双壳贝类感染疱疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等温扩增引物、试剂盒及其应用

摘要

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种双壳贝类感染疱疹病毒OsHV‑1的通用型RPA核酸等温扩增引物、试剂盒及其应用。所述引物为成套扩增引物，由上下游引物和探针引物组成；上游引物如SEQ ID NO.1所示；下游引物如SEQ ID NO.2所示；探针引物如SEQ ID NO.3所示。本发明针对目前已知四种双壳贝类宿主中7种OsHV‑1变异株，设计了通用的RPA扩增检测引物，建立了OsHV‑1的试纸条RPA检测体系和方法，该技术对OsHV‑1的现场快速筛查和检测，具有重要价值，具有广阔的市场应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种双壳贝类感染疱疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等温扩增引物、试剂盒及其应用。

背景技术

双壳贝类中感染流行的疱疹病毒Ostreid Herpesvirus 1, OsHV-1， 隶属疱疹病毒目（Herpesvirales），软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae），OsHV-1广泛流行于全球沿海贝类养殖或捕捞产区。目前已知可感染OsHV-1的双壳贝类宿主主要包括牡蛎、扇贝及蚶科贝类等，近些年在我国受此类病毒感染较为严重的是蚶科养殖贝类，此类病毒感染频繁导致了我国沿海地区泥蚶、毛蚶及魁蚶群体大规模死亡。不同物种中感染OsHV-1存在一定程度变异，基因组间相似度在90%左右，形成了多个OsHV-1变异株。建立针对OsHV-1通用型现场检测方法可有效监控此类病毒的流行情况，避免因此类病毒感染造成养殖双壳贝类大规模死亡。

目前检测OsHV-1的方法主要有电子显微镜法、常规或荧光定量PCR等。电子显微镜需要昂贵的仪器；聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术以其能够检测痕量的病原DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但常规PCR需要特殊的热循环设备、其产物仍需电泳检测，荧光定量PCR具有较高的灵敏性，但反应过程时间长、需要具备荧光探测和分析的仪器。现有的OsHV-1检测方法由于上述缺陷无法满足疫病现场诊断的需求。研发适合用于OsHV-1现场诊断的技术对于有效控制OsHV-1流行具有重要意义。

基于重组酶-聚合酶的核酸扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是由英国公司TwistDx Inc开发，该技术依赖重组酶介导引物与目标片段序列结合，使核酸扩增反应脱离了传统PCR反应必须经历的变性、退火和延伸的热循环步骤，进一步触发聚合酶对目标片段进行指数扩增。最佳反应温度在37℃-42℃，反应速度快，10~20分钟即可获得可检出水平的扩增产物。针对RPA扩增产物的检测，实时荧光RPA可对扩增反应进程实时监控，但需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如可控温酶标仪或荧光PCR仪；相比而言，试纸条RPA对硬件条件要求更低，只需完成控温扩增反应，随后通过侧向流层析试纸条读取试验结果。因此，试纸条RPA更适合于现场检测的应用。目前，双壳贝类感染疱疹病毒OsHV-1检测过程对仪器设备具有依赖性，且无法做到现场快速检测。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种能够实现现场快速检测的双壳贝类感染OsHV-1的通用RPA恒温扩增引物。

本发明还提供了含有上述通用RPA恒温扩增引物的试剂盒。

本发明还提供了上述通用RPA恒温扩增引物及试剂盒的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明提供了一种双壳贝类感染疱疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等温扩增引物，所述引物为成套扩增引物，由上下游引物和探针引物组成；

上游引物如SEQ ID NO .1所示：

5’- ATTACCGACATGCCTGACAGATTAAAGGTAGATCA -3’；

下游引物如SEQ ID NO .2所示：

5’-biotin- CTCTTTGCAATTCCTCTTCGTCGGCCATGAGCTCT -3’；

探针引物如SEQ ID NO .3所示：

5’-FAM-GCCATTACCAAAGAGCGAGATTCCGATTTTGT-THF-AAAAGAGTTGTTTCATC-SpC3-3’；

其中，biotin表示生物素标记，FAM表示羧基荧光素标记，THF表示四氢呋喃连接子形成缺刻，SpC3表示Spacer C3修饰。

本发明还提供了一种含有上述通用型RPA核酸等温扩增引物的试剂盒。

本发明还提供了一种上述双壳贝类感染疱疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等温扩增引物在快速检测感染疱疹病毒OsHV-1的双壳贝类中的应用。

进一步的，包括以下步骤：

（1）采用RPA试剂进行核酸恒温扩增反应；

（2）利用胶体金侧向流免疫层析试纸条分析RPA扩增产物，读取试纸条结果。

上述核酸恒温扩增反应以50 μL计，具体为：水化缓冲液29.5 μL，280 mM醋酸镁2.5 μL，10 μM上游引物和下游引物各2.1 μL，探针引物0.6 μL，模板DNA 5 μL，无核酸酶纯水8.2 μL，37℃恒温孵育20分钟。

进一步的，所述步骤（2）具体过程为：将5 μLRPA扩增物加入95 μL 稀释液进行稀释，然后将稀释后RPA扩增产物滴加至胶体金侧向流免疫层析试纸条加样端，读取试纸条结果。

进一步的，所述稀释液为25 mM Tris、150 mM NaCl和0 .05％ Tween-20。

本发明发明人针对不同物种中不同OsHV-1变异株设计了成套恒温扩增检测引物。通过对于来自GenBank中OsHV-1变异株KP412538.1、GQ153938.1、NC_005881.2、MG561751.2、KY242785.1、KY271630.1和MF509813.1的基因组序列进行比对分析，确定了不同OsHV-1变异株间保守区域，针对零突变保守区域设计成套引物，以期能够检测到不同变异株的OsHV-1。本发明设计的RPA成套恒温扩增引物组，能够减少检测过程对仪器设备的依赖性，更好的应用于现场快速检测。

对本发明的试纸条RPA检测方法灵敏度及特异性进行了实验，灵敏度试验结果表明使用该发明试纸条RPA检测OsHV-1的敏感性为10个拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在10

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1、本发明设计的RPA成套恒温扩增引物特异性强，灵敏度高，检测结果准确。

2、本发明针对不同双壳贝类中7种OsHV-1变异株，设计了通用的引物，检测靶位点保守性高、不存在突变碱基。

3、本发明的检测方法将RPA恒温扩增技术与胶体金免疫层析试纸条联用，能够实现OsHV-1的快速检测，最低能检测指示10个拷贝左右的OsHV-1阳性样品。本发明的检测方法特异性试验结果良好，重复性试验具有很好的稳定性，为有效检测OsHV-1提供了一种成本低且不需要特殊设备的现场检测新方法。

4、本发明可以作为规模化双壳贝类生产过程中OsHV-1的快速现场筛查检测方法，也可应用于OsHV-1感染的流行病学调查研究，具有重要价值和市场应用前景。

附图说明

图1试纸条RPA灵敏度检测结果；

其中，A为Suite5引物组合灵敏度检测结果，B为Suite3引物组合灵敏度检测结果。

图2.试纸条RPA检测特异性和通用性结果；

其中，A为OsHV-1阳性样品，B为OsHV-1阴性样品。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

实施例1：现场快速检测OsHV-1的试纸条RPA 检测方法的建立

1、 RPA上下游引物及探针引物的设计

从NCBI的GenBank中下载OsHV-1变异株KP412538.1、GQ153938.1、NC_005881.2、MG561751.2、KY242785.1、KY271630.1和MF509813.1的基因组序列并进行比对分析，确定了不同OsHV-1变异株间保守区域，针对零突变保守区域设计成套引物，以期能够检测到不同变异株的OsHV-1。本发明分别设计合成了六套引物，如下表1所示。

表1

2、临床样品DNA提取

本发明中所使用的所有临床OsHV-1阳性样品由本实验室收集保藏。使用TIANGEN公司的TIANamp Marine Animals DNA Kit按照说明书来提双壳贝类外套膜总DNA，并最终用100 μl的无核酸酶超纯水洗脱。提取的DNA存放到-20℃冰箱中以待随后的使用。

3、试纸条RPA试验扩增条件优化

以提取纯化的组织总DNA样品为模板进行扩增，实验体系如下：

29.5 μL水解缓冲液 (rehydration buffer ,TwistDx nfo Kit ,Cambridge ,United Kingdom)，2.1 μL上游引物(10 μM)，2.1 μL下游引物(10 μM)，0 .6 μL的探针引物(10 μM)，5 μL的DNA模板，8.2 μL的ddH

反应条件为 37℃ ，反应时间 20 min。结束后使用侧流层析试纸条(TS101，GenDx)对结果进行检测。本发明分别用该体系对合成的六套引物组合进行评价，评价结果表明其中一套引物(Suite5)的组合能够产生最强的扩增信号，因此，该套引物组合应用到本发明中。

试纸条RPA试验检测结果判定：一个样品在特定的条件下(37℃，20min)试纸条上控制线为阳性，并且检测线为阳性的样品为阳性样品；试纸条上控制线为阳性，而检测线为阴性的样品为阴性样品。

4、灵敏度检测

参照OIE（Office International Des Epizooties）手册中OsHV-1 taqman qPCR定量方法，首先对阳性样品中病毒拷贝数进行定量分析。对定量后OsHV-1 DNA样品分别进行10倍梯度稀释 (10

5、特异性和通用性检测

将经OIE手册及行业标准牡蛎疱疹病毒I（OsHV-1）型感染诊断规程（SC/T 7240-2020）确认的OsHV-1阳性牡蛎、扇贝、毛蚶及魁蚶样品核酸作为阳性样品扩增模板，将健康的四种双壳贝类样品核酸作为OsHV-1阴性样品扩增模板，利用Suite5引物组合进行试纸条RPA扩增，反应体系和条件如上述3中所述。

结果如图2所示，Suite5引物组合可特异性检出四种双壳贝类OsHV-1阳性样品，OsHV-1阴性样品检测线处无扩增条带。

序列表

<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 双壳贝类感染疱疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等温扩增引物、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attaccgaca tgcctgacag attaaaggta gatca 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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