一种有助于延缓机体衰老的发酵茶及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种有助于延缓线虫衰老的发酵茶及其制备方法。本发明应用从普洱茶分离的安全性高的黑曲霉RAF106将0.5％～10％绿茶茶汤发酵2～8d，制备发酵茶。与未发酵茶相比，该方法制备的发酵茶能将线虫平均寿命延长17％以上，最大寿命延长2d；显著减少线虫体内脂肪积累，丙二醛(MDA)含量降低24.37％、最大谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化歧化酶(SOD)酶活分别增加104.13％、47.21％，说明该发酵茶能显著延缓线虫衰老。因此，可利用该方法制备延缓线虫衰老的功能性发酵茶，开发新型茶饮料或茶相关的食品配料，在茶加工及食品加工领域中具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及发酵功能食品技术领域，更具体地，涉及一种助于延缓衰老的发酵茶及其制备方法和应用。

背景技术

随着全球老龄化人口的的比例升高，老龄化带来的健康和社会问题以及随之而来的巨额费用已逐渐成为人们关注的热点。据统计，2019年，全球65岁及以上的人口数为7.03亿，其人口所占比例从199年的6％增加到9％，预计到2050年，老年人的数量将翻一番，达到15亿，老年人口所占比例将进一步上升到16％。在内外环境共同作用下，衰老会使人体内生物分子、细胞、组织及器官会发生有害的、不可修复的改变，同时可能引起多器官功能衰减，导致各种衰老相关代谢、神经系统、心血管疾病的发生和发展。由此可见，寻求可以安全有效延缓衰老过程，降低与年龄有关疾病发病率，延长寿命时间的食品或药物是当前老年医学研究的一大热点问题。

茶水中含有诸多对人体健康有益的生物活性成分，包括茶多酚、茶多糖、茶色素等，具有提神，利尿解毒，抗突变，抗肿瘤，降血脂以及抗过敏反应等生理功效。随着全球对功能型保健饮品的需求不断增长及消费者更倾向于相信传统上与健康有所联系的产品，市场上功能性或保健性茶饮料的需求日益增长，而其中一类就是益生菌茶饮料，如酵母、细菌共同发酵的康普查市场从2016年到2020年的年复合增长率高达25％、全球市场份额2025年有望增长至54.5亿美元。有研究表明，相比未发酵茶，经冠状散囊菌液态发酵后，茶水的纤维素酶、果胶酶、多酚氧化酶、淀粉酶和蛋白酶活性显著增强，且主要生化成分包括氨基酸、茶多酚等含量均提高(刘巧林.液态发酵茶工艺参数及相关酶活性的研究[D].四川农业大学,2007.)；乳酸菌发酵后的茶饮品对ABTS自由基的清除活性均提高(刘佳奇.乳酸菌发酵茶饮料的研制及功能性研究[D].南昌大学,2017.)；发酵茶-乌龙茶的总酚含量、DPPH清除率均高于未发酵茶-绿茶(马慧等.4种茶叶水提物及茶多酚的体外抗氧化性能研究[J].食品研究与开发,2019.)；除此之外，茶叶或茶水经微生物或其酶系发酵后活性成分如茶多酚的生物可利用度增加，抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等生理活性增强(杜敏如等.微生物介导的表没食子儿茶素没食子酸酯生物转化及其代谢物活性研究进展[J].食品科学,2020)。由此可见，茶叶或茶水经微生物发酵后健康功效更显著，更迎合当今消费者需求。经信息检索，发现目前关于发酵茶的专利主要集中于活性物质保留、品质稳定、提高抗氧化/抗病毒/降血糖/免疫力等功效的发酵茶产品开发及制备，而对于有助于延缓机体衰老的发酵茶制备工艺在于添加景天三七、黄秋葵枇杷叶等物质达到目的，还未见只通过微生物发酵绿茶茶水制备具有有助于延缓机体衰老的发酵茶的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种发酵绿茶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供所述制备方法制备得到的发酵绿茶。

本发明的再一目的在于提供所述发酵绿茶的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种发酵绿茶的制备方法，包括如下步骤：

S1.浸提：将含0.5～10wt％绿茶的茶水在80～85℃下浸泡10～14min，取滤液，再重复上述步骤，取茶水混合液作为发酵茶水原液；

S2.发酵：取步骤S1茶水原液，巴氏灭菌后，加入1％v/v黑曲霉RAF106菌悬液，28～32℃、180～220r/min培养2d～8d；所述黑曲霉RAF106菌悬液的浓度为1×10

黑曲霉RAF106是发明人实验前期自行分离的一种重要的发酵工业菌种。本发明通过应用从普洱茶分离的安全性高的黑曲霉RAF106将绿茶茶水进行发酵，制备发酵茶，结果表明制备得到的发酵茶能将线虫平均寿命延长17％以上，最大寿命延长2d；显著减少线虫体内脂肪积累，MDA含量降低24.37％、最大GSH含量及SOD酶活分别增加104.13％、47.21％，可显著延长线虫寿命，减少脂肪的积累，提高抗氧化酶活，减少氧化损伤，从而达到延缓机体衰老的效果。

优选地，步骤S2所述发酵时间为2～6d。

优选地，步骤S1所述绿茶的茶水中绿茶含量为0.5wt％，步骤S2培养时间为6d。此条件下制备的发酵绿茶，在25℃条件下饲喂线虫72h后，均显著延长线虫的寿命，平均寿命延长17.85％，最大寿命延长2d；线虫体内脂肪含量均减少；对线虫体内MDA含量分别显著降低了24.37％，SOD活性显著增加了47.21％，GSH含量显著增加了104.13％。

优选地，步骤S1所述绿茶的茶水中绿茶含量为1.0wt％，步骤S2培养时间为4d。此条件下制备的发酵绿茶，在25℃条件下饲喂线虫72h后，均显著延长线虫的寿命，平均寿命延长12.86％，最大寿命延长1d；线虫体内脂肪含量均减少；对线虫体内MDA含量显著降低14.55％，SOD活性分别显著增加了31.25％，GSH含量显著增加了42.20％。

优选地，步骤S1所述绿茶的茶水中绿茶含量为10wt％，步骤S2培养时间为2d，平均寿命分别延长11.55％，最大寿命延长1d；线虫体内脂肪含量均减少；对线虫体内MDA含量显著降低12.49％，SOD活性分别显著增加了28.66％，GSH含量显著增加了39.58％。

优选地，步骤S1所述浸泡为85℃浸泡12min。

优选地，步骤S2所述培养为在30℃、转速为200r/min的恒温摇床中培养。

本发明还请求保护上述任一所述方法制备得到的发酵绿茶。

本发明制备的发酵绿茶可显著延长线虫寿命，减少脂肪的积累，提高抗氧化酶活，减少氧化损伤，从而达到延缓机体衰老的效果；因此，本发明还提供所述发酵绿茶的下述用途：

所述发酵绿茶在制备抗氧化产品中的应用。

所述发酵绿茶在制备减少机体内脂肪积累的产品中的应用。

所述发酵绿茶在制备抗机体衰老产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种有助于延缓机体衰老的发酵茶，通过应用从普洱茶分离的安全性高的黑曲霉RAF106将绿茶茶汤发酵，制备发酵茶。与未发酵茶相比，该方法制备的发酵茶能将线虫平均寿命延长17％以上，最大寿命延长2d；显著减少线虫体内脂肪积累，丙二醛含量降低24.37％、最大谷胱甘肽含量及超氧化歧化酶酶活分别增加104.13％、47.21％，说明该发酵茶能显著延长线虫寿命，减少脂肪的积累，提高抗氧化酶活，减少氧化损伤，从而达到延缓机体衰老的效果。因此，可利用本发明方法制备延缓机体衰老的功能性发酵茶，开发新型茶饮料或茶相关的食品配料，在茶加工及食品加工领域中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为0.5％绿茶发酵不同时间后的茶水处理后线虫的存活率。

图2为1％绿茶发酵不同时间后的茶水处理后线虫的存活率。

图3为10％绿茶发酵不同时间后的茶水处理后线虫的存活率。

图4为对照组、0.5％绿茶发酵6d、1％绿茶发酵4d、10％绿茶发酵2d后的茶水处理线虫3d后的脂肪积累。

图5为对照组、0.5％绿茶、0.5％绿茶发酵6d、1％绿茶、1％绿茶发酵4d后的茶水处理线虫3d后的MDA含量。

图6为对照组、0.5％绿茶、0.5％绿茶发酵6d、1％绿茶、1％绿茶发酵4d后的茶水处理线虫3d后的SOD活性。

图7为对照组、0.5％绿茶、0.5％绿茶发酵6d、1％绿茶、1％绿茶发酵4d后的茶水处理线虫3d后的GSH含量。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

秀丽隐杆线虫为野生型N2。

秀丽隐杆线虫形体结构简单便于观察、寿命较短、试验周期适中、易于繁殖、传代量大，是研究衰老最经典的模型生物。其遗传背景清楚，线虫基因与人类基因存在很大的保守序列。同时线虫随着寿命的延长，出现行动迟缓、各种组织受损、氧化蛋白增加等与人类相似的衰老现象。因此，选择秀丽隐杆线虫作为下述实施例研究发酵茶抗衰老作用的动物模型。

黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

绿茶(毛尖)购自贵州湄潭兰馨茶业。

实施例1发酵茶对线虫寿命的影响

一、发酵茶的制备

分别准确称取5g毛尖，加入85℃饮用水500mL在85℃水浴条件下浸泡12min，每3min搅拌一次，然后用滤网过滤，将滤液回收至灭菌蓝口瓶中并立即拧紧盖子，在剩下的茶渣中再加入500mL 85℃饮用水，重复上述步骤，取两次滤液混匀，考虑到高温会破坏茶水多酚等结构，因此采用0.22μm滤头过膜除菌，得到浓度为0.5％的绿茶茶水，分装后-20℃保存备用。按照上述实验方法，再称取相同质量的茶叶分别获得浓度为1％和10％的绿茶茶水。

上述各浓度茶水分别取150mL于250mL锥形瓶中，将其置于60℃恒温水浴锅中巴氏灭菌30min，待茶水冷却后，在超净工作台中进行以下操作，150mL茶水中加入1.5mL黑曲霉RAF106菌悬液(1×10

二、寿命的测定

1、实验方法

将OD600值为0.5的E.coli OP50和不同浓度(0.5％、1％、10％)的发酵茶等量加在NGM琼脂平板上，NGM琼脂平板上涂E.coil OP50作为对照组。将同期化处理生长至L4时期的秀丽隐杆线虫挑选至以上处理的NGM固体培养皿上，每个培养皿分别有20～25条线虫，每个处理组有3板，在20℃恒温培养箱中培养。每天同一时间记录线虫死亡数目，统计存活率，前期线虫处于产卵量较多时，需要每天换板将其转移至新的加有相同样品的NGM平板中，此后每1～2d更换一次新板，直到线虫全部死亡，绘制寿命曲线。

2、实验结果

结果如图1～3所示：发酵时间太短或太长都不利于线虫寿命的延长，当0.5％绿茶茶水发酵6d、1％绿茶茶水发酵4d、10％绿茶茶水发酵2d均能显著延长线虫的寿命；与对照相比，平均寿命分别延长17.85％、12.86％、11.55％，最大寿命均延长2d；说明半发酵茶更利于延长线虫的寿命，其中茶水浓度为0.5～10％、发酵时间为2d～6d时对线虫寿命延长效果显著，平均寿命延长在11.55～17.85％之间。

实施例2发酵茶对线虫脂肪含量的影响

1、实验方法

将同期化生长至L4期的线虫，转移至含有同实施例1处理组的NGM培养基中，线虫在20℃条件下培养了3d后用M9缓冲液加0.01％Triton X-100溶液冲洗收集至离心管中，2000r/min离心1min，取上清，反复冲洗3遍后，加入1mL固定液固定30min，去上清，再将其转移至-80℃放置30min，取出后立即放入43℃水浴锅中溶解，此后再放入-80℃冰箱，重复以上操作，反复冻融，最后用M9缓冲液冲洗后，向每管加入500μL的尼罗红染料混合液，孵育2h，2000r/min离心1min后，去除上清液。取10μL线虫于载玻片上，并盖上盖玻片，在显微镜下进行观察并拍照。

2、实验结果

与未发酵茶相比较，0.5％发酵茶水6d、1％发酵茶水4d、10％发酵茶水2d三组线虫第3d的脂肪含量均减少，其中0.5％发酵茶水6d的脂肪含量最少，说明在茶水浓度范围为0.5％～10％、发酵时间范围为2d～6d时，对机体内的脂肪积累均有明显的减少作用，从而达到延缓机体衰老的效果。

实施例3发酵茶对线虫抗氧化能力的影响

1、实验方法

按照丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒、总谷胱甘肽试剂盒的说明书进行操作，测定发酵茶处理后的线虫抗氧化能力。

2、实验结果

MDA是脂质过氧化的中间产物，是细胞内氧化损伤的常用指标；SOD能将O