一种综合评价灵芝菌丝体抗氧化活性的方法

摘要

本发明涉及一种综合评价灵芝菌丝体抗氧化活性的方法，包括以下步骤：(1)用灵芝菌丝体制备水提液；(2)分别测定所述水提液的各种抗氧化评价指标值；(3)以熵权法给步骤(2)中所述抗氧化评价指标值赋予权重；(4)依据步骤(2)的所述抗氧化评价指标值和步骤(3)得到的所述权重，计算获得所述灵芝菌丝体的综合抗氧化活性Z值。本发明通过建立灵芝菌丝体抗氧化活性的综合评价方法，能够客观、全面地评价不同灵芝菌丝体提取物的体外抗氧化活性差异与变化情况，并且将多个指标进行关联、赋权的方法，能够客观、真实地反映各评价指标下灵芝菌丝体的抗氧化能力，可在天然产物抗氧化活性评价中得以广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及天然产物抗氧化活性的综合评价方法，特别地，涉及综合评价灵芝菌丝体水提物的体外抗氧化活性的方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)是分布于中国黄河及长江流域、日本、欧洲和北美部分地区的名贵药用真菌，资源种类丰富。现代研究表明，灵芝具有诱导癌细胞凋亡、抑制炎症反应、抗氧化、调节机体免疫、预防脂质代谢障碍和神经保护等多种药理活性。

灵芝的药用价值使其具有极大的市场需求，传统意义上的灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的子实体，其受地域、季节、原料等因素的影响，品控较差、生长周期长且成本较高，使灵芝的商业化应用受限。灵芝菌丝体为灵芝营养体的基本结构，可通过液态发酵技术快速获得，且可以通过对培养条件的调整，得到含有更多目标成分(如三萜、多糖、蛋白质、氨基酸、生物碱等)的菌丝体，有利于灵芝有效成分工业化生产的规模化与标准化。

医学研究表明，人类许多重大疾病如动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、癌症以及衰老过程均与自由基造成的氧化损伤有关，因此，抗氧化活性物质的研究与开发成为国内外学者研究的热点。化学合成抗氧化剂，如：二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等曾一度受到青睐，但动物实验发现其有一定的毒性和致畸作用。天然抗氧化剂安全、无毒，符合人们对健康、安全的新需求。

有关天然产物的体外抗氧化研究有很多，目前尚无标准化的评价方法，且由于抗氧化机理较为复杂，通常选取多种方法分别进行评价，因此需要利用多指标分析方法将不同方法得到的结果进行整合。按权重计算方法可将多指标综合分析方法分为主观法和客观法两类。熵权法是根据不同评价指标各自区分度的大小进行加权的一种客观方法，通过该法确定指标权重的评价结果具有很强的数学理论依据，避免了主观判断存在的不合理性，真正做到了符合客观实际的权重计算，且计算方式简单、可操作性强，有利于对多种方法得到的结果进行综合评价。

目前，对于利用熵权法综合评价食用菌提取物的体外抗氧化活性，国内外尚未见研究。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种计算方式简单、操作性强、有利于对灵芝菌丝体抗氧化活性进行综合评价的新方法。

本发明方法又一目的在于，克服现有技术中只能针对灵芝中某具体成分进行抗氧化活性评价，以及现有技术中只能针对同一种评价方法对灵芝成分进行抗氧化对比分析的局限性，以灵芝水溶性抗氧化成分为评价对象，综合抗氧化活性为评价指标，其中综合抗氧化活性的计算是通过熵权法，得到简单而直观的评价方法，从而全面、客观地评价灵芝的抗氧化活性。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：

一种综合评价灵芝菌丝体抗氧化活性的方法，包括如下步骤：

(1)用灵芝菌丝体制备水提液；

(2)分别测定所述水提液的各项抗氧化评价指标值；

(3)以熵权法给步骤(2)中所述抗氧化评价指标值赋予权重；

(4)依据步骤(2)的所述抗氧化评价指标值和步骤(3)得到的所述权重，计算获得所述灵芝菌丝体的综合抗氧化活性Z值。

步骤(2)中，所述抗氧化评价指标值为DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和/或ABTS自由基清除率。

步骤(1)中，所述水提液的制备条件为：精密称取灵芝菌丝体固体0.05～2g，在液固比20～70mL/g、超声温度30～60℃、超声时间15～75min、超声功率72～180W的条件下进行超声水提，提取后将溶液离心，取适量上清液配制成1～2mg/mL(mg/mL为提取前灵芝菌丝体粉末质量/溶液配制后溶剂的质量)的灵芝菌丝体提取液。

步骤(2)中，所述DPPH自由基清除率的测定方法为：取所述水提液2mL置于棕色容量瓶，加入2mL吸光度为0.7±0.01的DPPH自由基工作溶液，避光反应30min后测定517nm处的吸光度，用95％乙醇调零；

然后，按式(1)计算DPPH自由基清除率S

其中，A

步骤(2)中，所述水提液的羟自由基清除率的测定方法为：取所述水提液1mL置于具塞试管中，依次加入1mL 9mmol/L FeSO

然后，按式(2)计算羟自由基清除率S

其中，A

所述水杨酸反应体系是指，所述H

步骤(2)中，所述水提液的ABTS自由基清除率测定方法为：取所述水提液1mL于棕色容量瓶，加入4mL吸光度为0.7附近的ABTS自由基工作溶液后摇匀，避光反应6min后测定溶液在734nm处的吸光度；

然后，按式(3)计算ABTS自由基清除率S

其中，A

其中，ABTS自由基工作溶液的配制方法为：移取5mL 7mmol/L ABTS溶液和100μL140mmol/L过硫酸钾溶液于10mL棕色容量瓶，摇匀后避光反应12-16h，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液稀释90倍左右，使其吸光度为0.7附近，即得到ABTS自由基工作溶液。

步骤(3)中，所述权重的赋予方法为：

首先，按式(4)对所述水提液的抗氧化能力s

其中，s

然后，按式(5)计算信息熵E

最后，按式(6)计算权重w

其中，

步骤(4)中，所述综合抗氧化活性Z值的计算方法为：Z＝S

所述离心条件为在6000-12000rpm条件下离心3-15min。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种客观、全面的多指标抗氧化活性综合评价方法，即利用熵权法求解不同指标的信息熵，进而进行权重计算，克服了现有技术中只能对单一抗氧化指标进行评价以及多指标主观赋权的局限性，能够有效、真实、客观、全面地对灵芝抗氧化活性进行对比分析，进而可推广至食用菌的抗氧化活性筛选及多指标工艺优化。

具体实施方式

下面，对本发明的实施例进行详细说明，但所述内容不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本发明的保护涵盖范围之内。另外，需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

一种综合评价灵芝菌丝体抗氧化活性的方法，包括以下操作：

取如下表1中所述灵芝菌丝体各0.05g，分别加入2mL去离子水，摇匀后在40℃水浴条件下超声50min后，将得到的水提液在11000r/min条件下离心12min，取1mL上清液于25mL容量瓶中，用去离子水补足体积至刻度，即得到各灵芝菌丝体样品溶液，共74份。

表1

对各灵芝菌丝体样品溶液的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS自由基清除率进行检测，分别得到S

熵权法计算权重过程如下：

首先，按式(1)对所述水提液的抗氧化能力s

其中，s

然后，按式(2)计算信息熵E

其中，

最后，按式(3)计算权重w

κ为所述抗氧化评价指标值(在本例中，κ＝3)；E

通过式(3)计算可得：w

综上，本例中综合抗氧化活性Z值的计算方法为：Z＝S

表2

分析表2中的数据可知，羟自由基清除率最高的G0119，其DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率均较弱；ABTS自由基清除率最高的G0149，虽然其DPPH自由基清除率也较高，但其羟自由基清除效果较差；DPPH自由基清除率最高的G0019，其ABTS自由基清除活性较高，羟自由基清除活性较差。因此根据不同评价方法得到的最优菌株结果不同。

根据权重计算可知，三种自由基清除效果的权重从大到小依次为DPPH自由基清除法＞ABTS自由基清除法＞羟自由基清除法，羟自由基清除法所占权重最小，从而根据综合抗氧化活性Z的比较可得出G0149为具有最佳抗氧化活性的灵芝菌丝体。该实验结果更为全面、客观。

实施例2

一种灵芝菌丝体抗氧化活性物质的提取工艺优化的多指标分析方法，包括以下操作：

在单因素试验的基础上设计四因素五水平的星点设计-效应面因素水平表如表3所示：

表3

根据如下表4列出的条件制备灵芝菌丝体水提液，测定各提取液的抗氧化活性，每份溶液测定三次取平均值，分别得到S

由于星点设计-效应面实验只能针对单一指标进行拟合，因此采用熵权法对各实验条件下不同评价方法的实验结果进行权重计算，依次为：0.3054(DPPH法)、0.4030(羟自由基)、0.2916(ABTS法)。

熵权法计算权重过程如下：

首先，按式(1)对所述水提液的抗氧化能力s

其中，s

然后，按式(2)计算信息熵E

其中，

最后，按式(3)计算权重w

κ为所述抗氧化评价指标值(在本例中，κ＝3)；E

通过式(3)计算可得：w

综上，本例中综合抗氧化活性Z值的计算方法为：Z＝S

综合抗氧化活性Z一并在表4中列出。

表4

以Z为效应值，利用Design-Expert对灵芝菌丝体水溶性抗氧化成分的提取工艺进行优化，优化后的工艺为：液固比50mL/g、超声时间60min、超声温度50℃、超声功率156W，该工艺条件下综合抗氧化活性Z的预测值为52.64％，验证实验得到的实验值为52.55％，二者相近(RSD＜3％)。对应的自由基清除率依次为：38.68％(DPPH自由基清除率)、53.79％(羟自由基清除率)和65.37％(ABTS自由基清除率)。

以综合抗氧化活性Z为效应值得到优化后的提取条件下水提液的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS自由基清除率均较高。