一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用。涉及鸡标记辅助选择技术领域。与MC1R基因编码区DNA序列相比，包括：SNP1～SNP5。本发明对不同类型黑羽和麻羽羽色性状进行选择，加快羽色选择育种进程和提高鸡群羽色一致性，当SNP1～SNP5为CTGAC时，提高F2代公鸡胸部黑色羽型、胸背部黑×黑麻羽色表型的比例；当SNP1～SNP5为CTGAG时，提高F2代母鸡胸部黄色羽型、胸背部黄×黄麻羽色表型的比例；当SNP1～SNP5为TCACC时，提高F2代母鸡胸部麻羽、胸背部麻×麻羽色表型，以及F2代公鸡胸部红色羽型、胸背部红×红麻羽色表型的比例。

说明书

技术领域

本发明涉及鸡标记辅助选择技术领域，更具体的说是涉及一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用。

背景技术

我国地方鸡品种资源丰富，地方鸡品种因其肉质鲜美深受消费者喜爱，作为育种素材具有很大的潜力，但因品种内羽色参差不齐，对羽色的遗传规律及机制研究不深入等因素将极大地影响优良品种的利用以及其商品的经济效益。

长期以来，鸟类羽毛颜色和哺乳动物的毛色、皮肤颜色都是色素研究的重点。羽毛颜色可以作为一种遗传标记，有助于根据其特征识别品种、种群和繁育群体。运用现代分子技术筛选家禽羽色候选基因分子标记可提高育种进程、羽色整齐度，有效节约育种时间，提高经济效益。鸡的羽毛颜色的色素主要由黑色素和类胡萝卜素共同形成的，其中类胡萝卜素需要从外界摄取，而黑色素可以自身合成。黑色素又分为真黑素和褐黑素，两者都是酪氨酸衍生物，真黑素使羽毛呈现黑色，褐黑素使羽毛呈现红棕色和黄色；一般来讲，鸡不同羽毛颜色的形成主要是由于真黑素和褐黑素在羽毛中的数量，比例和位置的不同造成的。

鸡羽毛颜色受众多的基因共同调控，一些基因引起颜色的原生效应，另一些基因扮演了修饰和调节的作用，包括影响色素的含量和比例以及在单个羽毛中的分布。其中被研究得最多的是编码黑色素皮质素受体MC1R的真黑素扩展基因座E(E×tension，E)，该基因座调控真黑素和褐黑素的相对比例与分布，MC1R是通过调控酪氨酸的活性进而影响真黑素和褐黑素的合成。

但目前从遗传的角度来说，还没有建立有关MC1R基因作为鸡羽色性状分子标记的检测方法，同时该基因作为鸡羽色性状分子标记辅助选择也未见应用。

因此，如何提供一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用。本发明为羽色性状在种质资源深度鉴评以及育种利用提供参考。该分子标记位于鸡MC1R基因的编码区上。具体来说，该分子标记为位于SEQ ID NO：1所示序列中的69位碱基处的C/T碱基突变，212位碱基处的T/C碱基突变，274位碱基处的G/A碱基突变，644位碱基处的A/C碱基突变和919位碱基处的C/G碱基突变共5个碱基突变所构成的单倍型。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记，与MC1R基因编码区DNA序列SEQ ID NO.1相比，包括：第69位的SNP1、第212位的SNP2、第274位的SNP3、第644位的SNP4和第919位的SNP5；

当SNP1为C、SNP2为T、SNP3为G、SNP4为A、SNP5为C时为单倍型H1，提高F2代公鸡胸部黑色羽型、胸背部黑×黑麻羽色表型的比例；

当SNP1为C、SNP2为T、SNP3为G、SNP4为A、SNP5为G时为单倍型H2，提高F2代母鸡胸部黄色羽型、胸背部黄×黄麻羽色表型的比例；

当SNP1为T、SNP2为C、SNP3为A、SNP4为C、SNP5为C时为单倍型H3，提高F2代母鸡胸部麻羽、胸背部麻×麻羽色表型，以及F2代公鸡胸部红色羽型、胸背部红×红麻羽色表型的比例。

优选的：扩增MC1R基因编码区DNA序列SEQ ID NO.1所用的引物：

正向引物MC1R-2F:5′-CTTCCCCATCCTTGTGCCTG-3′，如SEQ ID NO.2；

反向引物MC1R-2R:5′-CCTTTATTTGGGAGCGCGAG-3′，如SEQ ID NO.3；

本发明还提供了上述分子标记在制备检测鸡羽色性状试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述分子标记在鸡选育中的应用。

本发明还提供了一种检测鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)以鸡血液DNA为模板，进行PCR扩增；

(2)对扩增产物进行SNP筛选、构建单倍型。

优选的：步骤(1)PCR的扩增体系：总体积为25μL的PCR反应体系中加入鸡血液DNA模板1μL，2×PCR反应混合物12.5μL，10mM正反引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，双蒸水9.25μL。

优选的：步骤(1)PCR的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min20 s，共34个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用，取得的技术效果为可以对不同类型黑羽和麻羽羽色性状进行选择，加快羽色选择育种进程和提高鸡群羽色一致性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1中鸡MC1R基因编码区的DNA序列，用来寻找分子标记的片段的电泳图(琼脂糖胶浓度为1.5％)，其中，M：DS2000 DNA MAKER，泳道1～5：扩增产物。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用。

实施例1

鸡黑羽和麻羽羽色性状分子检测方法的建立

(一)引物：

以鸡MC1R基因的DNA序列(参考序列GeneBank登录号为：D78272.1)为模板，设计一对引物MC1R-2F/MC1R-2R得到如序列SEQ ID NO.1所示的DNA序列，该序列全长为1308bp(CTTCCCCATCCTTGTGCCTGGGGTGCAGAGGTGCCCACATCCCCTCTGCCTCGTGACCGCGTGCTGCGGGAGCACTGGTGGGGCTGGTTGGGCGCACGGGGGCTTTGTAGGTGCTGCAGTTGTGCCTCGGGGCCACGGCCTCCAGCCAGGGCGGTCCCTGGGGGCTGAGGCCGGGGCCATGTCGATGCTGGCCCCCCTGCGCCTCGTGCGCGAGCCCTGGAACGCCAGTGAGGGCAACCAGAGCAATGCCACGGCCGGGGCCGGAGGTGCCTGGTGCCAGGGGCTGGACATCCCCAATGAGCTCTTCCTGACGCTGGGGCTGGTGAGCCTGGTGGAGAACCTGCTGGTGGTGGCCGCCATCCTCAAGAACAGGAATCTGCACTCGCCCACGTACTACTTCATCTGCTGCCTGGCCGTCTCCGACATGCTGGTGAGCGTCAGCAACCTGGCCAAGACGCTCTTCATGCTGCTGATGGAGCACGGCGTGCTGGTGATCCGCGCCAGCATCGTCCGCCACATGGACAATGTCATCGACATGCTCATCTGCAGCTCCGTCGTGTCCTCCCTCTCCTTCCTGGGGGTCATCGCCGTGGACCGCTACATCACCATCTTCTATGCGCTGCGCTACCACAGCATCATGACGCTGCAGCGCGCCGTGGTCACCATGGCCAGCGTCTGGCTGGCCAGCACCGTCTCCAGCACCGTCTTAATCACCTACTACCGCAACAACGCCATCCTGCTCTGCCTCATTGGCTTCTTCCTCTTCATGCTGGTCCTCATGCTGGTGCTCTACATTCACATGTTCGCGCTGGCGTGCCACCACGTGCGCAGCATCTCCAGCCAGCAGAAGCAGCCCACCATCTACCGCACCAGCAGCCTGAAGGGAGCCGTCACGCTCACCATCCTGCTGGGAGTCTTCTTCATCTGCTGGGGGCCCTTCTTCTTCCACCTCATCCTCATCGTCACCTGCCCCACCAACCCCTTCTGCACCTGCTTCTTCAGCTATTTCAACCTCTTCCTCATCCTCATCATCTGCAATTCAGTGGTCGATCCCCTGATCTATGCCTTCCGGAGCCAGGAGCTCCGGCGGACGCTGCGGGAGGTGGTGCTGTGCTCCTGGTAGGAGGCGGCACAGACAGGAGGATGGATGGATGGATGGATGGACGGATGGACGGATGGATGGATGGACAAACAGATGGGTGGATGGACAGATGGGTGGATGGACAAACAGACGCACCGCGGGGTGTCCCCTGGGTGCCCCAGTGCAGCTGGGGTTGGGCTGCCTGGCCTCGCGCTCCCAAATAAAGG)。所用到的引物序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，具体如下：

正向引物MC1R-2F:5′-CTTCCCCATCCTTGTGCCTG-3′，如SEQ ID NO.2；

反向引物MC1R-2R:5′-CCTTTATTTGGGAGCGCGAG-3′，如SEQ ID NO.3。

(二)PCR扩增条件：

总体积为25μL的PCR反应体系中加入DNA模板1μL，2×PCR反应混合物12.5μL，10mM正反引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，双蒸水9.25μL，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min20 s，共34个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

(三)寻找分子标记：

PCR扩增产物直接测序，运用DNAMAN软件分析序列寻找到第69，212，274，644和919位碱基突变，使用phase2.1软件对这5个SNP构建单倍型，利用R语言环境中的Haplo Stats软件包对单倍型和羽色性状进行关联分析。

(四)实验材料：

利用羽色为黑胸红背的专门化品系R作父本，棕色羽性状的专门化品系S为母本，进行杂交产生F1代，F1代母本再与R公鸡回交产生羽色分离回交F2群体。随机选取F2代成年公鸡118个个体和成年母鸡123个个体，根据性别、胸部和背部羽毛颜色性状进行归类，详细记录每只鸡的胸部和背部羽色。利用EDTA抗凝真空采血管通过翅下静脉采集全血2ml，置于-20℃冰箱保存。实验材料如表1所示。

表1.实验材料信息表

(五)实验步骤与结果：

选取表1所示实验群体血液DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。图1为部分鸡MC1R基因编码区序列如SEQ ID NO：1所示的DNA序列的电泳结果图(M为DS2000Maker，1-5为部分样本目的序列条带1308bp)。将PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司正、反向测序后拼接测序结果。

利用DNAMAN软件对测序所获得序列进行SNP筛选，通过与鸡MC1R基因编码区序列(参考序列GeneBank登录号为：D78272.1)比对，共发现5个SNP分别为SEQ ID NO：1所示序列中的69位碱基处的C/T碱基突变(C69T)，212位碱基处的T/C碱基突变(T212C)，274位碱基处的G/A碱基突变(G274A)，644位碱基处的A/C碱基突变(A644C)和919位碱基处的C/G碱基突变(C919G)。

使用phase2.1软件对这5个SNP构建单倍型，结果见表2，对4个不同群体进行了单倍型频率分析，结果见表3。利用R语言环境中的Haplo Stats软件包对phase2.1软件分析得到的3种单倍型与不同羽毛颜色性状进行关联分析。该软件利用广义线性模型检测单倍型与性状的关联性，返回的P值表示性状与单倍型的关联的显著性，单倍型效应评分的大小、正负表示单倍型效应的大小、正反，评分为正数，且值越大，表示对羽色性状得分排序的正序性状效应大(即与羽色性状排序得分最高分所对应的性状关联性越高)，评分为负数，且绝对值越大，表示对羽色性状得分排序的倒序性状效应大(即与羽色性状排序得分最低分所对应的性状关联性越高)；P值≦0.05为显著，P值≦0.01为极显著。

在本次试验中，根据胸部、背部和胸背部结合表型的羽毛颜色由深到浅分别对F2代公鸡、母鸡的羽色性状进行排序，再与单倍型进行关联分析。不同部位羽色表型的排序结果如表4所示，不同部位羽色表型与单倍型关联分析结果见表5。

表2.MC1R基因上5个SNPs构建单倍型结果

表3.MC1R基因单倍型在不同品系中的分布

表4.不同部位羽色表型由深至浅排序结果

表5.不同羽色表型与单倍型关联分析结果

注：商品代公鸡背部因只有两种表型不能用此方法分析，“—”代表没有分析数据。

分子标记的辅助选择与应用：

如表5可知，选择H1单倍型可以提高F2代公鸡胸部黑色羽型、胸背部黑×黑麻羽色表型的比例；选择H3单倍型可以提高F2代母鸡胸部麻羽、胸背部麻×麻羽色表型，以及F2代公鸡胸部红色羽型、胸背部红×红麻羽色表型的比例；选择H2单倍型可以提高F2代母鸡胸部黄色羽型、胸背部黄×黄麻羽色表型的比例。

检测MC1R基因单倍型能有效提高鸡群的羽色一致性。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物科学研究所

广东智威农业科技股份有限公司

<120> 一种鸡羽色性状相关基因MC1R分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttccccatc cttgtgcctg gggtgcagag gtgcccacat cccctctgcc tcgtgaccgc 60

gtgctgcggg agcactggtg gggctggttg ggcgcacggg ggctttgtag gtgctgcagt 120

tgtgcctcgg ggccacggcc tccagccagg gcggtccctg ggggctgagg ccggggccat 180

gtcgatgctg gcccccctgc gcctcgtgcg cgagccctgg aacgccagtg agggcaacca 240

gagcaatgcc acggccgggg ccggaggtgc ctggtgccag gggctggaca tccccaatga 300

gctcttcctg acgctggggc tggtgagcct ggtggagaac ctgctggtgg tggccgccat 360

cctcaagaac aggaatctgc actcgcccac gtactacttc atctgctgcc tggccgtctc 420

cgacatgctg gtgagcgtca gcaacctggc caagacgctc ttcatgctgc tgatggagca 480

cggcgtgctg gtgatccgcg ccagcatcgt ccgccacatg gacaatgtca tcgacatgct 540

catctgcagc tccgtcgtgt cctccctctc cttcctgggg gtcatcgccg tggaccgcta 600

catcaccatc ttctatgcgc tgcgctacca cagcatcatg acgctgcagc gcgccgtggt 660

caccatggcc agcgtctggc tggccagcac cgtctccagc accgtcttaa tcacctacta 720

ccgcaacaac gccatcctgc tctgcctcat tggcttcttc ctcttcatgc tggtcctcat 780

gctggtgctc tacattcaca tgttcgcgct ggcgtgccac cacgtgcgca gcatctccag 840

ccagcagaag cagcccacca tctaccgcac cagcagcctg aagggagccg tcacgctcac 900

catcctgctg ggagtcttct tcatctgctg ggggcccttc ttcttccacc tcatcctcat 960

cgtcacctgc cccaccaacc ccttctgcac ctgcttcttc agctatttca acctcttcct 1020

catcctcatc atctgcaatt cagtggtcga tcccctgatc tatgccttcc ggagccagga 1080

gctccggcgg acgctgcggg aggtggtgct gtgctcctgg taggaggcgg cacagacagg 1140

aggatggatg gatggatgga tggacggatg gacggatgga tggatggaca aacagatggg 1200

tggatggaca gatgggtgga tggacaaaca gacgcaccgc ggggtgtccc ctgggtgccc 1260

cagtgcagct ggggttgggc tgcctggcct cgcgctccca aataaagg 1308

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttccccatc cttgtgcctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctttatttg ggagcgcgag 20