ATG4D作为靶标在诊断和治疗非梗阻性无精子症中的应用

摘要

本发明公开了ATG4D作为靶标在诊断和治疗非梗阻性无精子症中的应用，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。本发明中，ATG4D在精子发生、自噬和细胞凋亡中具有重要作用作用，ATG4D的致病变异影响ATG4D的稳定性和三维结构，导致蛋白表达和活性的降低，最终影响自噬的水平，并导致患者睾丸中的生殖细胞的凋亡，进而导致NOA的形成。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ATG4D作为靶标在诊断和治疗非梗阻性无精子症中的应用。

背景技术

临床上的无精子症(azoospermia)是指射出的精液连续3次经离心镜检(离心力3000g，离心时间15分钟)未检测到精子。根据输精管道梗阻与否，无精子症分为梗阻性无精子症(obstructiveazoospermia，OA)和非梗阻性无精子症(nonobstructiveazoospermia，NOA)。在普通男性人群中，无精子症的发病率约为1％，即100名男性中就有1人；在男性因素不育患者中，无精子症病例占10％-20％，其中约30-40％为OA，60-70％为NOA。OA可以通过外科手术治愈，而NOA的治疗仍然缺乏有效的手段。NOA主要由遗传因素造成，例如染色体畸变、Y染色体微缺失和单基因变异。由于研究对象和手段的有限，对由遗传因素导致的NOA发病机理的理解缺失给临床诊断和治疗带来了巨大的挑战。

随着二代测序(NGS)的发展，研究人员已经找到一系列导致NOA的突变基因。不同的课题组在NOA患者的睾丸表达的基因中找到了一些突变体，例如TEX11、TEX14和TEX15。Gershoni M等发现MEIOB和DNAH6是人类无精子症的潜在病原基因。Fakhro KA等通过基因组测序鉴定了特发性男性不育患者中的SPO11、WNK3、NANOS2和CCDC155的变异。Ayhan O等发现TAF4B和ZMYND15的截断变体会导致无精子症。SYCP3、NR5A1，SYCE1、SOHLH1、MCM8、STAG3、NPAS2、TDRD7、TDRD9、MAGEB4、MEI1、GTF2H3、FANCM、ADGRG2、XRCC2和DMC1的变异已经被鉴定为导致NOA的原因。确定导致NOA的遗传因素能够为临床诊断提供有价值的视角，并能够有助于NOA的精准治疗。尽管如此，大部分现存患者中的导致NOA的遗传基础仍然不甚明了。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供ATG4D作为靶标在诊断和治疗非梗阻性无精子症中的应用。

本发明的技术方案如下：

ATG4D作为检测靶标在制备诊断非梗阻性无精子症的试剂盒中的应用，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。

ATG4D作为治疗靶标在制备治疗非梗阻性无精子症的试剂盒中的应用，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。

ATG4D突变的拮抗物质在制备防治非梗阻性无精子症的药物中的应用，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。

一种诊断非梗阻性无精子症的试剂盒，包括能够检测ATG4D是否基因突变的试剂，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。

在本发明的一个优选实施方案中，所述能够检测ATG4D是否基因突变的试剂包括PCR检测ATG4D是否基因突变的试剂。

一种治疗非梗阻性无精子症的试剂盒，包括能够治疗ATG4D的基因突变的试剂，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。

在本发明的一个优选实施方案中，所述能够治疗ATG4D的基因突变的试剂包括ATG4D的基因突变的拮抗物质。

一种防治非梗阻性无精子症的药物，其有效成分包括ATG4D的基因突变的拮抗物质，所述ATG4D的基因突变为c.9_23del、c.374G＞T、c.817G＞A、c.884C＞A和c.1183G＞A。

在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为ATG4D的基因突变的拮抗物质。

进一步优选的，还包括药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果是：

1、本发明中，ATG4D在精子发生、自噬和细胞凋亡中具有重要作用作用，ATG4D的致病变异影响ATG4D的稳定性和三维结构，导致蛋白表达和活性的降低，最终影响自噬的水平，并导致患者睾丸中的生殖细胞的凋亡。

2、本发明的ATG4D是NOA的分子诊断的有效基因，扩展了研究人员对精子发生中的自噬的了解，将直接有益于临床医生的精确诊断和具有受影响的个体的家庭

附图说明

图1为本发明实施例1中来自三个家庭的NOA患者的ATG4D的五个突变的鉴定图，其中，A：具有ATG4D的致病变异的患者的家系图，黑色方块表明NOA不育患者，半黑方块和圆圈表明杂合变异携带者；B：来自三个家庭的家庭成员的Sanger测序图谱，箭头显示变异位点；C：ATG4D基因组上的突变位点的位置；D：ATG4D结构域地图上的被致病变异影响的氨基酸的位置，其中。

图2为本发明实施例1中纯和致病变异的影响图，其中，A：ATG4D的结构模型，箭头指示第125位氨基酸残基Arg；B：突变的ATG4D的结构模型，箭头指示由于p.Arg125Leu替换而形成的第125位氨基酸残基Leu；C-E：来自于对照组(C)、来自家庭154的IV：1(D)和IV：3(E)的睾丸组织切片的HE染色，对照样本来自于具有正常精子发生的梗阻性无精子症患者，比例尺＝20μm。

图3为本发明实施例1中来自于具有纯和致病变异的患者的组织切片的免疫荧光染色分析图，其中，A：来自于对照组和患者的睾丸组织切片中的ATG4D的免疫荧光染色照片；B：睾丸组织切片中的LC3B的免疫荧光染色照片；C：来自于对照组和患者的睾丸组织切片的TUNEL分析照片，对照样本来自于具有正常精子发生的梗阻性无精子症患者，比例尺＝50μm。

图4为本发明实施例1中GC-2spd细胞中的Atg4d

图5为本发明实施例1中被ATG4D致病变异影响的患者的G带核型分析图，其中，A：来自于家庭154的IV：1；B：来自于家庭154的IV：3；C：来自于家庭208的II：1；D：来自于家庭230的II：1。

图6为本发明实施例1中被ATG4D致病变异影响的氨基酸的共识分析结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

1材料与方法

1.1研究对象

本实施例的研究队列涉及NOA患者236人。对这些患者均进行了生殖系统解剖完整性的临床检查，并通过临床发现进行了诊断。由于处方药使用、儿童时期疾病以及环境或辐射暴露导致的不育，以及具有如精索静脉曲张或隐睾症等的其他病理原因的患者均被排除在这236人外。在本实施例的NOA患者中均未检出体细胞核型的异常和Y染色体的无精子因子微缺失。这些患者的配偶在一系列生育能力的常规检查中均表现出正常的生育能力。尽管经历无防护的伴随射精的性交，这些患者的配偶在超过一年的婚姻生活后均无法怀孕。

1.2全外显子测序以及Sanger测序验证

基因组DNA提取和其后续的全外显子测序(WES)及数据分析由AnnoroadCo.，Ltd进行。为了鉴定最可能的候选变异，将发生频率大于1％的候选变异排除。纯合变体、复合杂合变体或X连锁基因变体中的变体则被保留。已经报道的与NOA表型相关的功能基因、预测是有害的功能基因、和/或不同患者共同拥有的功能基因被优先处理。用Sanger测序对候选基因中的变体进行验证。

1.3计算机分析

对基因变异所影响的氨基酸位点进行了进化保守性分析。用于比对的蛋白质序列来自Entrez蛋白质数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)，用多序列比对工具COBALT(

1.4载体构建、细胞培养和转染

Atg4d的全序列小鼠cDNA克隆购自Mailgene biotechnology Co.，Ltd.。Flag-Atg4d或flag-Atg4d

1.5免疫荧光染色和TUNEL分析

免疫荧光染色的一抗为：primary rabbit anti-ATG4D antibody(DF3977，Affinity Biosciences，United Kingdom)、primary mouse anti-DDX4 Antibody(ab27591，Abcam，USA)以及primary rabbit anti-LC3B antibody(18725-1-AP，Proteintech Group，USA)；二抗为：Alexa Flor 594 conjugated donkey anti-rabbitIgG secondary antibody(Life Technologies，Rockford，USA)和Alexa Flor 488conjugated donkey anti-mouse IgG secondary antibody(Life Technologies，Rockford，USA)。TUNEL分析采用In Situ Cell Death Detection Kit(Cat.11684817910，Roche Applied Science)。

2结果

2.1ATG4D致病变异的鉴定

本实施例通过WES调查了NOA患者236人的遗传原因，并由于ATG4D与细胞凋亡密切相关且与NOA具有潜在关联，在来自3个家庭的4名患者中鉴定了ATG4D的致病变异。从细节来说，家庭154是近亲，该家庭包括健康的近亲父母(表兄弟，III：1和III：2)和两位受影响的兄弟(IV：1和IV：3)；家庭208和家庭230均为独生子女家庭(图1A)。受影响的个人在之前的常规精液分析中被诊断为NOA。体检结果显示具有ATG4D致病变异的不育患者是正常的，并表现出正常的激素水平。具有ATG4D致病变异的不育患者的临床数据如表1所示。这些患者的核型为46，XY，且没有检测到Y染色体微缺失(图5)。

表1：NOA患者临床数据

进一步对患者及其家庭进行Sanger测序。在这对兄弟患者中确定了ATG4D中的纯合致病变异NM_032885.6：c.374G＞T。他们的父母均为杂合致病变异携带者(图1B，家庭154)。在一不育患者中确认了复合杂合致病变异NM_032885.6：c.817G＞A和NM_032885.6：c.1183G＞A。他的父亲是NM_032885.6：c.1183G＞A复合杂合致病变异的携带者，他的母亲是NM_032885.6：c.817G＞A复合杂合致病变异的携带者(图1B，家庭208).在受影响的患者中确认了复合杂合致病变异NM_032885.6：c.9_23de1和NM_032885.6：c.884C＞A，他的父亲携带NM_032885.6：c.884C＞A杂合变异，而他的母亲携带NM_032885.6：c.9_23del杂合变异(图1B，家庭230).通过孟德尔的方式，根据表型和家庭，将所有这些致病变异分离。这些突变位点均位于ATG4D的外显子上(图1C)，并导致功能区域的氨基酸取代(图1D)。

2.2ATG4D致病变异的计算机分析

本实施例通过计算机分析评估了ATG4D的新变异。首先，分析了ATG4D的这些新的致病变异的频率。根据通用数据库(例如asgnomAD，1000Genomes，ExAC，ESP6500)，频率数据显示这些致病变异在人群中非常稀少(表2)，这与NOA的发生频率是一直的。其次，评估了被这些致病变异影响的氨基酸的进化保守性。本实施例对比了来自人类和果蝇的ATG4D的氨基酸序列，并发现在不同的物种中(图6)，这些致病变异所影响的氨基酸是高度保守的。此外，本实施例分析了ATG4D的新的致病变异的致病性。大多数的数据库的预测显示这些致病变异是高致病性的(表3)。为了从蛋白质结构角度直观的展示纯和致病变异的效果，本实施例构建了ATG4D的三维模型(图2A)。这个模型表明p.Arg125Leu氨基酸替换显著影响了ATG4D的折叠和结构(图2B)。

表2：ATG4D变异的频率分析

表3：ATG4D变异的计算机分析

2.3具有ATG4D致病变异的睾丸活检的组织学

为了调查精子发生中的ATG4D致病变异的影响，本实施例对两名具有纯和致病变异的患者进行了睾丸活检。HE染色的结果显示对照组的睾丸组织切片富含不同精子发生阶段的生精细胞(图2C)。相反的，来自患者家庭154/IV：1(图2D)和患者家庭154/IV：3(图2E)的睾丸组织切片显示患者的曲细精管中的生殖细胞的显著损失(图2B)。本实施例用免疫荧光染色分析了ATG4D的表达和定位，并发现在对照组的睾丸中ATG4D广泛表达。ATG4D高表达与DDX4阳性生殖细胞，如精原细胞和精母细胞(图3A)。在来自家庭154的患者IV：1和IV：3的睾丸组织中，仍然可以观察到ATG4D阳性染色，但生殖细胞中的ATG4D的表达水平降低了(图3A)。

ATG4D参与了细胞自噬的过程。为了调查具有纯和致病变异的患者的睾丸中的自噬水平，本实施例检测了睾丸组织中的LC3B水平。结果显示LC3B在对照组的睾丸中广泛表达。尽管如此，在患者的睾丸组织中，LC3B的表达水平显著降低(图3B)。同时，本实施例通过TUNEL染色调查了存活的生殖细胞中改的自噬改变的影响。结果显示对照组中只有一小部分生殖细胞经历凋亡。而在具有纯和致病变异的患者的睾丸组织中，TUNEL染色阳性的生殖细胞显著增加(图3C)。

2.4GC-2spd细胞中纯合致病变异的效果

为了调查ATG4D的致病变异的效果，本实施例在ATG4D的纯和致病变异NM_032885.6：c.374G＞T的相同位置建了一小鼠突变质粒(flag-Atg4d

为了探索突变质粒对自噬水平的影响，本实施例测试了GC-2spd细胞中的Lc3b表达水平。免疫荧光染色结果显示在转染了fag-Vector质粒的GC-2spd细胞中Lc3b的表达处于基础水平。在flag-Atg4d转染的GC-2spd细胞中，Lc3b的表达水平增加。而在flag-Atg4d

本实施例进一步通过流式细胞仪检测了GC-2spd细胞的凋亡率。与转染了flag-Vector的对照组相比，本实施例发现转染了flag-Atg4d质粒或flag-Atg4d

3讨论

本实施例的结果显示ATG4D的致病变异在NOA及男性不育中起到了至关重要的作用。

精子发生是男性生殖的基础，而且超过2000基因参与了这个过程。自噬通过保持生殖细胞稳态并促进它们的持续分化，在精子发生中扮演了关键的保护性角色。自噬相关基因的遗传缺陷会影响精子发生并导致男性不育。ATG4D是一个自噬相关的基因，并编码一自噬相关的4D半胱氨酸肽酶。本实施例鉴定了来自4名NOA不育患者的ATG4D的5个致病变异(4/236)。这些致病变异的出现频率在人群中非常低，所影响的氨基酸在不同的物种中是高度保守的，且预测显示这些致病变异具有很高的致病性。此外，ATG4D在生殖细胞中高表达，这些结果显示ATG4D在精子发生中起到了关键的作用。

ATG4D在微管相关蛋白1A/B的轻链3(LC3)的剪切中起到关键作用，ATG4D使LC3脂化成LC3-II(也被称为LC3B)，然后并入自噬体膜。而且，ATG4D也能将来自自噬体膜的LC3-II去脂化，这样就提供了一用以重用的游离LC3-I的细胞质池。p.Arg125Leu的致病变异位于ATG4D的β折叠片。精氨酸是一种具有碱性氨基酸侧链的带正电的碱性亲水性非必需氨基酸，而亮氨酸是一种具有脂肪族氨基酸侧链的非极性疏水必需氨基酸。这样的改变会影响ATG4D的功能和三维结构。在本实施例中，生殖细胞中的ATG4D和LC3B的表达水平均显著降低。而且，TUNEL染色阳性生殖细胞显著增加。这些结果表明该致病变异影响ATG4D的稳定性和三维结构，导致蛋白表达和活性的降低，最终影响自噬的水平，并导致患者睾丸中的生殖细胞的凋亡。

在传递性转染了flag-Atg4d

综上所述，本实施例鉴定了4名NOA不育患者的ATG4D的致病变异。临床发现和遗传结果表明ATG4D的致病变异与NOA以及男性不育相关。ATG4D的遗传缺陷严重妨害了自噬的水平，并导致生殖细胞凋亡(由flag-Atg4d

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。