结肠癌肝转移诊断、治疗相关分子靶标的研究

摘要

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，在欧美发达国家其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第三位，在我国结肠癌的发病率和死亡率已由80年代的第五位和第六位上升至第四位和第五位，每年约有20万人死于结肠癌。结肠癌患者死亡的首要原因是肝转移，发生肝转移的患者治疗后的5年生存率<40％，显著低于无肝转移结肠癌患者>70％。因此，对于结肠癌肝转移，尤其是异时性肝转移的早诊和参与的复杂过程。这一特点使我们能够筛选出与结肠癌肝转移相关、能预测结肠癌肝转移风险的分子标志物，从而为临床实行个体化治疗提供重要的依据。
　　 第一部分研究，我们建立3个模型，用于初筛与结肠癌肝转移密切相关的分子标志物。在模型一中，我们对oncomine数据库中Graudens、Bittner以及ki等人关于134例已发生肝转移结肠癌原发瘤组织与362例无肝转移的结肠癌原发瘤组织基因表达谱的荟萃分析数据进行了分析，筛选出200个在有肝转移结肠癌原发瘤组织中上调表达的基因。根据差异基因的上调倍数、是否具有商业化抗体、生物信息学分析以及文献调研，最终筛选出6个候选基因，即OPN、BNIP3、ARG1、MAP2、MAPIA以及SNCG。
　　 鉴于从该模型中筛选的标志物只能检测出那些能从原发瘤脱落，进入血循环的有转移潜能的癌细胞，但是这些癌细胞不一定适合在肝脏存活、增殖形成肝转移灶[3]。为了提高预测结肠癌肝转移分子标志物的特异性，我们建立了第二个模型:体外从与人肝窦内皮细胞低黏附的结肠癌细胞SW1116与人正常肝窦内皮细胞进行黏附筛选，获得了高黏附的结肠癌细胞亚系SW1116P21。对其进行体内外生物学特性研究发现，SW1116P21的增殖、侵袭以及软琼脂克隆形成等功能显著提高；皮下成瘤能力增强。将其接种裸鼠脾脏，在肝脏形成的转移灶数量和大小也明显增加，表明SW1116P21是一株与人肝窦内皮高黏附高肝转移的结肠癌亚细胞系。对该细胞进行了基因表达谱分析表明，与亲本细胞相比有102个基因上调表达。根据生物信息学，文献调研以及模型一采用选择标准，最终筛选出CCL2、Cyr61、Ax1、GalectinBP4个结肠癌肝转移候选分子标志物。
　　 为了进一步提高预示肝转移分子标志物的敏感性、准确性，我们又建立了第三个模型，即分析6例结肠癌原发瘤组织和配对的肝转移灶组织的差异基因表达谱，并采用SAM分析获得了在肝转移灶显著上调表达的44个基因，根据文献调研、功能分析从中选择了P-cadherin、OPN、SNCG3个候选分子作为预测结肠癌肝转移的候选标志物。
　　 我们收集了245例标本，包括在141例有肝转移(含异时性肝转移48例)和104例无肝转移的结肠癌原发瘤组织，并将其随机分成含有117例标本的training组和含有128例的test组。首先采用免疫组化的方法检测从将3个模型选择出的11个候选分子标志物在20例有肝转移和20例无肝转移的结肠癌原发瘤组织中的表达情况，结果显示其中的4个标志物在有肝转移组的表达水平和阳性率均高于无肝转移组，且p值<0.05。随后将4个标志物在其余病例检测，结果发现P-cadherin、OPN、SNCG以及CCL2在有肝转移组的表达水平和阳性率显著高于无肝转移组。多因素逻辑回归分析发现OPN、SNCG以及CCL2能很好预测结肠癌肝转移(p<0.05)，而P-cadherin被剔除(p>0.05)。为了进一步验证分子标志物预测结肠癌肝转移的能力，我们在training组中对3个标志物进行了留一验证，结果表明这3个分子标志物预测结肠癌肝转移的敏感性为90.5％，特异性为90.7％，并且获得了判别公式。将该公式在独立的test组中的128例病人(包括50例未发生肝转移的结肠癌病人，以及78例发生结肠癌肝转移的病人，肝转移病人包括了48例异时性肝转移)进行结肠癌肝转移的预测，预测结果是50例未发生肝转移的病人能够正确判断43个，在发生肝转移的病人能正确判断69个，其敏感性和特异性分别达到88.4％，86％。在48例异时性肝转移标本中正确判断43个，其敏感性及特异性达到89.5％，86％。同时将这3个分子标志物与结肠癌其他临床病理因素进行了相关性分析发现，OPN、CCL2和SNCG的异常表达与血清CEA含量、TNM分期、肝转移关系紧密。CCL2和SNCG的异常表达还与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移密切相关。SNCG的异常表达还与肿瘤的大小密切相关。
　　 论文第二部分研究是对第一部分中筛选出的在有肝转移灶以及在发生肝转移的结肠癌原发灶高表达的P-cadherin基因在结肠癌发生发展的作用、功能以及相关分子机制进行了较系统的研究。RNA干扰实验结果显示该基因沉默后显著抑制结肠癌细胞的克隆形成、增殖、运动且增加癌细胞之间的粘附。体内能明显抑制肿瘤细胞的生长，以及实验性肝转移。转染小鼠3T3细胞能明显促进细胞的克隆形成，增殖和体内致瘤性。这些结果表明P-cadherin在结肠癌的恶性转化、生长及其肝转移中发挥重要作用和功能。
　　 分子机制的研究，我们首次发现了P-cadherin一方面下调E-cadherin的表达，并影响a-catenin的定位，抑制癌细胞间的粘附。另一方面，P-cadherin上调β-catenin的表达并同时促进β-catenin从细胞膜向细胞浆、细胞核的转位，从而促进结肠癌细胞的克隆形成、增殖、运动以及转移。
　　 综上所述，一方面，我们应用3个不同的模型、临床标本以及统计分析，最终获得了3个能很好预示结肠癌肝转移尤其是异时性肝转移的分子标志物，CCL2、SNCG、OPN。另一方面，首次发现P-cadherin通过下调E-cadherin和上调β-catenin的表达，影响细胞增殖、运动、黏附、克隆形成，在结肠癌肝转移中起到重要作用，是一个有应用价值的治疗结肠癌肝转移的潜在靶点。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 结肠癌肝转移相关分子的筛选鉴定

摘要

前言

一.材料方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二.实验结果

(一)Oncomine的数据库分析筛选预示结肠癌肝转移的相关分子

(二)与人肝窦内皮高黏附高肝转移模型的建立

(三)人结肠癌原发瘤与配对肝转移灶的组织基因表达谱差异分析

(四)预示结肠癌肝转移的相关分子标志物的汇总

(五)预示结肠癌肝转移候选分子标志物的初筛

(六)预示结肠癌肝转移分子标志物的鉴定与确证

讨论

小结

第二部分 结肠癌肝转移相关基因P-cadherin的功能及分子机制的研究

摘要

前言

一.材料与方法

(一).实验材料

(二).实验方法

二.实验结果

(一)结肠癌肝转移过表达基因的筛选

(二)P-cadherin基因在结肠癌的功能研究

(三)P-cadherin基因促进结肠癌肝转移的分子机制

讨论

小结

全文小结

参考文献

致 谢

附录 研究生期间发表论文