakrishnan etal.J Clin Invest.2010；120(4):1111-1124)。化疗剂的实例包括烷化剂，包括氮芥类，例如二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-肌氨酸蛋白酶)和苯丁酸氮芥；蒽环类药物；埃博霉素；亚硝基脲类，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基CCNU)和链脲霉素(链脲佐菌素)；三氮烯类，例如达卡巴嗪(DTIC)；二甲基三氮烯咪唑甲酰胺；乙撑亚胺类/甲基三聚氰胺类，例如六甲基三聚氰胺、塞替哌；烷基磺酸盐，例如白消安；抗代谢物，包括叶酸类似物如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；烷基化剂、抗代谢物、嘧啶类似物如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)，氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；嘌呤类似物和相关抑制剂，例如巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)，硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2′-脱氧助间型霉素)；表鬼臼毒素类；酶类如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，例如IFNα、IL-2、G-CSF和GM-CSF；铂配位络合物如顺铂(cis-DDP)、奥沙利铂和卡铂；蒽二酮类，例如米托蒽醌和蒽环霉素；取代的脲如羟基脲；甲基肼衍生物，包括甲基苄肼(N-甲基肼，MIH)和甲基苄肼；肾上腺皮质抑制剂，例如米托坦(o,p′-DDD)和氨鲁米特；紫杉醇和类似物/衍生物；激素/激素疗法和激动剂/拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂如泼尼松及其等效物、地塞米松和氨鲁米特，孕激素如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮，雌激素如己烯雌酚和炔雌醇等效物，抗雌激素如他莫昔芬，雄激素包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物，抗雄激素如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林，以及非甾体抗雄激素如氟他胺；天然产物包括长春花生物碱如长春碱(VLB)和长春新碱，表鬼臼毒素类如依托泊苷和替尼泊苷，抗生素类如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、阿霉素、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)，酶类如L-天冬酰胺酶，以及生物反应调节剂如干扰素alphenome。

系统

本公开提供了一种系统。该系统可以包括存储模块，配置为存储包括受试者的HLAI类基因型和TAA的氨基酸序列的数据。该系统可以包括计算模块，配置为定量能够结合TAA的氨基酸序列中的T细胞表位的受试者的HLAT，其中HLAT的每个HLA能够结合相同的T细胞表位。该系统可以包括用于从至少一个受试者接收至少一个样品的模块。该系统可以包括用于确定受试者的I类和/或II类HLA基因型的HLA基因分型模块。存储模块可以被配置为存储从基因分型模块输出的数据。HLA基因分型模块可以接收从受试者获得的生物样本并确定受试者的I类及/或II类HLA基因型。样本通常含有受试者DNA。样本可以是例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、呼气、细胞或组织样本。该系统可以进一步包括输出模块，配置为显示受试者将发展癌症的风险的指示和/或如本文所述的受试者的推荐治疗。

1.一种用于治疗处于发生癌症的风险中的人类受试者的方法，所述方法包括

a.定量所述受试者的能够结合肿瘤相关抗原(TAA)的氨基酸序列中的T细胞表位的HLA三联体(HLAT)，其中HLAT的每个HLA能够结合相同的T细胞表位；

b.确定所述受试者将发展癌症的风险，其中，对于TAA，能够结合所述TAA的T细胞表位的HLAT的数量越低对应于所述受试者将发展癌症的风险越高；以及

c.向受试者施用包含氨基酸序列的肽、或编码肽的多核酸或载体

i.是TAA的片段；且

ii.包含能够结合所述受试者的HLAT的T细胞表位。

2.如第1项所述的方法，其中TAA的片段的N和/或C末端侧翼是非TAA序列的一部分的其它氨基酸。

3.如第1至2项中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、头颈癌、卵巢癌、非黑素瘤皮肤癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、子宫体癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、神经系统癌、胆囊癌、喉癌、咽癌、骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、乳腺癌和卡波西肉瘤。

4.如第1项所述的方法，其中TAA选自表2或表11中列出的任何一种。

5.一种用于在有需要的个体中用癌症治疗来治疗癌症的方法，其包括：

通过以下步骤确定所述个体是否处于较高的发生癌症的风险：

对来自所述个体的生物样品进行定量测定以确定所述个体的HLA三联体(HLAT)，所述HLA三联体能够结合肿瘤相关抗原(TAA)的氨基酸序列中的T细胞表位，其中HLAT的每个HLA能够结合相同的T细胞表位；以及

如果所述个体具有比源自对照个体群组的阈值更低数量的能够结合TAA的T细胞表位的HLAT，则对所述个体施用所述癌症治疗。

6.如第5项所述的方法，还包括从所述个体获得所述生物样品。

7.如第5项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、头颈癌、卵巢癌、非黑素瘤皮肤癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、子宫体癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、神经系统癌、胆囊癌、喉癌、咽癌、骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、乳腺癌和卡波西肉瘤。

8.如第5项所述的方法，其中所述癌症治疗包括向个体施用包含氨基酸序列的肽、或编码肽的多核酸或载体，所述氨基酸序列

(i)是TAA的片段；且

(ii)包含能够结合个体的HLAT的T细胞表位。

9.如第8项所述的方法，其中所述TAA的片段的N和/或C末端侧翼是非TAA序列的一部分的其它氨基酸。

10.如第5项所述的方法，其中所述TAA选自表2或表11中列出的那些中的任何一种。

11.如第5项所述的方法，其中所述生物样品包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、呼气、细胞或组织。

12.一种用于在有需要的个体中治疗癌症的方法，包括：

向具有比源自对照个体群的阈值更低数量的HLA三联体(HLAT)的个体施用癌症治疗，所述HLA三联体能够结合肿瘤相关抗原(TAA)的T细胞表位。

13.如第12项所述的方法，其中癌症治疗包括向个体施用包含氨基酸序列的肽、或编码肽的多核酸或载体，所述氨基酸序列

(i)是TAA的片段；且

(ii)包含能够结合所述个体的HLAT的T细胞表位；

任选地其中所述TAA的片段在N和/或C末端的侧翼为不是TAA序列的一部分的额外氨基酸。

14.如第12项所述的方法，其中所述TAA选自表2或表11中列出的那些中的任何一种。

15.如第5项所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、膀胱癌、神经胶质瘤、头颈癌、卵巢癌、非黑素瘤皮肤癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、食管癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病、胰腺癌、子宫体癌、唇癌、口腔癌、甲状腺癌、脑癌、神经系统癌、胆囊癌、喉癌、咽癌、骨髓瘤、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、睾丸癌、乳腺癌和卡波西肉瘤。

16.一种用于确定人类受试者将发展癌症的风险的系统，所述系统包括：

(i)存储模块，配置为存储包括受试者的HLA I类基因型和TAA的氨基酸序列的数据；

(ii)计算模块，配置为定量所述受试者的能够结合所述TAA的氨基酸序列中的T细胞表位的HLAT，其中HLAT的每个HLA能够结合相同的T细胞表位；以及

(iii)输出模块，配置为显示所述受试者将发展癌症的风险的指示和/或针对所述受试者的推荐治疗。

特定HLA和表位(9mer肽)之间结合的预测是基于用于表位预测的免疫表位数据库工具(www.iedb.org)。

通过与实验室实验测定的HLA I表位对的比较，验证了HLA I表位结合预测过程。将在同行评审的出版物或公共免疫学数据库中报告的HLA I表位对的数据集进行汇编。

测定了与实验测定的数据集(表3)的一致率。以93％的概率正确预测数据集的结合HLA I表位对。巧合的是，非结合HLA I表位对也被正确预测，概率为93％。

表3 HLA表位结合预测方法的分析特异性和灵敏度

还确定了预测多个HLA结合表位的准确性(表4)。基于使用真阳性和真阴性预测的93％概率和假阳性和假阴性预测的7％(＝100％-93％)概率的分析特异性和灵敏度，可以计算人体内存在多种HLA结合表位的概率。多种HLA与表位结合的概率显示了HLA结合表位的数量与预期的最小实际结合数量之间的关系。根据PEPI定义，3是结合表位的HLA的预期最小数值(粗体)。

表4 多种HLA结合表位预测准确性

验证的HLA表位结合预测方法用于确定下面实例中描述的所有HLA表位结合对。

本研究调查了个体的一个或多个HLA I类分子对多肽抗原的一个或多个表位的呈递是否预示着CTL应答。

通过对71例癌症患者和9例HIV感染患者(表5)进行的6项临床试验的回顾性分析进行研究。来自用HPV疫苗、三种不同的NY-ESO-1特异性癌症疫苗、一种HIV-1疫苗和一种CTLA-4特异性单克隆抗体伊匹单抗(Ipilimmab)治疗这些研究的患者，该抗体显示在黑色素瘤患者中重新激活针对NY-ESO-1抗原的CTL。所有这些临床试验在疫苗接种后测量研究受试者中的抗原特异性CD8+CTL应答(免疫原性)。在一些情况下，报告了CTL应答与临床应答之间的相关性。

没有患者因除数据可用性之外的任何原因被排除在回顾性研究之外。157例患者数据集(表5)用标准随机数发生器随机化以创建用于训练和评估研究的二个独立组群。在一些情况下，该组群包含来自同一患者的多个数据集，导致来自48例患者的76个数据集的训练组群和来自51例患者的81个数据集的测试/验证组群。

表5 患者数据集总结

将所报告的训练数据集的CD8+T应答与疫苗抗原表位(9mer)的HLA I类限制性图谱进行比较。从公众可获得的蛋白质序列数据库或同行评审的出版物获得每个患者的抗原序列和HLA I类基因型，HLA I表位结合预测方法对患者的临床CD8+T细胞应答数据不知情，其中CD8+T细胞是产生IFN-γ的特异性针对疫苗肽的CTL(9mer)。确定预测与每位患者的至少1种(PEPI1+)、或至少2种(PEPI2+)、或至少3种(PEPI3+)、或至少4种(PEPI4+)、或至少5种(PEPI5+)、或所有6种(PEPI6+)HLA I类分子结合的每种抗原的表位数量，并将HLA结合的数量用作报告的CTL应答的分类器。从训练数据集中分别确定每个分类器的真阳性率(灵敏度)和真阴性率(特异性)(HLA结合的数量)。

对每个分类器进行ROC分析。在ROC曲线中，将不同截止点的真阳性率(灵敏度)绘制成假阳性率(1-特异性)的函数(图1)。ROC曲线上的每个点代表对应于特定判定阈值(表位(PEPI)计数)的灵敏度/特异性对。ROC曲线下的面积(AUC)是分类器能够在二个诊断组(CTL应答者或非应答者)间区分程度的量度。

该分析意外地揭示了由受试者的多种I类HLA预测的表位呈递(PEPI2+、PEPI3+、PEPI4+、PEPI5+或PEPI6)在每种情况下都比仅仅一种或多种HLA I类分子的表位呈递更好地预测CD8+T细胞应答或CTL应答(PEPI1+，AUC＝0.48，表6)。

表6 通过ROC分析确定PEPI生物标志物的诊断价值

通过考虑可由个体的至少3种HLA I类等位基因呈递的抗原表位，最佳地预测个体的CTL应答(PEPI3+，AUC＝0.65，表7)。最佳预测阳性CTL应答的PEPI3+(由个体的3种或更多种HLA呈递的抗原特异性表位的数量)的阈值计数是1(表7)。换句话说，受试者的至少3种HLA I类分子(≥1PEPI3+)呈递至少一种抗原衍生的表位，然后该抗原可以触发至少一种CTL克隆，并且受试者是可能的CTL应答者。使用≥1PEPI3+阈值预测可能的CTL应答者(“≥1PEPI3+检验”)提供了76％的真阳性率(诊断灵敏度)(表7)。

表7 确定≥1PEPI3+阈值以预测训练数据集中可能的CTL应答者

在回顾性分析中，来自51例患者的81个数据集的测试组群用于验证≥1PEPI3+阈值以预测抗原特异性CD8+T细胞或CTL应答。对于测试组群中的每个数据集，确定是否满足≥1PEPI3+阈值(由个体的至少三种I类HLA呈递的至少一个抗原衍生表位)。将其与临床试验报告的实验测定的CD8+T细胞应答(CTL应答)进行比较(表8)。

回顾性验证证明PEPI3+肽在个体中以84％的概率诱导CD8+T细胞应答(CTL应答)。84％是在PEPI3+预测的分析验证中确定的相同值，预测中表位与个体的至少3种HLA结合(表4)。这些数据提供了个体中PEPI诱导免疫应答的有力证据。

表8 诊断性能特征≥1PEPI3+测试(n＝81)

ROC分析使用PEPI3+计数作为临界值确定诊断准确度(图2)。AUC值＝0.73。对于ROC分析，AUC为0.7至0.8通常被认为是合理的诊断值。

至少为1(≥1PEPI3+)的PEPI3+计数最佳地预测了测试数据集中的CTL应答(表9)。该结果证实了在训练期间确定的阈值(表6)。

表9 确认≥1PEPI3+阈值以预测测试/验证数据集中可能的CTL应答者。

基于PEPI3+生物标志物的疫苗设计已经在OBERTO I/II期临床试验(NCT03391232)中，在转移性结肠直肠癌(mCRC)患者的I期临床试验中第一次被测试。在本研究中，我们评估了作为mCRC患者维持治疗的附加措施的单剂量或多剂量PolyPEPI1018的安全性、耐受性和免疫原性。PolyPEPI1018是含有12个独特表位的肽疫苗，所述表位来自经常在mCRC中表达的7个保守TSA(WO2018158455A1)。这些表位被设计成结合至少三个自体HLA等位基因，所述HLA等位基因比由单个HLA呈递的表位更可能诱导T细胞应答(参见实例2和3)。一线环境中的mCRC患者在刚过渡到用氟嘧啶和贝伐单抗维持治疗后接受疫苗(剂量：0.2mg/肽)。疫苗特异性T细胞应答首先通过计算机中PEPI3+的鉴定(使用患者的完整HLA基因型和CRC特异性的抗原表达率)预测，然后在一个接种循环(试验的I期部分)后通过ELISpot测量。

来自10名患者(1期组群和OBERTO试验数据集)的七十个数据集用于前瞻性验证PEPI3+生物标志预测抗原特异性CTL应答。对于每个数据集，在计算机上测定预测的PEPI3+，并与通过ELISPOT试验从患者血液测量的疫苗特异性免疫应答比较。然后将以这种方式确定的诊断特征(阳性预测值、阴性预测值、总体百分比一致性)与实例3中描述的回顾性验证结果进行比较。

总百分比一致性为64％，具有79％的高阳性预测值，表示具有预测的PEPI3+的患者将产生针对分析的抗原的CD8T细胞特异性免疫应答的79％概率。临床试验数据与回顾性试验结果显著相关(p＝0.01)，并提供了PEPI3+与PEPI试验一起计算的证据，以基于患者的完整HLA基因型预测抗原特异性T细胞应答(表10)。

表10 ≥1PEPI3+和PEPI试验的前瞻性验证

*51名患者；6个临床试验；81个数据集**10名患者；Treos I期临床试验(OBERTO)；70个数据集

选择推定的免疫保护性肿瘤抗原

假设肿瘤特异性抗原(TSA)是免疫保护性抗原，因为具有自发TSA特异性T细胞应答的癌症患者具有有利的临床过程。选择在不同肿瘤类型中表达的48个TSA来研究保护性肿瘤特异性T细胞应答(表11)。这些TSA已经在黑素瘤和其它癌症中研究，并且显示诱导自发T细胞应答。

表11 风险分析所选择的TSA

CRC：结肠直肠癌，NSCLC：非小细胞肺癌，HNSCC：头颈鳞状细胞癌，RCC：肾细胞癌

黑素瘤的发病率与HLAT数相关，表明黑素瘤特异性T细胞应答的宽度

假设黑素瘤高发病率人群中48种TSA的HLAT数低于高发病率人群。为了显示这一点，在黑素瘤发病率可用的不同种族群体中测定了48个TSA的HLAT数(图3)。

发现远东亚洲/太平洋地区的受试者比欧洲或美国起源的受试者具有高得多的HLAT数(图3)。例如，在中国台湾和美国的亚太岛人中黑素瘤的发病率为每100,000人1.5例，这显著低于美国的总体(每年每100,000人21.1例)。

HLAT分数与不同国家的黑素瘤发生率一致(图4)。获得20个数据点以计算平均HLAT分数和发病率(发病率可由国家获得，HLA数据可由种族获得，因此仅可对具有主要种族的那些国家获得配对的观察)。图4显示了在平均HLAT分数低于75的国家中的发病率和在平均HLAT分数高于75的国家中的发病率之间的显著差异。这些结果表明受试者的HLA基因型影响了不同种族群体中黑素瘤的发病率，并且显示HLAT数可以估计受试者的黑素瘤特异性T细胞应答。

受试者的HLAT分数是与HLA基因型相关的发展为黑素瘤的风险因子

HLAT数预测了T细胞对48个选择的TSA的应答宽度。假设不是所有的受试者的HLAT在黑素瘤的免疫控制中都发挥同等重要的作用。因此，HLAT(对于48个TSA)基于将黑素瘤患者与一般群体分开的能力进行加权。通常，权重越大，相应的TSA越重要。实际上，使用初始权重(截去的log p值)，AUC已经高于0.6。

二元分类器在从背景分离黑素瘤患者方面的性能

本研究使用二元分类法(参见方法)将来自dbMHC数据集(7,189患者组群)的US亚群(n＝1400)与也具有US起源(n＝513)的黑素瘤受试者进行比较。图5示出了使用HLAT分数作为二元分类器所获得的ROC曲线。HLAT分数预测受试者属于两个可能组中的哪个：黑素瘤癌组或背景群体。ROC曲线是通过在各种HLAT分值阈值设置下绘制真阳性率(TPR)对假阳性率(FPR)的图而呈现的。

获得的AUC值为0.645。该值表示两组之间的显著分离，特别是因为在黑素瘤/癌症发生的情况下，不仅存在单一的区别原因(例如HLAT)。最显著的阳光和室内晒黑暴露是黑素瘤风险的重要决定因素，表型如金色或红色毛发、蓝眼和雀斑以及遗传因素如Read etal.(J.Med.Genet.2016；53(1):1-14)描述的与黑素瘤相关的高外显率、3个中等外显率和16个低外显率基因。实际上，本研究中实现的10.065的转化z得分是高度显著的(p<0.001)。

受试者的HLAT分数是与HLA基因型相关的发展为黑素瘤的风险因子

基于HLAT得分将总测试群体(与癌症群体混合的背景群体)分成五个等大的组。与平均美国人群的风险相比，确定了每组中的相对免疫风险(RiR)(图6)。例如，在第一亚群中发展黑素瘤的风险为4.4％，而美国平均值为2.6％，因此，该亚群具有1.7的相对免疫风险。HLAT评分最低的组代表发生癌症的免疫学风险最高的群体。HLAT分数最高的组代表发生癌症的免疫风险最低的群体。最具风险的亚群由HLAT分数小于26的那些受试者组成，HLAT分数在第二风险的亚群中在29和51之间变化。在中间的20％是HLAT分数大于或等于51且低于88并且RiR<1的那些受试者，表明某些HLAT分数与黑素瘤风险的降低相关。有趣的是，这个HLAT分数范围51–88与HLAT分数(75)相似，其可以分离具有低和高黑素瘤发病率的群体(图6)。在第二受保护最多的亚群中，HLAT分值在88和164之间。最后，在最受保护的亚群中，每个受试者具有至少164的HLAT分数。在这些亚群中，如图6所示，发展黑素瘤的相对免疫风险单调下降，尽管在连续组之间没有显著变化，但第一组和最后一组之间的差异是显著的(p＝0.001)。

对六种其它癌症适应症进行了类似的分析。结果总结于表12中，AUC值对黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌和膀胱癌是显著的。p值对于头颈癌并不显著。然而，头颈癌与病毒HPV感染有关。本研究中仅使用TSA，不包括病毒蛋白。可能与病毒感染有关的发生某些癌症如头颈癌的风险可以通过在分析中包括病毒抗原而更好地确定。

表12 与平均人群相比，不同类型癌症的免疫学风险预测的总结

通过基于HLAT分数将测试群体(与癌症群体混合的背景群体)分成五个相等大的亚组，我们可以计算在非小细胞肺癌、肾细胞癌和结肠直肠癌(图7A-C)的情况下与某些HLAT分数相关的相对免疫风险。对于其他适应症，亚群中癌症受试者的数量太小而不能进行类似的分析。

计算风险亚组(20％的HLAT分数最低的试验人群)和受保护亚组(20％的HLAT分数最高的试验人群)之间的相对免疫风险比，并与平均美国人群的风险进行比较。例如，在表征的最危险亚群中发展黑素瘤的风险是4.4％。US平均值为2.4％，因此风险组具有1.7的相对免疫学风险。在保护组中发展黑素瘤的风险是0.7％。也就是说，最受保护的组的相对免疫风险为0.31。换句话说，与平均群体相比，该组具有低于三倍的发展黑素瘤的风险。黑素瘤达到的风险比是5.53(表12)。

实例5、6和10的方法

7,189位具有完整的4位HLA基因型的合格受试者从dbMHC数据库中鉴定。指示每个受试者的种族。我们的分析揭示了来自不同地理区域的亚群的HLA背景显著不同。为了消除这种地理影响，我们选择美国亚群(1400个受试者)作为背景(健康)群体，并将该亚群的HLA集与地理/民族匹配的癌症受试者的HLA集进行比较。美国亚种群包括所有高加索裔、西班牙裔、美国亚裔、美国非裔和本地民族。

合格的患者具有完整的4位HLA I类基因型。从以下来源获得来自513个黑素瘤患者的数据：

429名黑素瘤受试者的完整的4位HLA I类基因型可获得自3篇同行综述出版物(Snyder et al.N Engl J Med.2014；371(23):2189-99、Van Allen et al.Science.2015；350(6257):207-11、Chowell et al.Science.2018；359(375):582-7)。在Meral SloanKettering Cancer Center，用抗CTLA-4和/或PD-1/PD-L1抑制剂，在纽约纪念斯隆—凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSKCC)治疗患者。使用DNA测序数据或由LabCorp进行的临床验证的HLA分型测定，进行来自正常DNA的高分辨率HLA I类基因分型。17期III/IV黑素瘤患者的HLA基因型由MSKCC提供。这些患者在MSKCC，纽约用伊匹卢姆单抗(Ipilimumab)治疗(Yuan et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(40):16723-8)。65名黑素瘤患者，其来自于第3期随机化双盲多中心研究(CA184007、NCT00135408)和第2期(CA184002、NCT00094653)的患者，所述患者相应地患有不可切除的III期或IV期恶性黑素瘤和先前治疗过的不可切除的III期或IV期黑素瘤。这65名在纽约MSKCC处治疗的患者具有由Bristol-Myers-Squibb提供的用于HLA检测的可用样品。样品用NGS G组分辨率进行回顾性测试，HLA等位基因解释基于IMGT/HLA数据库版本3.15。HLA结果是使用基于序列的分型(SBT)、序列特异性寡核苷酸探针(SSOP)和/或序列特异性引物(SSP)获得的，以获得所需的分辨率。HLA试验由美国LabCorp进行。

370名非小细胞肺癌、129肾细胞癌、87名膀胱癌、82名胶质瘤和58名头颈癌受试者的HLA基因型数据收集自同行综述出版物(Chowell et al.)。

来自37名结肠直肠癌(CRC)患者的HLA基因型的数据获自National Center forBiotechnology(NCBI)Sequence Read Archive,Encyclopedia of deoxyribonucleicacid elements(Boegel et al.Oncoimmunology.2014；3(8):e954893)。来自211个越南裔和84个白种非西班牙裔CRC患者的血样获自Asterand Bioscience，并且HLA基因型由LabCorp(Burlington NC)鉴定。

选择48个TSA。这些抗原的氨基酸序列数据获自UniProt。

发病率从http://globocan.iarc.fr/Pages/online.aspx获得。

HLA I类基因在大多数细胞中表达并与T细胞受体识别的表位结合。结合人的六个HLA等位基因的至少三个HLA(HLA三联体或HLAT)的表位可以产生T细胞应答。对于每个j＝1、2、...6，我们建立评分系统以基于受试者的免疫系统能够结合表位的程度来对受试者的免疫系统评分。基于组合学，对于特定表位存在

受试者的HLAT用PEPI测试鉴定，验证以93％的准确性鉴定HLA结合表位。

受试者x的HLAT分数定义为：

其中C是TSA的集合，C是特定TSA，w(c)是TSA c的权重，并且p(x,c)是受试者x中TSA c的HLAT数。

对于HLAT分数没有将癌症患者与背景人群显著分开的每个TSA，初始权重为0。由于我们假定具有HLAT不增加发生癌症的机会，因此仅考虑非阴性权重。初始权重定义为

其中t(c)表示对癌症和背景群体的TSA c的HLAT分数的单侧t检验的p值，48是Bonferroni校正。

使用并行退火进一步优化初始重量。已经应用了六个平行的马尔可夫链，温度RT＝0.001、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2。假设能量定义为RiRR(相对免疫风险比，见下文)和AUC的总和的-1倍。已经报道了提供最大相对风险比的权重。

RiR通过亚群和总测试群体(癌症群体和背景群体)之间的风险比计算，置信区间(CI)为95％。为此目的，考虑到生命期风险，以类似于普通美国人群中不同癌症患者的百分比的方式来组合普通人群。从美国癌症协会的网站获得了发展不同类型癌症的终生风险。通常，男性和女性的终生风险不同，因此我们取他们的(和谐)平均值。如此获得的风险是：黑素瘤为1:38，肺癌为1:16，肾细胞癌为1:61，结直肠癌为1:23，膀胱癌为1:41，头颈癌为1:55，胶质瘤为1:161。RiR>1表明与平均群体中的受试者相比，受试者具有更高的发生特定癌症的风险。

RiR比值计算为HLAT分数最高和最低的组间的比值。

当开发筛选试验时，我们考虑了几种评分方案。潜在的评分方案的区别在于HLA等位基因组与一个特定表位结合的最小大小，所述表位被认为有助于受试者的评分。对于HLA等位基因子集的每个大小j＝1、2、...、6，我们基于每个等位基因参与训练受试者的HLA j元组结合特定表位的频率来计算每个等位基因的显著性评分。简言之，如果具有给定HLA等位基因的受试者具有比不具有给定HLA等位基因的受试者显著更多的具有HLA j-mer的表位，则我们认为显著性评分是阳性的。如果具有给定HLA等位基因的受试者具有比不具有给定HLA等位基因的受试者显著更少的HLA j-mer表位，则显著性评分为负。然后对于每个受试者，我们将他/她的HLA等位基因的显著性评分相加。接下来，我们通过计算接受者操作特征曲线(ROC-AUC，AUC)下的面积测试了这些总计的评分可以如何好地区分黑素瘤和背景受试者。根据表13，j＝2和j＝3同样实现了黑素瘤和背景群体的最佳分离，基于1-组和j-组不同评分的AUC值之间的显著差异，j>1，表明多个HLA等位基因对表位的呈递在产生有效的抗肿瘤免疫应答中起重要作用。此外，这些结果表明，基于其HLA基因型的单个等位基因来分离癌症和背景(健康)受试者将是具有挑战性的。当j＝6时AUC值的下降可以用这样的事实解释，即仅存在非常有限数量的表位-HLA等位基因组合，其中受试者的所有6个HLA等位基因可以结合表位。

表13 计算具有不同HLA j-组的黑素瘤的AUC值

比较美国黑素瘤和背景受试者的AUC值(0.69)表明使用HLA分数，两组之间有显著的分离。实际上，转化的z值为12.57，这是高度显著的(p<0.001)。这些结果证明受试者的HLA基因型影响发生黑素瘤的遗传风险。

基于HLA分数，背景和黑素瘤群体基于它们的HLA分数(s)被分成五个相等大小的亚组；s<34，34≤s<55，55≤s<76，76≤s<96和96

我们计算了最受保护组和最处于风险的组(RR

在某些情况下，HLA等位基因(h)的显著性分数被定义为

其中u(h)是等位基因h的双侧u检验的p值，其确定两个个体亚组中HLAT的数目是否不同：一个亚组中的个体具有HLA h，一个亚组中的个体不具有HLA h。B是Bonferroni校正，如果具有h等位基因的亚群中HLAT的平均数大于不具有h的亚群中HLAT的平均数，则sign(h)为+1，否则为-1。在一些情况下，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来进一步优化该初始分数。在一些情况下，这些显著性得分的总和用于确定受试者将发展癌症的风险与受试者将发展癌症的风险相关。

要使用的具体分数取决于适应症和先验数据。在一些情况下，将基于对可用测试数据集的不同计算的性能来做出选择。性能可以通过AUC值(ROC曲线下的面积)或通过本领域技术人员已知的任何其它性能优度评分来评价。

我们使用与黑素瘤所述相同的方法测定非小细胞肺癌、肾癌、结肠直肠癌、膀胱癌、头颈癌和神经胶质瘤的ROC曲线、RR和RR

我们获得了所研究的癌症适应症的RR

表14 不同癌症类型中的免疫风险预测

*风险组，HLA分数最低的20％的一般群体；受保护组，20％的一般人群具有最高HLA分数。每种癌症适应症都针对相同的背景群体进行分类。RR

本实例显示了如何计算实例20中描述的患者D的HLAT分数，患者D已被诊断为患有转移性结肠直肠癌。使用患者D的HLA基因型，确定48个选择的TSA上的PEPI3、PEPI4、PEPI5和PEPI6表位的预测数量(表15)。基于统计，计算每个TSA的HLAT总数(表15的第6、14和22行)和每个TSA的加权分数(表15的第8、16和24行)。该加权分数简单地是HLAT的总数与TSA的权重的乘积(表15的第7、15和23行)。用实例6的“HLAT分数权重优化”部分中所述的方法获得权重，总的加权分数(如等式(1)中所述)是43.09。基于美国CRC和美国背景人群的比较，D患者患结直肠癌的风险是美国普通人的1.26倍。由于在美国发生CRC的风险是4.2％，基于我们的结果，患者D的风险是5.3％。

在OBERTO试验中，我们预测了7个抗原和11个受试者的免疫应答，并且还测量了10个患者样本的免疫应答。疫苗的7种抗原是48种TSA的一部分。预测和测量总结在表16中，总的百分比一致性是64％。

表16 测量和PEPI测试预测了对所列TSA特异性的包含疫苗的肽的免疫应答。

我们将HLAT分数和抗原数目与测量的免疫应答进行了比较(图9)。我们发现HLAT分值和抗原数量与免疫应答之间的正相关性。然而，我们不期望与如此少量的测量(n＝10)有显著的相关性，并且因为HLAT分数考虑了预测的48个抗原的表位结合，而仅对48个抗原中的7个抗原测量了免疫应答，因此该分析能够显示相关性，但是提供了低的统计学能力。)

表17 基于HLAT分数的分类：

表18 基于HLA分数的分类：

可以看出，基于HLAT分数的分类在结肠直肠癌的情况下更好，而基于HLA分数的分类在头颈癌的情况下更好。

为了进一步证明HLA基因型也在群体水平上影响发生癌症的风险，我们研究了其与国家特异性发病率的关系。我们假设平均HLA分数，即具有高黑素瘤发生率的群体的癌症特异性T细胞应答，将显著低于具有低发生率的群体的HLA分数。因此，我们确定了代表59个不同国家的受试者的HLA分数。我们发现，远东亚洲和太平洋地区的对象具有比欧洲或美国起源的对象(范围50和90)高得多的HLA分数(范围75–140)和更低的发病率(范围0.4–3.4)，其中在欧洲或美国起源的对象中，发病率最高(范围12.6–13.8)(图10)。聚焦于美国人口中，中国台湾和亚太岛人每100,000人中1.5人的发病率显著低于美国普通人口(每年每100,000人中21.1人)，这证实了我们的结果。发病率可由国家获得，而HLA基因型数据可由种族获得。因此，我们只能获得那些具有优势种族的国家的观测结果对。我们从主要种族中鉴定了具有HLA基因型数据的20个国家(在图10中用黑色突出显示)，对于这些国家我们确定了平均HLA分数并将它们与黑素瘤的发病率进行比较。我们发现黑素瘤的发病率和平均HLA分数之间存在显著相关性(图11)。对于给定数量的点(n＝20；自由度，df＝18)，相关系数R

这些结果表明，受试者的HLA基因型影响不同种族群体中黑素瘤的发病率，并且一致地表明HLA分数可用于确定黑素瘤的免疫遗传风险。

A*02:01、C*05:01、C*07:01是与CLL(慢性淋巴细胞白血病)相关的HLA等位基因(Gragert et al.，2014)，即具有这些HLA I类等位基因中的任一个的受试者发生CLL的风险增加。在HLA分数训练期间，我们观察到，训练群体中具有任何这些HLA的受试者对于所分析的48个TSA具有比不具有这些HLA的受试者显著更少的HLAT。表19显示了在9个最常见HLA等位基因的情况下48个TSA的平均HLAT数。然而，这些少数HLA等位基因仅可在群体的一小部分中发现，因此，从癌症和这些少数等位基因之间的关联中获得的信息不能用于不具有这些等位基因中的任何等位基因的受试者。另一方面，HLA分数法为所有受试者分配信息性分数，因此可用于对整个群体进行分类。因此，HLA分数法提供了比仅使用关于个体HLA等位基因与癌症之间的关联的信息的方法更好的分类。

表19 对具有CLL风险增加的HLA A*02:01或C*05:01或C*07:01等位基因之一的个体进行HLAT分析。

已知Epstein-Barr病毒(EBV)感染可诱导未分化鼻咽癌(UNPC)。Pasini et al.分析了82名意大利UNPC患者和来自同一群体的286名骨髓捐献者，并观察到在UNPC受试者中未充分表现能够结合给定区域中的一些EBV表位的一些保守等位基因，A*0201、B*1801和B*3501HLA(Pasini E et al.Int.J.Cancer:125,1358–1364(2009))。然而，群体中频繁等位基因的研究是与免疫应答诱导真实靶HLA组合的研究完全不同的方法，如个体的HLAT库分析。因为后者提示了人产生杀死T细胞所有组成成分的患病细胞的潜力，这是解释免疫遗传学“进展”或风险的机制。此外，他们发现了对保护性HLA等位基因的加性作用。然而，他们没有推断这些HLA等位基因是否可以结合不同EBV抗原上的相同表位或不同表位。他们还发现了与UNPC正相关的HLA等位基因，然而，他们不能测量这些HLA等位基因结合EBV表位的能力降低。他们仅考虑来自EBV的抗原，因此他们的方法不能推广到其它癌症。由于即使最常见的HLA等位基因也只覆盖整个群体的有限部分，因此不能仅基于它们构建诊断装置。例如，在仅基于A*02:01等位基因的装置中，AUC值仅为0.573(图12)。组合的单体型A*02:01/B*18:01甚至更稀有，并且尽管OR值高，基于分析单个“单体型”的装置将仅具有0.556的AUC值。这意味着，它不能将由82名UNPC患者组成的群体与286名受试者的背景显著分离，转化的Z值为1.65，相应的p值(对于一侧测试)为0.06。

OBERTO试验是PolyPEPI1018疫苗和CDx用于治疗转移性结肠直肠癌的I/II期试验(NCT03391232)。研究设计如图11所示。

入选标准

·组织学上证实的源自结肠或直肠的转移性腺癌

·根据RECIST 1.1的至少1个可测量参考病变的存在

·在用全身性化疗方案和1种生物学治疗方案的一线治疗期间的部分应答或稳定疾病

在诱导期间使用氟嘧啶(5-氟尿嘧啶或卡培他滨)加上相同生物剂(贝伐单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗)的维持疗法，计划在用研究药物治疗的第一天之前开始

·在治疗的第一天之前3周或更短时间的最后一次CT扫描

对象戒断和中止

·在最初的研究阶段(12W)，如果患者经历疾病发展并需要开始二线治疗，则患者将退出研究。

·在研究的第二部分期间(第2次给药后)，如果患者经历疾病进展并且需要开始二线治疗，则患者将保持在研究中，按照计划接受第三次疫苗接种并且完成随访。

·如预期的，观察到接种部位的短暂局部红斑和水肿，以及具有轻微发热和疲劳的流感样综合征。这些反应对于肽疫苗接种是已知的，并且通常与作用机制相关，因为发热和流感样综合征可能是诱导免疫应答的后果和征兆(这被称为用于儿童疫苗接种的典型疫苗反应)。

·仅记录了与疫苗“可能相关”的一个严重不良事件(SAE)(表20)。

·发生了与疫苗无关的单剂量限制性毒性(DLT)(昏厥)。

安全性结果总结于表19中。

表20 OBERTO临床试验中报道的严重不良事件。没有出现相关SAE(仅1个“可能相关”)。

共享的肿瘤抗原能够精确靶向所有肿瘤类型——包括具有低突变负荷的肿瘤类型。先前从2,391个CRC活组织检查收集的群体表达数据代表世界范围内CRC患者中抗原表达的变异性(图14A)。

PolyPEPI1018是一种肽疫苗，我们设计它含有12个独特的表位，这些表位来自于7个保守睾丸特异性抗原(TSA)，它们经常在mCRC中表达。在我们的模型中，我们假设通过选择CRC中频繁表达的TSA，靶鉴定将是正确的并且将消除对肿瘤活检的需要。我们已经计算出7种TSA中的3种在每种肿瘤中表达的概率大于95％(图14B)。

在I期研究中，我们评价了PolyPEPI1018作为转移性结肠直肠癌(mCRC)(NCT03391232)患者维持治疗的附加物的安全性、耐受性和免疫原性(也参见实例4)。

免疫原性测量证明了预先存在的免疫应答，并间接证实了患者中靶抗原的表达。用富集荧光斑点分析(ELISPOT)从接种前分离的PBMC样品和在随后用PolyPEPI1018单次免疫后的不同时间点测量免疫原性以证实疫苗诱导的T细胞应答；用疫苗特异性肽(9mer和30mer)体外刺激PBMC样品以确定基线以上的疫苗诱导的T细胞应答。平均4个，至少2个患者具有预先存在的针对每种靶抗原的CD8 T细胞应答(图14C)。10名患者中有7名预先存在针对至少1种抗原的免疫应答(平均3种)(图14D)。这些结果提供了正确的靶标选择的证据，因为在用PolyPEPI1018疫苗接种之前，CD8+T细胞对CRC特异性靶标TSA的应答证实了该靶标抗原在所分析的患者中的表达。靶向真实(表达的)TSA是有效肿瘤疫苗的先决条件。

PolyPEPI1018疫苗含有六个30mer肽，每个肽通过连接二个衍生自7个TSA的免疫原性15mer片段(每个片段涉及9merPEPI，因此通过设计在每个30mer中有2个PEPI)而设计(图15)。基于2,391个活组织检查的分析，这些抗原经常在CRC肿瘤中表达(图14)。

基于PEPI测试预测，对模型群体(n＝433)和CRC群组(n＝37)计算的临床前免疫原性结果导致98％和100％预测的免疫原性，并且这在OBERTO试验(n＝10)中得到临床证明，其中在90％的患者中测量了至少一种抗原的免疫应答。更有趣的是，90％的患者具有针对至少2种抗原的疫苗肽特异性免疫应答，80％具有针对3种或更多种不同疫苗抗原的CD8+T细胞应答，显示了在PolyPEPI1018设计期间适当靶抗原选择的证据。CD4+T细胞特异性和CD8+T细胞特异性临床免疫原性详述于表21中。发现对效应和记忆效应T细胞，CD4+和CD8+T细胞都具有高免疫应答率，10名患者中有9名被疫苗加强或重新诱导。另外，CRC反应性的、多功能性CD8+和CD4+T细胞的比例在接种后在患者的PBMC中分别增加了2.5倍和13倍。

表21 mCRC中PolyPEPI1018的临床免疫原性结果。

分析在实例4、12、13和14中进一步描述的OBERTO临床试验(NCT03391232)的初步客观肿瘤反应率(RECIST 1.1)(图16)。在十一名接受维持治疗的接种患者中，5名在初步分析的时间点(12周)具有稳定的疾病(SD)，3名在治疗(维持治疗+接种)中观察到意外的肿瘤应答(部分应答，PR)，3名根据RECIST 1.1标准已经发展为疾病(PD)。在69％的维持治疗(卡培他滨和贝伐单抗)的患者中实现了作为最佳反应的稳定疾病。020004患者12周后疗效持久，010004患者疗效持久，适合根治性手术。第3次接种后，该患者没有疾病迹象，因此是完全应答者，如图16的泳池分布图所示。

一次接种后，ORR为27％，DCR为63％，在接受至少2个剂量(3个剂量中)的患者中，5个中有2个具有ORR(40％)，DCR高达80％(5个患者中有4个为SD+PR+CR)(表22)。

表22 在≥1和≥2疫苗接种剂量后，对于POEPI1018处理的临床应答

基于在OBERTO-101临床试验中接受多剂量PolyPEPI1018疫苗的5名患者的数据，初步数据表明更高的AGP计数(>2)与更长的PFS和升高的肿瘤尺寸减小有关(图14B和C)。

本实例提供了来自4名转移性癌症患者的概念数据的证据，所述患者用个性化免疫治疗疫苗组合物治疗以支持受试者的多个HLA结合表位以诱导细胞毒性T细胞应答的原理，本公开部分基于所述原理。

本实例描述了用个性化免疫疗法组合物治疗卵巢癌患者，其中基于本文所述的公开内容，基于其HLA基因型为患者特别设计组合物。

转移性卵巢腺癌患者(患者A)的HLA I类和II类基因型由唾液样本确定。

为了制备用于患者A的个性化药物组合物，选择13种肽，每种肽满足以下二个标准：(i)衍生自卵巢癌中表达的抗原，如在同行评审的科学出版物中所报告的；和(ii)包含能够结合患者A的至少三种HLA I类分子的T细胞表位的片段(表23)。此外，优化每种肽以结合患者的最大数量的HLA II类。

表23 卵巢癌患者A的个性化疫苗。

根据表4中所示的PEPI测试的验证，该免疫疗法组合物中的11种PEPI3肽可以以84％的概率诱导患者A中的T细胞应答，并且二种PEPI4肽(POC01-P2和POC01-P5)以98％的概率诱导T细胞应答。T细胞应答靶向在卵巢癌中表达的13种抗原。未测试这些癌症抗原在患者A中的表达。相反，基于患者癌细胞中抗原表达的概率和≥1PEPI3+测试(AGP计数)的阳性预测值确定成功杀死癌细胞的概率。AGP计数预测疫苗在受试者中的有效性：用PEPI在患者肿瘤(卵巢腺癌)中表达的疫苗抗原的数量。AGP计数表示疫苗识别并诱导针对患者肿瘤的T细胞应答(击中靶标)的肿瘤抗原的数量。AGP计数取决于受试者肿瘤中的疫苗—抗原表达率和受试者的HLA基因型。正确的值必须在0(没有任何表达抗原呈递PEPI)和抗原的最大数量(所有抗原都表达并呈递PEPI)之间。

患者A将表达13种抗原中的一种或多种的概率如图17所示。AGP95(AGP具有95％概率)＝5，AGP50(平均预期值-离散概率分布)＝7.9，mAGP(AGP至少为2的概率)＝100％，AP＝13。

用于患者A的药物组合物可以由13种肽中的至少2种组成(表23)，因为确定在疫苗或免疫疗法组合物中呈递至少二种可以结合个体的至少三种HLA(≥2PEPI3+)的多肽片段(表位)可预测临床应答。合成肽，溶解于药学上可接受的溶剂中，并在注射前与佐剂混合。希望患者接受至少二种肽疫苗的个性化免疫疗法，但更优选增加杀死癌细胞的可能性并减少复发的机会。

为了治疗患者A，将13种肽配制成4×3或4肽(POC01/1，POC01/2，POC01/3，POC01/4)。一个治疗周期定义为在30天内施用所有13种肽。

患者病史：

诊断：转移性卵巢腺癌

年龄：51岁

家族既往症：结肠癌和卵巢癌(母亲)；乳腺癌(祖母)

肿瘤病理学：

2011：首次诊断为卵巢腺癌；Wertheim手术和化疗；淋巴结清除术

2015：心包脂肪组织转移，切除

2016：肝转移瘤

2017：腹膜后及肠系膜淋巴结肿大；初期腹膜癌合并少量腹水

先前治疗：

2012：紫杉醇—卡铂(6×)

2014：楷莱—卡铂(1×)

2016-2017(9个月)：Lymparza(奥拉帕尼)2×400mg/天，口服

2017：和美新(hycamtin)输注5×2.5mg(3×一个系列/月)

PIT疫苗治疗始于2017年4月21日。图18。

2017-2018：患者A接受8个接种周期作为附加治疗，并在治疗开始后17个月(528天)存活。在这个时间间隔内，在第3次和第4次疫苗治疗后，她经历部分反应作为最佳反应。她在十月2018年死亡。

干扰素(IFN)-γELISPOT生物测定证实了患者A对13种肽的预测的T细胞应答。在所有13种20mer肽和所有13种9mer肽(具有能够与患者A的最多的HLA I类等位基因结合的每种肽的PEPI的序列)中均检测到阳性T细胞应答(定义为，高于对照>5倍，或高于对照>3倍和>50个点)(图19)。

患者肿瘤MRI的结果(基线：2016年4月15日)(BL：图20中肿瘤反应评价的基线)

疾病主要限于肝和淋巴结。MRI的使用限制了在肺(肺的)转移的检测

2016年5月至2017年1月：奥拉帕尼治疗(FU1：图20的随访1)

2016年12月25日(在PIT疫苗治疗之前)在(FU2：图20中的随访2)证实了肿瘤负荷显著降低

2017年1至3月——TOPO方案(拓扑异构酶)

2017年4月6日：(图20中的随访3)展示了现有病变的再生长及新病变的出现导致疾病进展。腹水增多的腹膜癌病。进行性肝肿瘤和淋巴结

2017年4月21日开始PIT

2017年6月26(第2个PIT周期后):(图20的随访4)进展/伪进展

淋巴结、肝、腹膜后和胸区域快速发展，大量胸膜液和腹水。起动卡铂、吉西他滨、阿瓦斯汀。

2017年9月20(第3个PIT周期后):(图20的随访5)部分应答

胸膜/流体和腹水的完全缓解

肝、腹膜后区域和淋巴结的缓解

这些发现提示伪进展。

2017年11月28(第4个PIT周期后):(图20的随访6)部分应答

胸部完全缓解。肝、腹膜后区域和淋巴结的缓解

2018年4月13日：进展

在胸部和腹膜后区域完全缓解。肝中心和淋巴结的进展

2018年6月12日：病情稳定

在胸部和腹膜后区域完全缓解。肝中心和淋巴结的最小消退

2018年7月：进展

2018年10月：患者死亡

患者A的部分MRI数据示于表24和图20中。

表24 损伤反应的汇总表

从唾液样本确定转移性乳腺癌患者B的HLA I类和II类基因型。为了制备用于患者B的个性化药物组合物，选择12种肽，每种肽满足以下二个标准：(i)衍生自乳腺癌中表达的抗原，如在同行评审的科学出版物中所报告的；和(ii)包含能够结合患者B的至少三种HLAI类分子的T细胞表位的片段(表25)。此外，优化每种肽以结合患者的最大数量的HLA II类。这12种肽靶向12种乳腺癌抗原。患者B将表达12种抗原中的一种或多种的概率如图21所示。

表24 对治疗乳腺癌患者B的12种肽

预测疗效：AGP95＝4；PIT疫苗诱导针对BRC09乳腺癌细胞中表达的4种TSA的CTL应答的可能性为95％。其他疗效参数：AGP50＝6.45，mAGP＝100％，AP＝12。

为了治疗患者B，将12种肽配制成4×3肽(PBR01/1、PBR 01/2、PBR 01/3、PBR 01/4)。一个治疗周期定义为在30天内施用所有12种不同的肽疫苗(图21C)。

患者病史：

2013：诊断：乳腺癌诊断；CT扫描和骨扫描排除了转移性疾病。

2014：双侧乳房切除术、术后化疗

2016：伴有膈上和膈下淋巴结累及的广泛转移性疾病。多发性肝和肺转移。

治疗：

2013–2014：阿霉素-环磷酰胺和紫杉醇

2017：来曲唑(Letrozole)、帕博西尼(Palbociclib)和戈舍瑞林(Gosorelin)以及PIT疫苗

2018：病情加重，患者于一月死亡

PIT疫苗治疗开始于2017年4月7日。患者B的治疗方案和疾病的主要特征如表26所示。

表25 患者B的治疗和反应

无数据

以95％的置信度预测8至12个疫苗肽将在患者B中诱导T细胞应答。使用干扰素(IFN)-γELISPOT生物测定法在所有可获得的PBMC样品中测量肽特异性T细胞应答(图22)。结果证实了预测：9种肽反应呈阳性，表明T细胞可识别患者B的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞表达FISP1、BORIS、MAGE-A11、HOM-TES-85、NY-BR-1、MAGE-A9、SCP1、MAGE-A1和MAGE-C2抗原。一些肿瘤特异性T细胞在第1次接种后存在，并用另外的处理(例如MAGE-A1)加强，其它在加强后诱导(例如MAGE-A9)。这种广泛的肿瘤特异性T细胞应答在晚期癌症患者中是显着的。

2017年3月7日：先前PIT疫苗治疗

肝脏多发性转移性疾病，伴有胆总管起源真性外部压迫和肝内胆管大量扩张。腹腔、肝门及腹膜后腺病

2017年3月：治疗起始——来曲唑、帕博西尼、戈舍瑞林和PIT疫苗

2017年5月：药物中断

2017年5月26日：1个PIT周期后

肿瘤代谢活性(PET CT)肝脏、肺淋巴结和其他转移瘤降低83％。

2017年6月：如患者所确认的那样，标准化的嗜中性粒细胞值显示帕博西尼中断

肿瘤标志物的4个月延迟反弹

2017年3月至5月：CEA和CA保持升高，与她的抗癌治疗的结果一致(Ban,FutureOncol 2018)

2017年6月至9月：CEA和CA随着对免疫疗法的延迟反应而一致性降低

生活质量

2017年2月至3月：差，因黄疸而住院

2017年4月至10月：极佳

2017年11月：(病情恶化(肿瘤逃逸？))

2018年1月：患者B死亡。

免疫原性结果总结于图22中。

患者的临床结果测量：在PIT疫苗治疗开始前一个月，PET CT证明广泛的DFG亲和(avid)疾病在膈的上方和下方都有结节牵连(表26)。她患有进行性多发性肝、多灶性骨和肺转移和腹膜后腺病。HER肝内酶升高，与由具有升高的胆红素和黄疸的HER肝转移引起的损伤一致。她接受来曲唑、帕博西尼和戈舍瑞林作为抗癌治疗。PIT接种开始后二个月，患者感觉非常好，并且其生活质量正常化。事实上，她的PET CT显示在肝、肺、骨和淋巴结转移中的显著的形态代谢消退。在膈上阶段没有鉴定出代谢性腺病。

帕博西尼和个体化疫苗的组合可能是给予疫苗后观察到的显著早期应答的原因。已经证明帕博西尼通过增加HLA的CTA呈递和减少Treg的增殖来改善免疫疗法的活性(Goelet al.Nature.2017:471-475)。患者B治疗的结果提示，PIT疫苗可作为现有技术治疗的附加物，以获得最大疗效。

跟踪患者B的肿瘤生物标志物以使现有技术疗法的效果与PIT疫苗的效果分开。肿瘤标记物在治疗的最初2–3个月期间没有变化，然后急剧下降，表明延迟的效果，其是免疫疗法的典型效果(表26)。此外，在肿瘤生物标志物下降时，患者已经自愿中断治疗并通过嗜中性粒细胞计数的增加来确认。

在第5次PIT治疗后，患者经历症状。肿瘤标记物和肝酶水平再次增加。最后一次PIT接种后33天，她的PET CT在肝脏、腹膜、骨骼和左肾上腺部位显示了显著的代谢进程，证实了实验室的发现。远距离转移中的不连续复发可能是由于潜在的免疫抗性；可能是由损害PIT诱导的T细胞对肿瘤的识别的HLA表达的下调所引起的。然而，PET CT检测到所有腋窝和纵隔腋窝上横膈膜目标的代谢活性完全消退(表26)。这些局部肿瘤反应可以解释为已知的对免疫疗法的延迟和持久的反应，因为在抗癌药物治疗中断之后这些肿瘤部位不可能复发。

制备了设计上与描述的患者A和患者B相似的PIT疫苗，用于治疗转移性乳腺癌患者(患者C)。PIT疫苗含有12个PEPI。PIT疫苗的预测功效为AGP＝4。患者的治疗方案示于图23。

肿瘤病理学

2011原生肿瘤：HER2-、ER+、前哨淋巴结阴性

2017多种骨转移：ER+、细胞角蛋白7+、细胞角蛋白20-、CA125-、TTF1-、CDX2-

治疗

2011广泛局部切除，前哨淋巴结阴性；放射治疗

2017–抗癌疗法(Tx)：来曲唑(2.5mg/天)，Denosumab；

辐射(Rx)：一根骨头

作为护理标准品的附加的PIT疫苗(3个周期)

生物测定证实，在12种PTI疫苗的20mer肽中的11种和12种9mer肽(具有能够与患者A的最多的HLA I类等位基因结合的每种肽的PEPI的序列)中均检测到阳性T细胞应答(定义为，高于对照>5倍，或高于对照>3倍和>50个点)(图24)。

在最后一次接种14个月后检测到持久的记忆T细胞应答(图24C–D)。

治疗结果

患者C的临床治疗结果如表35所示，患者C具有部分反应和治愈骨转移的迹象。

表26 乳腺癌患者C的临床治疗结果

*PIT疫苗接种3个周期后

免疫应答如图24所示，预测的免疫原性，PEPI＝12(CI95％[8,12]

检测的免疫原性：3次PIT接种后的11(20mer)和11(9mer)抗原特异性T细胞应答(图24A、B)。在最后一次接种4.5、11或14个月后，仍然可以检测到PIT疫苗特异性免疫应答(图24C、D)。

肿瘤病理学

2017(2月) 具有肝转移的，手术引发肿瘤(在乙状结肠中)。pT3 pN2b(8/16)M1.KRAS G12D、TP53-C135Y、KDR-Q472H、MET-T1010I突变。SATB2表达。EGFR wt，PIK3CA-I391M(非驱动)。

2017(6月) 部分肝切除：KRAS-G12D(35G>A)NRAS wt，

2018(5月) 2次切除：SATB2表达，肺转移3→21

治疗

2017 在二次治疗过程中的FOLFOX-4(奥沙利铂(oxaliplatin)，亚叶酸钙(Ca-folinate)，5-FU)过敏反应

德格蒙特(DeGramont)(5-FU+亚叶酸钙)

2018(6月) FOLFIRI加雷莫芦单抗(ramucirumab)，每二周；化疗栓塞

2018(10月)PIT疫苗接种(13种患者特异性肽，4种剂量)作为标准护理的附加物。

患者的治疗方案示于图25。

治疗结果

患者处于良好的总体状况，8个月后肺中的疾病进展通过CT证实。

PIT诱导的和预先存在的T细胞应答都通过来自PBMC的富集的荧光斑点来测量，使用9mer和20mer肽用于刺激(图26)。

免疫应答率和免疫原性结果的总结证明了针对靶抗原选择以及诱导多肽靶向免疫应答(CD4+和CD8+特异性应答)的合理设计。

表28 患者A–D的免疫学分析汇总表

*1至3个周期的疫苗接种后。

序列表

<110> 特雷斯生物公司（Treos Bio Zrt）

<120> 免疫原性癌症筛选试验

<130> N409652WO

<150> 1814361.0

<151> 2018-09-04

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P1 AKAP4

<400> 1

Asn Ser Leu Gln Lys Gln Leu Gln Ala Val Leu Gln Trp Ile Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gln Phe Asn

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P2 BORIS

<400> 2

Ser Gly Asp Glu Arg Ser Asp Glu Ile Val Leu Thr Val Ser Asn Ser

1 5 10 15

Asn Val Glu Glu

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P3 SPAG9

<400> 3

Val Gln Lys Glu Asp Gly Arg Val Gln Ala Phe Gly Trp Ser Leu Pro

1 5 10 15

Gln Lys Tyr Lys

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P4 OY-TES-1

<400> 4

Glu Val Glu Ser Thr Pro Met Ile Met Glu Asn Ile Gln Glu Leu Ile

1 5 10 15

Arg Ser Ala Gln

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P5 SP17

<400> 5

Ala Tyr Phe Glu Ser Leu Leu Glu Lys Arg Glu Lys Thr Asn Phe Asp

1 5 10 15

Pro Ala Glu Trp

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P6 WT1

<400> 6

Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro

1 5 10 15

Tyr Leu Pro Ser

20

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P7 HIWI

<400> 7

Arg Arg Ser Ile Ala Gly Phe Val Ala Ser Ile Asn Glu Gly Met Thr

1 5 10 15

Arg Trp Phe Ser

20

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P8 PRAME

<400> 8

Met Gln Asp Ile Lys Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile

1 5 10 15

Glu Asp Leu Glu

20

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P9 AKAP-3

<400> 9

Ala Asn Ser Val Val Ser Asp Met Met Val Ser Ile Met Lys Thr Leu

1 5 10 15

Lys Ile Gln Val

20

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P10 MAGE-A4

<400> 10

Arg Glu Ala Leu Ser Asn Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu

1 5 10 15

Arg Lys Tyr Arg

20

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P11 MAGE-A9

<400> 11

Glu Thr Ser Tyr Glu Lys Val Ile Asn Tyr Leu Val Met Leu Asn Ala

1 5 10 15

Arg Glu Pro Ile

20

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P12a MAGE-A10

<400> 12

Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Thr Gly His Ser Phe Val Leu Val Thr

1 5 10 15

Ser Leu Gly Leu

20

<210> 13

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> POC01_P12b BAGE

<400> 13

Ser Ala Gln Leu Leu Gln Ala Arg Leu Met Lys Glu Glu Ser Pro Val

1 5 10 15

Val Ser Trp Arg

20

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP1 FSIP1

<400> 14

Ile Ser Asp Thr Lys Asp Tyr Phe Met Ser Lys Thr Leu Gly Ile Gly

1 5 10 15

Arg Leu Lys Arg

20

<210> 15

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP2 SPAG9

<400> 15

Phe Asp Arg Asn Thr Glu Ser Leu Phe Glu Glu Leu Ser Ser Ala Gly

1 5 10 15

Ser Gly Leu Ile

20

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP3 AKAP4

<400> 16

Ser Gln Lys Met Asp Met Ser Asn Ile Val Leu Met Leu Ile Gln Lys

1 5 10 15

Leu Leu Asn Glu

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP4 BORIS

<400> 317

Ser Ala Val Phe His Glu Arg Tyr Ala Leu Ile Gln His Gln Lys Thr

1 5 10 15

His Lys Asn Glu

20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP5 MAGE-A11

<400> 18

Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Thr Ser His Ser Tyr Val Leu Val Thr

1 5 10 15

Ser Leu Asn Leu

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP6 NY-SAR-35

<400> 19

Glu Asn Ala His Gly Gln Ser Leu Glu Glu Asp Ser Ala Leu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Asn Phe

20

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP7 HOM-TES-85

<400> 20

Met Ala Ser Phe Arg Lys Leu Thr Leu Ser Glu Lys Val Pro Pro Asn

1 5 10 15

His Pro Ser Arg

20

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP8 NY-BR-1

<400> 21

Lys Arg Ala Ser Gln Tyr Ser Gly Gln Leu Lys Val Leu Ile Ala Glu

1 5 10 15

Asn Thr Met Leu

20

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP9 MAGE-A9

<400> 22

Val Asp Pro Ala Gln Leu Glu Phe Met Phe Gln Glu Ala Leu Lys Leu

1 5 10 15

Lys Val Ala Glu

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP10 SCP-1

<400> 23

Glu Tyr Glu Arg Glu Glu Thr Arg Gln Val Tyr Met Asp Leu Asn Asn

1 5 10 15

Asn Ile Glu Lys

20

<210> 24

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP11 MAGE-A1

<400> 24

Pro Glu Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly

1 5 10 15

Ile Asp Val Lys

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> PBRC01_cP12 MAGE-C2

<400> 25

Asp Ser Glu Ser Ser Phe Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Glu

1 5 10 15

Leu Val Glu Phe

20

<210> 26

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> crc_P3 肽 30aa

<400> 26

Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Asp

1 5 10 15

Glu Lys Val Ala Glu Leu Val Arg Phe Leu Leu Arg Lys Tyr

20 25 30