利用Staple核酸的蛋白质翻译反应的抑制法

摘要

本发明提供一种抑制蛋白质表达的方法。一种抑制蛋白质表达的方法，其通过对于具有第一、第二、第三及第四鸟嘌呤重复序列(分别称为第一G序列、第二G序列、第三G序列、第四G序列)的RNA，使用与所述鸟嘌呤重复序列的附近区域杂交的低聚物，使所述鸟嘌呤重复序列靠近，形成鸟嘌呤四链体结构。

说明书

技术领域

本发明涉及通过序列选择性地与目标mRNA序列结合，诱发目标mRNA上鸟嘌呤四链体结构的形成，从而阻碍核糖体的肽合成反应，并抑制蛋白质翻译反应的方法。

背景技术

micro RNA、siRNA等各种各样的基因表达抑制技术已经被发现

现有技术文献

专利文献

非专利文献

非专利文献1:Fire,A.；Xu,S.；Montgomery,M.K.；Kostas,S.A.；Driver,S.E.；Mello,C.C.Nature 1998,391,806.

非专利文献2:Ambros,V.Nature 2004,431,350.

非专利文献3:Jackson,A.L.；Linsley,P.S.Nature reviews.Drug discovery2010,9,57.

非专利文献4:Jackson,A.L.；Burchard,J.；Leake,D.；Reynolds,A.；Schelter,J.；Guo,J.；Johnson,J.M.；Lim,L.；Karpilow,J.；Nichols,K.；Marshall,W.；Khvorova,A.；Linsley,P.S.Rna 2006,12,1197.

发明内容

本发明所要解决的技术问题

对于以新药研发为目标的核酸医药的开发，需要采用可以利用在活体内稳定的修饰核酸，且不易发生脱靶效应的蛋白质翻译抑制技术。

本发明的发明人，为了解决所述技术问题而进行深入探讨，结果，通过使用被称为Staple核酸的低聚物而序列选择性地形成鸟嘌呤四链体，成功抑制了蛋白质合成，完成了本发明。

解决技术问题的技术手段

即，本发明如下：

(1)一种抑制蛋白质表达的方法，其通过对于包含第一、第二、第三以及第四鸟嘌呤重复序列(分别称为第一G序列、第二G序列、第三G序列、第四G序列)的目标RNA，使用与所述鸟嘌呤重复序列附近杂交的低聚物，利用该低聚物的折叠，使所述鸟嘌呤重复序列靠近，形成鸟嘌呤四链体结构，其中，

所述低聚物的一端侧的一部分区域(一端侧区域)的核酸以及另一端侧的一部分的区域(另一端侧区域)核酸：

在第一G序列和第二G序列之间，分别与第一G序列的附近以及第二G序列的附近杂交；

在第二G序列和第三G序列之间，分别与第二G序列的附近以及第三G序列的附近杂交；或者

在第三G序列和第四G序列之间，分别与第三G序列的附近以及第四G序列的附近杂交。

(2)根据(1)所述的方法，其中，

所述低聚物被设计为其折叠的方向面向鸟嘌呤四链体结构一侧而杂交。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，

目标RNA为mRNA、TPM3或MYD8。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其中，

所述低聚物为DNA或RNA。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，

所述低聚物为二聚体。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，

蛋白质表达为逆转录反应或蛋白质翻译反应。

(7)一种聚物，其是对于包含第一、第二、第三以及第四鸟嘌呤重复序列(分别称为第一G序列、第二G序列、第三G序列、第四G序列)的目标RNA，使所述鸟嘌呤重复序列靠近并形成鸟嘌呤四链体结构的低聚物，

所述低聚物的一端侧的一部分区域(一端侧区域)的核酸以及另一端侧的一部分区域(另一端侧区域)的核酸：

在第一G序列和第二G序列之间，分别与第一G序列的附近以及第二G序列的附近杂交；

在第二G序列和第三G序列之间，分别与第二G序列的附近以及第三G序列的附近杂交；或者

在第三G序列和第四G序列之间，分别与第三G序列的附近以及第四G序列的附近杂交，

通过所述低聚物折叠而使所述鸟嘌呤重复序列靠近。

(8)根据(7)所述的低聚物，其中，

所述折叠的方向被设计为面向鸟嘌呤四链体结构一侧而杂交。

(9)根据(7)或(8)所述的低聚物，其为DNA或RNA。

(10)根据(7)～(9)中任一项所述的低聚物，其为二聚体。

(11)根据(7)～(10)中任一项所述的低聚物的制造方法，其中，

进行设计并合成，从而使得低聚物的一端侧的一部分区域(一端侧区域)的核酸以及另一端侧的一部分区域(另一端侧区域)的核酸：

在第一G序列和第二G序列之间，分别与第一G序列的附近以及第二G序列的附近杂交；

在第二G序列和第三G序列之间，分别与第二G序列的附近以及第三G序列的附近杂交；或者

在第三G序列和第四G序列之间，分别与第三G序列的附近以及第四G序列的附近杂交。

(12)一种蛋白质表达抑制试剂盒，其包含：(7)～(10)中的任一项所述的低聚物或通过(11)所述的方法所制造的低聚物。

发明的效果

通过本发明，开发了序列选择性地与目标mRNA序列结合(杂交)的低聚物的设计方法，通过使用所设计的低聚物，在目标mRNA上诱发稳定的鸟嘌呤四链体结构，能够抑制核糖体的肽合成反应。

附图说明

图1是鸟嘌呤四链体(G-quadruplex)的概要图。(a)G-四链体(G-quadruplex)的结构。4条鸟嘌呤重复区域靠近而形成G-四链体结构。(b)G-四链体形成规则。根据基于核酸的热稳定性的高级结构预测，鸟嘌呤重复3碱基以上，鸟嘌呤重复序列彼此连接的碱基数在7碱基以下时G-四链体会被构建。(c)已知如果在mRNA中构建G-四链体时，核糖体的肽链延伸反应会被抑制，其结果，蛋白质合成反应会被抑制。

图2是表示DNA折纸术的概要的图。(a)通过将1条链环状DNA和226条的短DNA链混合并进行退火，能够制作出任意的DNA纳米结构体。(b)将制作的纳米结构体在高速原子间力显微镜(高速AFM)下观察的结果。

图3是表示使用硫黄素T(Thioflavin T)对G-四链体的形成进行了确认的探讨结果的图。(a)硫黄素T的化学结构式。(b)2+2 100nt型和2+2 100nt mutA型模板RNA的序列。红字：待靠近的鸟嘌呤重复序列。以及腺嘌呤重复序列。(c)staple核酸导入后的结构图。通过鸟嘌呤重复序列靠近而构建G-四链体。(d)测定荧光信号的结果。

图4表示停止试验评价的概要的图。(a)停止试验(Stop assay)的原理。RNA G-四链体使逆转录酶的延伸反应停止。因此通过读取直到逆转录酶停止的位置而生成的cDNA的碱基序列，能够确认RNA G-四链体被构建的位置。(b)使用2+2 100nt RNA的停止试验的结果。除了内环(inside loop)2以外，均能够确认到了显示RNA G-四链体的存在的显著的峰。(c)改变连接鸟嘌呤柱彼此之间的loop碱基的长度时的停止试验的结果。(d)用停止试验评价1+3 100nt RNA型的结果。(d)将导入的staple核酸从DNA变为RNA的结果。

图5是表示生物体外翻译试验(in vitro translation assay)的概要的图。(a)在5'UTR区域中将2+2 100nt RNA等各种各样的模式的评价对象配置于萤火虫荧光素酶的上游，对通过Staple核酸产生的蛋白质表达抑制效果进行了评价的结果。(b)以2+2 100ntRNA为对象的体外翻译试验的结果。(c)对于全部模式的mRNA进行了体外翻译试验结果。

图6是表示以天然序列为目标的Staple核酸的评价实验的结果的图。(a)用于评价的TPM3和MYD88的序列。(b)以TPM3和MYD88作为对象的停止试验的结果。可以看出由于Staple核酸的存在而构建了RNA G-四链体。(c)以TPM3和MYD88为目标的体外翻译试验的结果。在任一结果中均能看出由于Staple核酸的存在，蛋白质表达量减少了。(d)用于进行细胞内的staple核酸的功能评价的评价对象的设计。由于IRES的存在，核糖体从5'末端和IRES这两处侵入，合成蛋白质。(e)细胞内蛋白质翻译试验的结果。

图7是Staple核酸逆向连接时的评价实验的结果的图。

本发明的具体实施方式

本发明设计对于具有第一、第二、第三及第四的4个鸟嘌呤重复序列的RNA，通过使用与所述鸟嘌呤重复序列的附近区域杂交的低聚物，使所述鸟嘌呤重复序列靠近，形成鸟嘌呤四链体结构，从而抑制蛋白质表达的方法。

众所周知，存在于mRNA上的稳定的鸟嘌呤四链体结构(称为G-四链体结构)会抑制核糖体的肽链延伸反应。如果能在任意的mRNA上，人为地诱发G-四链体结构，能够抑制与疾病相关的蛋白质的表达量。本发明提供应用DNA折纸(origami)技术，通过序列选择性地捕捉目标mRNA并折叠，在目标mRNA上诱发稳定的G-四链体结构，目标mRNA选择性地抑制蛋白质的翻译的新型核酸医药的设计方法。

本发明中使用的低聚物，其一端侧的一部分的区域(一端侧区域)的核酸以及另一端侧的一部分的区域(另一端侧区域)的核酸在RNA的第一的鸟嘌呤重复序列(称为第一G序列)、第二鸟嘌呤重复序列(称为第二G序列)、第三的鸟嘌呤重复序列(称为第三G序列)以及第四鸟嘌呤重复序列(称为第四G序列)中，分别与第一G序列和第二G序列、第二G序列和第三G序列、以及第三G序列和第四G序列的附近区域的核酸杂交。此低聚物在本发明中，称为“Staple核酸”。

本发明的方法要在细胞内发挥功能，需要同时具备核酸的序列识别能力和G-四链体结构形成能力，能够实现凌驾现有的核酸医药的目标选择性。本发明的有用性通过使用模型序列的验证，证明了(1)无论鸟嘌呤重复区域的长度及序列如何，通过导入Staple核酸能够构建RNA G-四链体，(2)诱发的G-四链体结构能够抑制逆转录酶的延伸反应及核糖体的蛋白质翻译反应。另外，通过使用无细胞体系表达系统和哺乳动物细胞的表达评价确认了，将存在于作为癌相关基因的TMP3和MYD88 mRNA的5'UTR的鸟嘌呤簇折叠，能够抑制蛋白质合成。

本发明着眼于蛋白质的翻译抑制机制中作为RNA四链体结构的RNA G-四链体结构(图1(a))。RNA G-四链体结构是3碱基以上的鸟嘌呤连续序列以不足7碱基的接近的间隔存在4个时构建的稳定的RNA高级结构(图1(b))

近年，本发明的发明人发现了以7碱基以上的间隔存在的鸟嘌呤连续序列会构建RNA G-四链体结构

然而，通过使超过7000碱基的环状单链DNA与所设计的200条左右的30多碱基的短链DNA(Staple低聚物)自组装而制作纳米结构体的技术DNA折纸法是已知的(图2)

如同所述，如果4条鸟嘌呤重复区域接近，就会形成G-四链体结构(图1a)。在本发明中，为了使存在于RNA上的4个鸟嘌呤重复区域接近，而使用特定的低聚物。此低聚物发挥使得第一鸟嘌呤重复序列和第二鸟嘌呤重复序列、第二鸟嘌呤重复序列和第三鸟嘌呤重复序列及第三鸟嘌呤重复序列和第四鸟嘌呤重复序列接近，作为整体，使4个鸟嘌呤重复序列接近的功能，在本明细书中称为“Staple核酸”。

在这里，作为目标RNA，例如可以举出mRNA、TPM3、MYD8等。TPM3是与肌肉收缩相关的基因，MYD8是介导Toll和白介素(IL)1受体信号传达的衔接蛋白质。

作为目标的RNA所含的鸟嘌呤重复序列不限于4个，也可以含有5个以上。另外，第一、第二、第三及第四鸟嘌呤重复序列是指可以从4个以上的鸟嘌呤重复序列中任意选择的4个部位的序列，未必一定指使连续的4个部位的鸟嘌呤重复序列形成G-四链体结构。例如，假设某个RNA中存在6个的鸟嘌呤重复序列，可以使从5'侧开始按顺序第1、第2、第3以及第4的鸟嘌呤重复序列形成G-四链体结构，也可以使第1、第2、第5以及第6鸟嘌呤重复序列形成G-四链体结构。总而言之，只要形成G-四链体结构，抑制RNA的蛋白质表达即可，对4个鸟嘌呤重复单位的位置不做限定。

在这里，本发明中蛋白质表达的抑制是指例如包含从mRNA的逆转录反应的抑制、从RNA到蛋白质的翻译反应的抑制等。

图3(b)表示第一以及第二鸟嘌呤重复序列(从图的左边开始第1以及第2的“●●●”记号)以及第三以及第四鸟嘌呤重复序列(从图的左边开始第3以及第4的“●●●”记号)相互接近，且第二鸟嘌呤重复序列和第三的鸟嘌呤重复序列显示100核苷酸的长度的样态。在图3b中，以从左边开始的第1个鸟嘌呤重复序列作为第一G序列、以从左边开始的第2个鸟嘌呤重复序列作为第二G序列、以从左边开始的第3个鸟嘌呤重复序列作为第三G序列、以从左边开始的第4个鸟嘌呤重复序列作为第四G序列，由于第二G序列和第三G序列之间远离，要通过折叠此区域，使第二G序列和第三G序列靠近。

因此，Staple核酸被设计为其一端侧(例如3'侧)的一部分的区域的核酸与第二G序列的稍下游区域的核酸杂交，另一端侧(例如5'侧)的一部分的区域的核酸与第三G序列的稍上游的区域的核酸杂交。此时，所述一端侧区域以及另一端侧区域的核酸，以折叠方向(凸侧)面向G-四链体结构侧的形式杂交。Staple核酸与RNA杂交的区域可以根据RNA的种类适当设计。例如对于图3b所示的RNA的设计Staple核酸时，可以从第二G序列的下游侧的13～20碱基的碱基区域中选择作为进行杂交的区域的13～20碱基的碱基区域，另外，从第三G序列的上游侧的13～20碱基的碱基区域中选择作为进行杂交的区域的13～20碱基的区域即可。设计对于其他区域的Staple核酸时也是同样的。

Staple核酸，可以是DNA，也可以是RNA。Staple核酸的长度为26～40核苷酸。就Staple核酸与RNA进行杂交的区域的长度而言，所述一端侧区域以及另一端侧区域的长度可以相同也可以不同，没有特别限制。Staple核酸可以通过市售的核酸合成装置容易地获得。

使用如此设计的Staple核酸，使鸟嘌呤重复序列接近的样态如图4所示。图4b中，“内环(inside loop)1”样态是，Staple核酸的两端侧的一部分的与RNA进行杂交，并且Staple核酸的折叠(折叠)方向面向鸟嘌呤四链体结构一侧。在图4中，为了使折叠方向容易理解表示为环(loop)状，但本发明的Staple核酸以与RNA进行杂交的一个区域和另一个区域之间的边界为支点折叠。在图4b中，“外环(Outside loop)”的样态与内环1相同，Staple核酸的两侧的一部分的区域与RNA进行杂交，并使折叠方向(以环状表示的部分的凸侧(外围侧))面向G-四链体结构侧。另外在本发明中，Staple核酸不需要是单链，可以是两条链以上结合或杂交而形成二聚体、三聚体等。在图4b中，[二聚物(Dimer)]的样态由2条链的Staple核酸构成，在不与RNA杂交的区域彼此(1个或多个碱基)进行杂交形成折叠区域(图中折叠区域以复数的碱基所表示)，并且作为一个整体而形成二聚体。该二聚体型Staple核酸中，在两侧的一部分的区域与RNA进行杂交，并且折叠部面向G-四链体结构侧。

如上所述而设计得到的Staple核酸和RNA的反应，即G-四链体结构的形成反应可以如下而进行：例如，可以通过在含有RNA的溶液中混合Staple核酸并通过进行退火而进行；或者，可以在含有RNA的溶液中仅混合Staple核酸；或者可以通过导入短发夹表达载体(Short hairpin expression vector)，在细胞内使Staple核酸表达而进行。RNA和Staple核酸的反应时间，例如可以是1分钟(试管实验)～2天(细胞实验)，反应温度例如可以是24～55℃。形成了G-四链体结构的确认，例如除实施例所示的体外翻译试验外，还可以通过基于与硫黄素T反应而进行的荧光信号测定法、停止试验法等进行。

根据本发明的方法所设计得到的Staple核酸，由于用于蛋白质表达抑制，因此可以包含于蛋白质表达抑制试剂盒。因此，本发明提供包含所述低聚物(Staple核酸)的蛋白质表达抑制试剂盒。本发明的试剂盒中，除了所述低聚物，还可以包含缓冲液、PCR用试剂、体外翻译用试剂、荧光素酶、使用说明书等。

实施例

以下，根据实施例对本发明进一步具体说明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1

1.材料

(1)DNA寡核苷酸

DNA寡核苷酸是从Eurofins Genomics公司、Integrated DNA Technologies公司、Thermo Fisher Scientific公司购入的。所有的样品都经过OPC纯化或脱盐，并用于RNA G-四链体的形成或存在位置的确认或体外蛋白质翻译反应抑制效果的评价。

2.方法

(1)2+2_100nt RNA，2+2_100nt_Mut A RNA的准备和使用硫黄素T的RNA G-四链体形成的确认

使用下述核苷酸进行了退火延伸。

5'-TAATACGACTCACTATAGATTAGCATACGCTACTGCAGATGCGC-3'(序列编号1)

5'-GCTGAATAGCTTGCAAGTCATGGCATGCGCATCTGCAGTAGCGT-3'(序列编号2)

以延伸的核苷酸作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pMD19载体(Takara Bio.)中。

上游引物：5'-TAATACGACTCACTA TAG-3'(序列编号3)

下游引物：5'-TCCAACTATGTATACCTGCTGAATAGCTTGCAAGTC-3'(序列编号4)

然后，以如上所述而制作的质粒DNA作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，制作了插入(insert)DNA。

上游引物：5'-CTATAGTGAGTCGTATTAAATCGTCGAACGGCAGG-3'(序列编号5)

下游引物：5'-CAGGTATA CATAGTTGGAAATCTCTGGAAGATCCG-3'(序列编号6)

另外，以具有下述序列的核苷酸作为模板以及引物，进行了PCR扩增，制作了线型载体(linear vector)。

模板：

5'-ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGTTTGCACG CCTGCCGTTCGACGATTTAATACGACTCACTATAGATTAGCATACGCTACTGCAGTGGGTGGGTGTCGACCTAGATTAATGCAATTCGTACGAAGTTCATAGCATTTCCAGCACCCAATTGAAGCTTTGGGTGGGTGCATGCCATGACTTGCAAGCTATTCAGCAGGTATACATAGTTGGAAATCTCTGGAAGATCCGCGCGTACCGAGTTCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCA-3'(序列编号7)

上游引物：5'-TAATACGACTCACTATAGAA-3'(序列编号8)

下游引物：5'-TCCAACTATGTATAC CTG-3'(序列编号9)

然后，使用HiFiAssembly(NEB)将制作的插入DNA和线型载体连接(pMD19-2+2_63nt)。进一步，将pUC19载体(Takara Bio.)作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，制作了插入DNA。

上游引物：5'-CCTAGATTAATGCAATTC GTGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC-3'(序列编号10)

下游引物：5'-TCAATTGGGTGCT GGAAATGAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG-3'(序列编号11)

另外，pMD19-2+2_63nt作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，制作了线型载体。

上游引物：5'-CATTTCCA GCACCCAATTGAAGCTT-3'(序列编号12)

下游引物：5'-ACGAATTGCATTAATCTAG GTCGAC-3'(序列编号13)

然后，使用HiFiAssembly(NEB)将制作的插入DNA和线型载体连接(pMD19-2+2_100nt)。

以制作的pMD19-2+2_100nt作为模板，使用以下的引物用PCR扩增2+2_100nt，并克隆至pIRES载体(Takara Bio.)的EcoR I位点。

上游引物：5'-CTAGCCTCGAGAATTGATTAGCAT ACGCTACTGC-3'(序列编号14)

下游引物：5'-CCATGGTGGCGAATTCTGAATAGCTTGCAAGTC AT-3'(序列编号15)

对于从GGG变异为AAA的变异体的2+2_100nt_Mut A使用具有以下的序列的模板DNA、上游引物、下游引物分别进行退火延伸，将得到的产物通过PCR连接(2+2_100nt_MutA)。

(i)MutA-1

模板：5'-AGGGATTAGCATACGCTACTGCAGTAAAT AAATGTCGACCTAG-3'(序列编号16)

上游引物：5'-CGGTACCCGGGGATCTAATACGACTCACTATAGGGAT TAGC-3'(序列编号17)

下游引物：5'-CACGAATTGCATTAATCTAGGTCGAC-3'(序列编号18)

(ii)MutA-2

模板：pMD19-2+2_100nt

上游引物：5'-GTCGACCTAGATTAATGCAATTCGTG-3'(序列编号19)

下游引物：5'-AAGCTTCAATTGGGTGCTGGAA ATG-3'(序列编号20)

(iii)MutA-3

模板：5'-ATTGAAGCTTTAAATAAATGCATGCCATGACTTGCAAG-3'(序列编号21)

上游引物：5'-CATTTCCAGCACCCAATTGAAGCTT-3'(序列编号22)

下游引物：5'-CGACTCTAGAGGATCCTGAATAGCTT GCAAGTCAT-3'(序列编号23)

将此克隆至pUC19载体(Takara Bio.)的BamH I(pUC19-2+2_100nt_MutA)。所有的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳后，进行了切出纯化。以制作的pIRES-2+2_100nt和pUC19-2+2_100nt_Mut A作为模板，使用以下任意引物通过PCR扩增准备了用于RNA转录的lineardsDNAs。

上游引物：5'-TAATACGACTCACTATAGG GCTAGCCTCGAG-3'(序列编号24)

下游引物：5'-CCATGGTGGCGAATTCTGAATAGCTTGCAAGTCAT-3'(序列编号25)

或

上游引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(序列编号26)

下游引物：5'-CGACTCTAGAGGATCCTGAATAG CTTGCAAGTCAT-3'(序列编号27)

进一步，以此dsDNAs作为模板，使用RiboMAX

(2)使用了人工序列(2+2_100nt)和天然基因(TPM3，MYD88)的5'UTR序列的停止试验

以人类基因组(human genomic)DNA(Novagen)作为模板，使用以下的引物进行了TPM3-5'UTR和MYD88-5'UTR的PCR扩增。

上游引物：5'-GTCACATCC GGGCGGGTTGGTGAGT-3'(序列编号28)

下游引物：5'-GGTGCCCACCCAGCTACTGCTCGCG-3'(序列编号29)

或

上游引物：5'-AGATTCCTACTTCTTACGCCCCCCA-3'(序列编号30)

下游引物：5'-TGTCTGCCAGCGCTTCCTCTTTCTC-3'(序列编号31)

以得到的PCR产物作为模板，使用以下的引物进一步进行PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pMD19载体(Takara Bio.)(pMD19-TPM3、pMD19-MYD88)。

上游引物：5'-TAATACGACTCACTATAGGTCACATCCGG GCGGGTTGGTGAGT-3'(序列编号32)

下游引物：5'-TCCAACTATGTATACCTGGGTGCCCACCCAGCTACT GCTCGCG-3'(序列编号33)

或

上游引物：5'-TAATACGACTCACTATAGAGATTCCTACTTCTTACGCCCCC CA-3'(序列编号34)

下游引物：5'-TCCAACTATGTATACCTGTGTCTGCCAGCGCTTCCTCTTTCTC-3'(序列编号35)

以pMD19-5'UTR(2+2_100nt，TPM3，MYD88)作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，准备了用于RNA转录的线型dsDNAs。

上游引物：5'-ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAG-3'(序列编号36)

下游引物：5'-TGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3'(序列编号37)

进一步，以此dsDNAs作为模板，使用HiScribe T7 High Yield RNA SynthesisKit(NEB)将dsDNAs转录为RNAs。转录得到的RNAs使用After Tri-Reagent RNA Clean-UpKit(Chiyoda Science)进行了纯化。

将包含RNA(0.3μM)和5'-FAM-标记-3'-DNA引物(0.1μM)，Staples(1μM)的溶液在80℃下进行3分钟孵育，历时30分种将温度降至30℃。向此溶液中加入ReverTra Ace逆转录酶(TOYOBO)，MgCl

(3)以使用了人工序列(2+2_100nt)和天然基因(TPM3、MYD88)的5'UTR序列的体外翻译

psiCHECK-2载体(Takara Bio.)作为模板，使用以下的引物进行萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase(F.L.))的PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pIRES载体(TakaraBio.)的EcoR I位点(pIRES-F.L.)。

上游引物：5'-CTAGCCTCGAGAATT CGCCACCATGGCCGATGCTAAGAAC-3'(序列编号38)

下游引物：5'-CTCGACGCGTGAATTTT ACACGGCGATCTTGCC-3'(序列编号39)

上游引物被设计为克隆后在F.L.的上游使EcoR I位点复活。5'UTR(2+2_100nt、TPM3、MYD88)将pMD19-5'UTR(2+2_100nt，TPM3，MYD88)作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pIRES-F.L.载体的EcoR I位点(pIRES-5'UTR-F.L.(5'UTR：2+2_100nt，TPM3，MYD88))。

上游引物：5'-CTAGCCTCGAGAATTGAT TAGCATACGCTACTGC-3'(序列编号40)

下游引物：5'-CCATGGTGGCGAATTCTGAATAGCTTGCAAGTC AT-3'(序列编号41)

或

上游引物：

5'-CTAGCCTCGAGAATTTCACATCCGGGCGGGTTG-3'(序列编号42)或

5'-CTAGCCT CGAGAATTAGATTCCTACTTCTTACGCC-3'(序列编号43)

下游引物：5'-CCATGGTGGCGAATTGTTTTCCC AGTCACGACG-3'(序列编号44)

所有的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳后，进行了切出纯化。以pIRES-5'UTR-F.L.作为模板，使用以下的引物，通过PCR扩增准备了用于RNA转录的线型dsDNAs。

上游引物：

5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTAGCCT CGAG-3'(序列编号45)

5'-TAATACGACTCACTATAGGGTCACATCCGGG-3'(序列编号46)或

5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCTAC-3'(序列编号47)

下游引物：5'-CTCGACGCGTGAAT TTTACACGGCGATCTTGCC-3'(序列编号48)

进一步，以此dsDNAs作为模板，使用RiboMAX

(4)以使用了天然基因(TPM3，MYD88)的5'UTR序列的细胞内翻译(in celltranslation)

将nLuc载体(Takara Bio.)或psiCHECK-2载体(Takara Bio.)作为模板，使用以下的引物进行NanoLuc荧光素酶(NanoLuc luciferase(nLuc))和海肾荧光素酶(renillaluciferase(renilla))的PCR扩增，将得到的PCR产物分别克隆至pIRES载体(Takara Bio.)的EcoR I、Not I位点(pIRES-nLuc-renilla)。

上游引物：5'-CTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGTCTTCACACTCGAAG-3'(序列编号49)

下游引物：5'-CTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGTCTTCACACTCGAAG-3'(序列编号50)

或

上游引物：5'-TCGACCCGGGCGGCCATGGCTTCCAAGGTGTACG-3'(序列编号51)

下游引物：5'-TAAAGGGAAGCGGCCTTACTGCTCGTTCTTCAGC-3'(序列编号52)

用于nLuc的PCR的上游引物被设计为克隆后在nLuc的上游EcoR I位点会复活。所有的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳后，进行了切出纯化。进一步，以pMD19-TPM3或pMD19-MYD88作为模板，使用以下的引物用PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pIRES-nLuc-renilla的EcoR I位点(pIRES-5'UTR-nLuc-renilla(5'UTR：TPM3，MYD88))。

上游引物：5'-CTAGCCTCGAGAATTTCACATCCGGGCGGGTTG-3'(序列编号53)或5'-CTAGCC TCGAGAATTAGATTCCTACTTCTTACGCC-3'(序列编号54)

下游引物：5'-CCATGGTGGCGAATT GTTTTCCCAGTCACGACG-3'(序列编号55)

另外，使用以下任一的引物的组合分别进行退火延伸，制作了Staples(TPM3_30nt，26nt和MYD88_30nt，26nt)。

(i)引物STM1

上游引物：5'-GATCCCCTACCGGAACTCACCA GCTACTGCTCGCGCTTTTTTA-3'(序列编号56)

下游引物：5'-AGCTTAAAAAAGCGCGAGCAGTAGCTGGT GAGTTCCGGTAGGG-3'(序列编号57)

(ii)引物STM2

上游引物：5'-GATCCCCCCGGAACTCACCAGCTACTGCTCGCG TTTTTA-3'(序列编号58)

下游引物：5'-AGCTTAAAAACGCGAGCAGTAGCTGGTGAGTTCCGGGGG-3'(序列编号59)

(iii)引物STM3

上游引物：5'-GATCCCCTCTATCTCCTGCGGCACAATCTGGAGCCCCTTTTTA-3'(序列编号60)

下游引物：5'-AGCT TAAAAAGGGGCTCCAGATTGTGCCGCAGGAGATAGAGGG-3'(序列编号61)

(iv)引物STM4

上游引物：5'-GATCCCCTATCTCCTGCGGCACAATCTGGAGCCTTTTTA-3'(序列编号62)

下游引物：5'-AGCTTAAAAAGG CTCCAGATTGTGCCGCAGGAGATAGGG-3'(序列编号63)

制作的Staple核酸的碱基序列如下所示。

用于ThT实验的Staple(40nt)2+2_100nt：

内环TTGCATTAATCTAGGTCGACAAGCTTCAATTGGGTGCTGG(序列编号64)

用于停止试验的Staple 2+2_100nt：

内环40nt TTGCATTAATCTAGGTCGACAAGCTTCAATTGGGTGCTGG(序列编号65)

2+2_100nt：

内环_逆向连接40nt AAGCTTCAATTGGGTGCTGGTTGCATTAATCTAGGTCGAC(序列编号66)

TPM3：DNA Staple内环40nt GAAATACCGGAACTCACCAAAGCTACTGCTCGCGCTCCGG(序列编号67)

MYD88：DNA Staple外环40nt TTCCTCTTTCTCCTGCGGCATACAATCTGGAGCCCCGAGC(序列编号68)

2+2_100nt：RNA Staple内环30nt UUAAUCUAGGUCGACAAGCUUCAAUUGGGU(序列编号69)

2+2_100nt：RNA Staple内环26nt AAUCUAGGUCGACAAGCUUCAAUUGG(序列编号70)

用于体外翻译的Staple(40nt)

2+2_100nt：内环TTGCATTAATCTAGGTCGACAAGCTTCAATTGGGTGCTGG(序列编号71)

2+2_100nt：内环_逆向连接AAGCTTCAATTGGGTGCTGGTTGCATTAATCTAGGTCGAC(序列编号72)

TPM3：内环TGAAATACCGGAACTCACCAGCTACTGCTCGCGCTCCGGT(序列编号73)

MYD88：外环CTTCCTCTTTCTCCTGCGGCACAATCTGGAGCCCCGAGCA(序列编号74)

用于细胞内翻译的RNA Staple TPM3：

RNA Staple内环30nt UACCGGAACUCACCAGCUACUGCUCGCGCU(序列编号75)

TPM3：RNA Staple内环26nt CCGGAACUCACCAGCUACUGCUCGCG(序列编号76)

MUD88：RNA Staple UAU外环30nt UCUAUCUCCUGCGGCACAAUCUGGAGCCCC(序列编号77)

MYD88：RNA Staple UAU外环26nt UAUCUCCUGCGGCACAAUCUGGAGCC(序列编号78)

将其克隆至pSuper neo.A(oligoengine)的Bgl II-Hind III位点之间(pSuperneo.A-Staple(Staple：TPM3_30nt，26nt和MYD88_30nt，26nt))。将HEK 293T细胞用培养基A(含有100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco's modifiedEagle medium)在37℃、CO

24小时后，使用转染(Transfection)试剂(FuGENE，Promega)，将pSuperneo.A-Staple(Staple：TPM3_30nt，26nt和MYD88_30nt，26nt)或milliQ(对照)导入HEK293T细胞并进行了孵育。48小时后，同样将pIRES-5'UTR-nLuc-renilla(5'UTR：TPM3或MYD88)导入HEK293T细胞并进行了孵育。

6小时后，用PBS清洗细胞，使用Passive Lysis Buffer回收了细胞溶解液。将此细胞溶解液在4℃、3000rpm下1分钟离心后，使用其上清液和Luciferase Assay kit(Promega)，POWERSCAN·H1 microplate reader(BioTek)对荧光素酶活性进行了评价。

结果：

对于利用Staple核酸的G-四链体结构的构建，使用周知的与G-四链体结构结合时发出荧光信号硫黄素T作为指示剂进行了评价(图3(a))

对于这些DNA序列加入了Staple核酸的结果，2+2 100nt型的DNA只在Staple核酸的存在下使硫黄素T的荧光信号增大。另一方面，在2+2 100nt mutA型中，无论有无Staple核酸，均未能确认显著的荧光信号增大。此结果显示了Staple核酸在2+2 100nt型上诱发了G-四链体结构。

G-四链体结构构建是钾离子依存性的

其结果，只有在含有KCl的Tris缓冲液中观察到了强荧光信号(图3(d))。这些结果显示了2+2 100nt型模型DNA通过Staple核酸被折叠，形成了G-四链体结构。

接下来，通过使用逆转录酶合成cDNA，对Staple核酸的RNA G-四链体结构形成能力进行了评价(停止试验)。在不存在Staple核酸条件下，从设计的模板RNA，通过逆转录反应能够得到全长cDNA。但是，加入Staple核酸时，RNA G-四链体结构就会被形成，逆转录酶的DNA延伸反应停止，合成非全长的cDNA。通过用测序对得到的cDNA样品进行解析，能够确认在RNA G-四链体结构形成部处逆转录反应的停止(图4(a))

在本实施例中，设计并利用了在100碱基的环序列的两末端处存在2个接近的鸟嘌呤连续序列的模型RNA序列(2+2 100nt RNA型)和4种的短链DNA(内环1、外环、二聚物、内环2)。当加入作为Staple核酸发挥功能的内环1、外环、二聚物这三种时，观察到显示RNA G-四链体结构构建的峰。另一方面，在被预测为不作为Staple核酸发挥功能的内环2中，RNA G-四链体结构未被构建，只得到了全长的cDNA(图4(b))。

此结果意味着，即使是以RNA为模板时，使用DNA折纸技术，RNA也能如同设计一般地折叠，诱发RNA G-四链体结构。另外，设计loop长为63nt、140nt的2种模型RNA序列(2+263nt RNA型、2+2 140nt RNA型)，使用内环1进行了同样的探讨，结果，对于任一种RNA，都确认到了显示RNAG-四链体构建的峰(图4(c))。

另外，在一个末端上鸟嘌呤重复序列重复1次，另一个末端上重复序列3次，如此鸟嘌呤连续序列的模式不同的模型RNA序列(1+3 100nt RNA型)中，也观察到了显示Staple核酸的导入引起的RNA G-四链体结构构建的峰(图4(d))。此结果显示了，多种类的RNA能够被Staple核酸折叠，而形成RNA G-四链体结构，显示了本发明的方法可以以任意的mRNA为目标而利用。从Staple核酸不只是DNA，在使用RNA时也显示了同样的效果来看(图4(e))，也能够使用具有互补链形成能力的人工修饰核酸。

如同所周知的，RNA G-四链体结构不只是逆转录反应，也抑制蛋白质翻译反应

其结果，内环1存在时，存在于下游的萤火虫荧光素酶蛋白质的表达量降低了。另一方面，从蛋白质表达量在内环2存在下不降低这点来看，显示出不仅staple核酸与目标mRNA结合发挥反义效果，通过构建RNA G-四链体而发挥基因表达抑制效果(图5(b))。

另外，对于停止试验中使用的2+2 63nt RNA型_萤火虫、2+2 140nt RNA型_萤火虫、1+3 63nt RNA型_萤火虫、1+3 100nt RNA型_萤火虫、1+3 140nt RNA型_萤火虫也进行了同样的探讨，结果只有在添加任何一种中均能够形成RNA G-四链体结构的内环1时，萤火虫荧光素酶的表达量减少(图5(c))。此结果显示了，利用Staple核酸的RNA G-四链体结构的人为诱发和诱发的RNA G-四链体结构引起的蛋白质翻译反应的抑制的一般性。

接下来，在作为天然基因序列的TPM3和MYD88中，对利用Staple核酸的RNA G-四链体结构形成和基因表达抑制效果进行了评价(图6(a))。首先，设计了能够在TPM3和MYD88的5'-UTR中诱发RNA G-四链体结构的Staple核酸。对于TPM3，连接鸟嘌呤连续序列的环碱基长度为103碱基，将Staple核酸作为内环1型进行了设计。对于MYD88，由于连接鸟嘌呤连续序列的环碱基长度为28碱基，较短，因此以外环型进行了设计。

以使用停止试验的评价，确认了在任意的5'UTR中，设计得到的Staple核酸均能够诱发RNA G-四链体结构(图6(b))。接下来，制作了将TPM3和MYD88的5'-UTR配置于萤火虫荧光素酶基因的模型mRNA，对Staple核酸的蛋白质翻译抑制能力进行了评价。

其结果，在使用了无细胞蛋白质翻译系统报导基因试验(reporter assay)中，由配置了任意的5'UTR的模型mRNA的蛋白质翻译在Staple核酸存在下均被抑制了大约60％(图6(c))。此结果强力地显示了，Staple核酸抑制天然的目标mRNA蛋白质表达。

最后，对哺乳动物细胞内的Staple核酸的蛋白质翻译抑制活性进行了评价。在进行细胞实验基础上，本发明的发明人准备了表达NanoLuc荧光素酶和海肾荧光素酶的基因。这二个基因通过一条mRNA导入，相对于NanoLuc荧光素酶从5'-cap开始翻译，Renilla荧光素酶从内部核糖体进入位点(Internal Ribosomal Entry Site(IRES))开始翻译。通过使用此系统，以Renilla荧光素酶基因的表达量对转染效率或mRNA的稳定性的影响进行规格化，能够定量地比较从5'-cap的翻译反应(图6(d))

在本实施例中，导入将TPM3以及MYD88的5'-UTR区域配置于NanoLuc荧光素酶的上游的报告基因，在HEK293细胞内对Staple核酸的效果进行了评价。在细胞实验中，利用短发夹表达载体(pSuper)表达的RNA Staple核酸，对Staple核酸对于蛋白质翻译反应的影响进行了评价。其结果，确认了导入Staple核酸引起的蛋白质翻译量减少，显示了在细胞内Staple核酸也能发挥功能(图6(e))。

目前，核酸医药开发明显正在停滞。其原因被认为在于细胞内导入非常困难以及无法回避脱靶效应等。关于细胞内导入的问题点，通过近年药物递送系统的研究开发的贡献得到了较大的改善，另一方面，脱靶效应的改善依然非常困难。此原因在于，无论是反义核酸或siRNA，均为了与目标mRNA结合而使用互补核酸。如果导入提高互补核酸的识别能力的修饰核酸，siRNA的RISC复合体形成能力就会降低，其效果大幅减少。如此，陷入了想要解决一个问题就会产生另一个新问题的困境。

在这样的背景下，本发明的发明人提出了至今为止没有的新的蛋白质翻译反应抑制系统。在此系统中，即使Staple核酸与非目标的位置结合，也会因为待靠近的鸟嘌呤重复序列不存在，而不发挥蛋白质抑制效果。另外，还确认了导入的Staple核酸并非只能是DNA，使用RNA也能得到同样的效果。此事实显示了Staple核酸的多样性。

通常，由于天然核酸序列被导入细胞内就会被分解，以核酸医药为目标，必须使用化学合成的修饰核酸。但是本发明的方法，从不需要形成siRNA这样的蛋白质复合体，只需集中于提高细胞内稳定性即可，从原理上而言，由修饰核酸引起蛋白质表达抑制效果减少的可能性极小。能够进行各种各样的修饰的本发明的方法对于核酸医药开发是极其有用的。

实施例2

材料及方法(Staple_TPM3_26nt_逆向连接)

(1)DNA寡核苷酸

DNA寡核苷酸是从Eurofins Genomics公司、Integrated DNA Technologies公司、Thermo Fisher Scientific公司购入的。所有的样品都经过OPC纯化或脱盐，用于RNA G-四链体的形成或存在位置的确认或体外蛋白质翻译反应抑制效果的评价。

(2)方法

使用了天然基因(TPM3、MYD88)的5'UTR序列的细胞内翻译(in celltranslation)(Staple_TPM3_26nt_逆向连接)

1.pIRES-TPM3_5'UTR_nLuc_海肾的制作

以nLuc载体(Takara Bio.)或psiCHECK-2载体(Takara Bio.)作为模板，使用以下的引物1的组或引物2的组，进行NanoLuc荧光素酶(NanoLuc luciferase(nLuc))和海肾荧光素酶(renilla luciferase(renilla))的PCR扩增，将得到的PCR产物分别克隆至pIRES载体(Takara Bio.)的EcoR I、Not I位点(pIRES-nLuc-renilla)。

(i)引物1

上游引物1：

上游引物[5'-CTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGTCTTCACACTCGAAG-3'](序列编号79)

下游引物1：

下游引物[5'-CTCGACGCGTGAATTTTACGCCAGAATGCGTTCG-3'](序列编号80)

(ii)引物2

上游引物2：

上游引物[5'-TCGACCCGGGCGGCCATGGCTTCCAAGGTGTACG-3'](序列编号81)

下游引物：

下游引物[5'-TAAAGGGAA GCGGCCTTACTGCTCGTTCTTCAGC-3'](序列编号82)

用于nLuc的PCR的上游引物被设计为克隆后nLuc的上游EcoR I位点会复活。所有的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳后，进行了切出纯化。

以人类基因组DNA(Novagen)作为模板，使用以下的引物进行了TPM3-5'UTR的PCR扩增。

上游引物[5'-GTCACATCC GGGCGGGTTGGTGAGT-3'](序列编号83)

下游引物[5'-GGTGCCCACCCAGCTACTGCTCGCG-3'](序列编号84)

以得到的PCR产物作为模板，使用以下的引物进一步进行PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pMD19载体(Takara Bio.)(pMD19-TPM3)。

上游引物[5'-TAATACGACTCACTATAGGTCACATCCGG GCGGGTTGGTGAGT-3'](序列编号85)

下游引物[5'-TCCAACTATGTATACCTGGGTGCCCACCCAGCTACTGCTCGCG-3'](序列编号86)

进一步，以pMD19-TPM3作为模板，使用以下的引物进行PCR扩增，将得到的PCR产物克隆至pIRES-nLuc-海肾的EcoR I位点(pIRES-TPM3_5'UTR-nLuc-海肾)。

上游引物：[5'-CTAGCCTCGAGAATTTCACATCCGGGCGGGTTG-3'](序列编号87))

下游引物：[5'-CCATGGTGGCGAATT GTTTTCCCAGTCACGACG-3'](序列编号88)

2.pSuper neo.A-Staple(Staple:TPM3_26nt_逆向连接)的制作

另外，使用以下的引物进行退火，制作了Staple插入(TPM3_26nt_逆向连接)。将其克隆至pSuper neo.A(oligoengine)的Bgl II-Hind III位点之间(pSuper neo.A-Staple(Staple：TPM3_26nt_逆向连接))。

上游引物[5'-GATCCCCGCTACTGCTCGCGCCGGAACTCACCAT TTTTA-3'](序列编号89)

下游引物[5'-AGCTTAAAAATGGTGAGTTCCGGCGCGAGCAGTAGCGGG-3'](序列编号90)

3.细胞内翻译

将HEK293T细胞，使用培养基A(包含100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco’s modified Eagle medium)，在37℃、CO

48小时后，同样地将pIRES-TPM3_5'UTR-nLuc-海肾导入HEK293T细胞并进行了孵育。6小时后，用PBS清洗细胞，使用裂解缓冲液(Passive Lysis Buffer)回收了细胞溶解液。将此细胞溶解液在4℃、3000rpm下1分钟离心后，使用其上清液和荧光素酶检测试剂盒(Luciferase Assay kit)(Promega)、POWE RSCAN H1 microplate reader(BioTek)对荧光素酶活性进行了评价。

结果如图7所示。在未将TPM3作为Staple核酸使用(结合)时，表达的抑制未被观察到(图7)。

参考文献

(1)Fire,A.；Xu,S.；Montgomery,M.K.；Kostas,S.A.；Driver,S.E.；Mello,C.C.Nature 1998,391,806.

(2)Ambros,V.Nature 2004,431,350.

(3)Jackson,A.L.；Linsley,P.S.Nature reviews.Drug discovery 2010,9,57.

(4)Jackson,A.L.；Burchard,J.；Leake,D.；Reynolds,A.；Schelter,J.；Guo,J.；Johnson,J.M.；Lim,L.；Karpilow,J.；Nichols,K.；Marshall,W.；Khvorova,A.；Linsley,P.S.Rna 2006,12,1197.

(5)Huppert,J.L.；Balasubramanian,S.Nucleic acids research 2007,35,406.

(6)Kumari,S.；Bugaut,A.；Huppert,J.L.；Balasubramanian,S.Nature chemicalbiology 2007,3,218.

(7)Katsuda,Y.；Sato,S.；Asano,L.；Morimura,Y.；Furuta,T.；Sugiyam a,H.；Hagihara,M.；Uesugi,M.Journal of the American Chemical Society 2016,138,9037.

(8)Rothemund,P.W.Nature 2006,440,297.

(9)Fujita,H.；Kataoka,Y.；Tobita,S.；Kuwahara,M.；Sugimoto,N.Ana lyticalchemistry 2016,88,7137.

(10)Bugaut,A.；Murat,P.；Balasubramanian,S.Journal of the AmericanChemical Society 2012,134,19953.

(11)Hagihara,M.；Yoneda,K.；Yabuuchi,H.；Okuno,Y.；Nakatani,K.Bioorganic&medicinal chemistry letters 2010,20,2350.

(12)Jang,S.K.；Davies,M.V.；Kaufman,R.J.；Wimmer,E.Journal of virology1989,63,1651.

序列表信息提示：

序列号1～68、71～74、79～90：合成DNA

序列号69、70、75～78：合成RNA