抑制ADAM 9生物活性的方法和组合物

摘要

提供在体外和/或体内调节ADAM9生物活性、抑制与受试者疾病或病症相关的ADAM9的生物活性、减少炎症、并抑制不期望的细胞增殖、纤维化和血管生成的ADAM9调节肽及其使用方法。在一些实施方案中，ADAM9调节肽包括人ADAM9前结构域氨基酸序列的一个或多个氨基酸的修饰，并且在一些实施方案中，ADAM9调节肽包括其他修饰，例如但不限于添加PEG基团。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年1月31日提交的美国临时申请序列No.62/624,491的权益，其全部公开内容通过引用合并于此。

技术领域

本公开的主题涉及与抑制ADAM9有关的组合物和方法。特别地，本公开的主题涉及ADAM9的修饰和纯化的前结构域、前结构域多肽的突变、以及稳定化前结构域以用于体外和体内使用的修饰。本公开的主题进一步涉及前结构域在细胞测定中的用途，并且涉及前结构域在治疗疾病例如癌症、纤维化和慢性阻塞性肺疾病中的用途。

背景技术

ADAM9是disintegrin和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员(Edwards等，2008)，其中包括诸如TACE(ADAM17)、ADAM8和ADAMIO之类的酶。对于人类而言，共有33位ADAM家庭成员。ADAM蛋白包含前结构域，该结构域对于酶在细胞中的正确折叠和运输非常重要；催化结构域，包含一个典型的HEXXH基序；整合蛋白结构域，用于与整联蛋白相互作用；富含半胱氨酸的区域(对底物识别很重要)，跨膜区域和参与信号传递事件的胞质尾巴。

已知ADAM家族的成员从细胞裂解I型和II型单跨膜蛋白以产生具有不同生理作用的可溶性成熟蛋白(Edwards等，2008)。例如，已知TACE产生可溶的表皮生长因子(EGF)配体，例如TGF-α、双调蛋白和HB-EGF(Sahin等，2004)。类似地，ADAMIO活性会生成可溶性蛋白，包括但不限于EGF配体、EGF、HB-EGF和β细胞蛋白(Sahin等人，2004年)，Notch、淀粉样蛋白前体蛋白、ephrins、cadherins、原钙粘蛋白、趋化因子如CXCL16和CX3CL1、HER2、AXL、cMET和CD23，以及IgE的低亲和力受体(Pruessmeyer&Ludwig，2009年综述)。由于可溶性表皮生长因子(EGF)配体和MT-MMP16的产生增加，过量的ADAM9活性可能促进肿瘤细胞测定中的细胞侵袭性和生长(Moss等，2011)。此外，ADAM9活性通过处理Tie-2和其他因子以及VEGFR2与新血管形成事件相关(Guaiquil et al.，2009；Maretzky et al.，2017)，并在伤口愈合(Mauch等，2010)、急性肺损伤(Roychaudhuri等，2014)和COPD(Wang等，2018)中起保护作用，因为ADAM9基因敲除小鼠的表现要好于野生型。此外，对ADAM9的抑制作用会增加ADAMIO活性，从而促进可溶性淀粉样前体蛋白α的形成，这与帮助患有阿尔茨海默氏病的人有关(Moss等，2011)。ADAM9的抑制作用还与BMP7的增加有关，而与纤维化有关的TGF-βRI和激活素RI的减少(见表1)也与MAC-1和淋巴动蛋白的减少(见表1)有关。这些发现表明，用ADAM9抑制剂治疗个体对某些纤维化和促炎性疾病将是有益的。

因此，特异性调节ADAM9活性的能力将有助于研究蛋白质的生物学功能，并用于治疗疾病，包括但不限于癌症、新血管疾病、阿尔茨海默氏病、伤口愈合、急性肺损伤和和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

不幸的是，现有的小分子抑制剂对ADAM9活性不是特异性的。例如，由GSK开发的异羟肟酸酯会抑制许多ADAM成员以及基质金属蛋白酶家族的其他成员(Ludwig等，2005)。Incyte公开的抑制剂还抑制MMP，并可能抑制其他ADAM家族成员(Zhou等，2006)。这种非特异性抑制作用通常会导致不良的副作用，在这种情况下，已阻止了这些化合物被开发为药物(Moss&Sklair-Tavron，2008)。

ADAM家族成员表示为酶原，其前结构域将酶保持在潜伏状态。例如，TACE的前结构域以Ktof 50nM抑制其催化结构域的活性，并在体内抑制TACE活性(Wong等，2016)。但是，TACE的野生型前结构域不具有良好的药代动力学特性。修饰上游弗林蛋白酶位点和半胱氨酸残基的突变前结构域稳定了TACE前结构域以供体内使用(Wong等人，2016)。同样，ADAMIO的野生型前结构域也没有良好的药代动力学特性，从而使其难以用作药物。药物动力学较差的原因可能是由于弗林蛋白酶转化酶在上游裂解位点(人ADAMIO的氨基酸48-51)加工所致。另外，位置173处的唯一半胱氨酸可能会干扰前结构域具有良好的药代动力学性质的能力，因为它可能会氧化形成前结构域的二聚体形式。ADAM9的前结构域具有几个meprinbeta位点。已证明ADAMIO是Meprinβ的底物(Jefferson等，2013)，抑制Meprinβ可能会产生不良副作用(Bergin等，2008；Deuss等2008；Banerjee等，2011；Vazeille等，2011；Schette等，2014)。

与ADAMIO和ADAM17不同，ADAM9的前结构域具有3个半胱氨酸和一个上游弗林蛋白酶位点。前结构域的这些特征使其在体外和体内使用中不稳定。

因此，本领域中需要ADAM9的选择性抑制剂来研究蛋白质的生物学功能并治疗疾病和病症，例如但不限于癌症、新血管疾病、伤口愈合、急性肺损伤和COPD。

发明内容

该概述列出了本公开的主题的几个实施例，并且在许多情况下列出了这些实施例的变化和置换。该概述仅仅是众多和变化的实施例的示例。提及给定实施例的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这样的实施例通常可以具有或不具有所提到的特征。同样，这些特征可以应用于本公开的主题的其他实施例，而不管是否在本概述中列出。为避免过多的重复，本摘要未列出此类功能的所有可能组合。

在一些实施方案中，本公开的主题涉及一种肽，包含、基本上由或由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成，其中相对于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，该肽在选自由氨基酸6、7、24、26、27、61、62、85、104、137、138、146、160、161、162、163和164组成的组的氨基酸位置处包含一个或多个氨基酸取代和/或修饰(例如，SEQ ID NO：2中存在的一种或多种半胱氨酸的巯基的化学修饰)，使得与没有一个或多个氨基酸取代和/或修饰的肽相比，该肽对meprin的抑制作用更小、对弗林蛋白酶切割的敏感性更低、对氧化和/或二硫键的敏感性更低、或其任何组合。在一些实施方案中，该肽包含、基本上由或由与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，肽的氨基酸序列包含一个或多个选自以下的氨基酸取代和/或修饰：精氨酸24替换为另一种氨基酸，可选地为丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或赖氨酸；精氨酸26替换为另一种氨基酸，可选地为丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或赖氨酸；精氨酸27替换为另一种氨基酸，可选地是丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或赖氨酸；半胱氨酸85替换为另一种氨基酸，可选地为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，半胱氨酸104替换为另一种氨基酸，可选地为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，半胱氨酸146替换为另一种氨基酸，可选地为丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，和半胱氨酸85、104和146中的一种、两种或全部三种或其任何组合的化学修饰。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，氨基酸序列具有：在氨基酸6和7之一或两者处的取代，其中每个取代独立地是在相应位置上除了SEQ ID NO：2中存在的氨基酸以外的任何氨基酸，可选地其中每个取代基独立地选自丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸，和/或在氨基酸24、26和27的一个、两个或全部三个处的取代，其中每个取代独立地是在相应位置上除了SEQ ID NO：2中存在的氨基酸以外的任何氨基酸，可选地其中每个取代基独立地选自丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸和赖氨酸，和/或在氨基酸61和62之一或两者处的取代，其中每个取代独立地是在相应位置上除了SEQ ID NO：2中存在的氨基酸以外的任何氨基酸，可选地其中每个取代基独立地选自天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸，和/或在氨基酸137和138之一或两者处的取代，其中每个取代独立地是在相应位置上除了SEQ ID NO：2中存在的氨基酸以外的任何氨基酸，可选地其中每个取代基独立地选自天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸，和/或在氨基酸160-164的一个、两个、三个、四个或全部五个处的取代，其中每个取代独立地是在相应位置上除了SEQ ID NO：2中存在的氨基酸以外的任何氨基酸，可选地其中每个取代基独立地选自丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸和天冬酰胺，和/或在氨基酸85、104和146的一个、两个或全部三个处的取代，其中每个取代基独立地是除半胱氨酸以外的任何氨基酸，可选地其中每个取代基独立地选自丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸、或上述的任何组合或亚组合。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，氨基酸具有：氨基酸85处的丝氨酸和氨基酸104处的丝氨酸；氨基酸26处的丙氨酸和氨基酸85、104和146处的丝氨酸；氨基酸24处的丙氨酸和氨基酸85、104和146处的丝氨酸；氨基酸27处的丙氨酸和氨基酸85、104和146处的丝氨酸；氨基酸85、104和146处的丝氨酸；氨基酸26处的丙氨酸；氨基酸85、104和146处的丝氨酸；和氨基酸62处的丙氨酸；氨基酸27处的甘氨酸和氨基酸85、104和146处的丝氨酸；氨基酸27处的丝氨酸和氨基酸85、104和146处的丝氨酸；氨基酸27处的丙氨酸；氨基酸85、104和146处的丝氨酸和SEQ ID NO：3的氨基酸1-6的缺失；氨基酸27处的丙氨酸和氨基酸85、104和146处的丝氨酸；和氨基酸138处的丝氨酸；氨基酸27处的丙氨酸，氨基酸85、104和146处的丝氨酸和氨基酸161和163处的天冬酰胺；氨基酸26处的丙氨酸，氨基酸85、104和146处的丝氨酸，和GSSGC(SEQ ID NO：27)五肽C端增加到SEQ ID NO：3的氨基酸174；氨基酸27处的丙氨酸和氨基酸85和104处的丝氨酸；氨基酸27处的丙氨酸，氨基酸85、104和146处的丝氨酸，和GSCGS(SEQ ID NO：26)五肽N端增加到SEQ ID NO：3的氨基酸1；和氨基酸27处的丙氨酸，氨基酸85、104和146处的丝氨酸GSSGC(SEQ ID NO：27)五肽C端增加到SEQ ID NO：3的氨基酸174。在一些实施方案中，半胱氨酸85、104和146中的一个、两个或全部三个在其巯基上进行化学修饰，可选地其中所述巯基通过添加马来酰亚胺酯、α-卤代羰基、硫代磺酸盐或其任意组合进行化学修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含、基本上由或由精氨酸24、26和/或27中的一个或多个取代为除精氨酸以外的氨基酸、半胱氨酸85、104和146中的一个或多个取代为除半胱氨酸以外的氨基酸、任选地丝氨酸、或其任何组合组成。

在一些实施方案中，本公开的主题的肽还包含添加到N端、C端或两者的聚乙二醇化半胱氨酸，可选地其中所述聚乙二醇化半胱氨酸中的一个或两个包含分子量为约1千道尔顿(kDa)至约40kDa的PEG基团。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含、基本上由或由精氨酸24，精氨酸26和精氨酸27中的至少一个取代为除精氨酸以外的氨基酸、以及半胱氨酸85、104和146取代为丝氨酸组成。在一些实施方案中，146位的氨基酸是半胱氨酸，并且进一步其中半胱氨酸146被聚乙二醇化，可选地其中半胱氨酸146包含分子量为约1kDa至约40kDa的PEG基团。在一些实施方案中，半胱氨酸85、104和146中的一个或多个包含使用马来酰亚胺酯进行的化学修饰。

在一些实施方案中，本公开的主题的肽还包含修饰精氨酸24、精氨酸26和/或精氨酸27以增加肽对弗林蛋白酶切割的抗性。在一些实施方案中，精氨酸24、精氨酸26和/或精氨酸27的修饰在每个氨基酸处独立地选自除半胱氨酸以外的任何氨基酸的取代和化学修饰，在一些实施方案中，化学修饰将半胱氨酸的巯基修饰为抗氧化性较弱的基团。在一些实施方案中，半胱氨酸85、104和146中的一个或多个包含由一种或多种半胱氨酸与二硫化物反应产生的化学修饰。

在一些实施方案中，本公开的主题的肽包含、基本上由或由与SEQ ID NO：3-23和28-430、947中的任何一个具有至少87％的同一性的氨基酸序列组成，可选地其中同一性百分比至少为93％，并且进一步可选地其中同一性百分比至少为95％。在一些实施方案中，该肽在其全长上包含、基本上由或由与SEQ ID NO：3-23和28-430、947中的任何一个具有100％的同一性的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本公开的主题的肽还包含一种或多种选自下列的另外修饰：保守氨基酸取代；非天然氨基酸取代；D-或D，L-外消旋混合物异构体形式氨基酸取代；氨基酸化学取代；羧基和/或氨基末端修饰；糖基化；和与生物相容性分子的缀合，所述生物相容性分子例如但不限于目标脂肪酸和多肽。

在一些实施方案中，本公开的主题的肽还包含半胱氨酸85、104和/或146中的至少一个的修饰，其中所述修饰包括马来酰亚胺酯衍生物的附接，所述马来酰亚胺酯衍生物包含至少一个选自以下的部分：PEG基团、荧光部分、烷基部分、比色部分、双功能部分、辐射部分、糖基部分、脂肪酸部分、毒素、治疗剂、任选地化学治疗剂、接头、肽或其任何组合。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及包含本文公开的肽的组合物。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于对受试者给药，或者是被配制用于对人给药的药物组合物。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及包含本文公开的肽的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含这样的肽，该肽与选自治疗部分、诊断部分、可检测部分或其任意组合的试剂缀合，可选地其中该肽通过接头分子或通过肽键与所述试剂缀合。在一些实施方案中，治疗性分子选自治疗性抗体、Fc片段、受体、毒素、化学治疗分子或其任何组合。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，包含、基本上由或由SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，该多肽不包含SEQID NO：2，意味着与SEQ ID NO：2相比，该氨基酸序列包含至少一个取代、化学修饰和任何组合。

在一些实施方案中，本公开的主题的多肽还包含标签，任选地为His标签，能够用于从表达系统中纯化和/或分离多肽。

在一些实施方案中，本公开的主题的多肽还包含在所述标签和所述多肽的氨基酸之间的蛋白酶的识别位点，能够用于通过蛋白水解切割从所述多肽释放标签。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，包含SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列，并且进一步包含向所述多肽的N-端添加一个或多个氨基酸、向所述多肽的C-端添加一个或多个氨基酸、或向所述多肽的N-端和C-端两者都添加一个或多个氨基酸，其中所述一个或多个氨基酸包含提供将目标部分缀合至所述多肽的功能的至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，添加到所述多肽的N端的一个或多个氨基酸包含、基本上由或由SEQ ID NO：26组成，和/或添加到所述多肽的C端的一个或多个氨基酸包含、基本上由或由SEQ ID NO：27组成。在一些实施方案中，多肽还包含与添加至所述多肽的N端和/或C端的一个或多个氨基酸中存在的半胱氨酸缀合的PEG基团，其中相对于缺少PEG基团的多肽，所述PEG基团增强所述多肽的适当折叠和/或稳定所述多肽以进行meprin裂解。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种体外调节ADAM9生物活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括使包含ADAM9蛋白的溶液或细胞与足以抑制ADAM9蛋白活性的本公开的肽或组合物接触。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种在受试者中抑制ADAM9生物活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括以足以接触所述受试者中存在的ADAM9多肽的量和途径，向所述受试者施用本公开的主题的组合物，从而调节所述受试者中ADAM9的生物活性。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种体内抑制ADAM9生物活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括以足以抑制ADAM9体内生物活性的量和途径向受试者施用多肽，所述多肽包含、基本上由或由SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，可选地其中所述多肽是聚乙二醇化的。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种在受试者中抑制与疾病或病症相关的ADAM9生物活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括使所述受试者中存在的ADAM9蛋白与有效量的本公开的主题的组合物接触，其中所述疾病或病症选自癌症、炎症、COPD、纤维化、阿尔茨海默氏病、伤口和不良的血管生成、或其中所述受试者具有此倾向。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括肺损伤，任选地是由于暴露于香烟烟雾而引起的肺损伤，并且有效量足以减少所述受试者的一个或两个肺中的弹性蛋白降解、炎症、基质金属蛋白生物活性或其任何组合。在一些实施方案中，所述疾病或病症包括肝损伤，任选地与肝纤维化相关的肝损伤，并且有效量足以降低所述受试者的肝脏中MMP9基因产物、ADAM8基因产物或其任何组合的生物活性。在一些实施方案中，所述疾病或病症至少部分是由于与ADAM9生物活性有关的细胞过度增殖所致。在一些实施方案中，所述受试者患有至少部分以不期望的高ADAM9生物活性或ADAM9蛋白表达为特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述受试者患有至少部分以ADAM 10活性降低为特征的疾病或病症。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种减轻炎症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本公开的主题的组合物。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种在受试者中抑制与不期望的ADAM9生物活性相关的细胞侵袭的方法。在一些实施方案中，该方法包括向所述受试者施用有效量的本公开的主题的组合物。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种在体内抑制ADAM9底物释放的方法。在一些实施方案中，该方法包括向有需要的受试者施用肽，该肽包含、基本上由或由SEQ IDNO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，可选地其中所述肽是聚乙二醇化的。

在本发明公开方法的一些实施方案中，本公开的主题的肽或组合物被配制用于通过选自下列的途径给药：吸入、口服给药、脂肪内给药、动脉内给药、关节内给药、颅内给药、皮内给药、病灶内给药、肌肉内给药、鼻内给药、眼内给药、心包内给药、腹膜内给药、胸膜内给药、前列腺内给药、直肠内给药、鞘内给药、气管内给药、肿瘤内给药、脐内给药、阴道内给药、静脉内给药、囊内给药、玻璃体内给药、结膜下给药、皮下给药、舌下给药、局部给药、经颊给药、口咽抽吸和经皮给药。在一些实施方案中，肽或组合物以下列形式递送：脂质组合物，任选脂质体或脂质体；霜剂；通过导管；通过灌洗；通过输注，可选地通过连续输注；通过吸入；通过注射；通过局部递送；通过局部灌注；通过直接清洗靶细胞；或其任何组合。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种将肽附接于抗体、抗体片段或其他蛋白的方法，该肽包含SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列，该方法包括任选地通过接头、进一步任选地通过肽接头使该肽与所述抗体、抗体片段或其他蛋白缀合。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及ADAM9生物活性的抗体、抗体片段、多肽、蛋白、特异性抗体、单克隆抗体、肽、抑制性核酸和/或小分子抑制剂在需要的受试者中预防与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病的至少一种症状的发展和/或降低其严重程度的用途，可选地其中所述与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病选自癌症、炎症、COPD、纤维化、阿尔茨海默氏病、伤口和不良的血管生成。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病选自COPD和纤维化，可选地其中所述纤维化是肝纤维化。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及肽，包含、基本上由或由SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，其中修饰其中存在的至少一个meprin切割位点以使该肽对meprin的抑制性降低，可选地其中所述至少一个meprin切割位点选自SEQ ID NO：3的氨基酸5-7、SEQ ID NO：3的氨基酸60-62、SEQ ID NO：3的氨基酸136-138和SEQ ID NO：3的氨基酸159-164，并且进一步其中所述至少一个meprin切割位点选自SEQ IDNO：3的氨基酸5-7、SEQ ID NO：3的氨基酸60-62、SEQ ID NO：3的氨基酸136-138和SEQ IDNO：3的氨基酸159-164，并且进一步其中修饰其中存在的至少一个meprin切割位点以包含选自以下的氨基酸序列：FXX、PXX、MXX、FXQ、FQX、PXD、PEX、MXD、MDX、KXEXEX、KDXEXE、KDXXXE、KXEXXE、KXXEXE、KDXXXX、KXEXXX、KXXEXX、KXXXEX、KXXXXE、KXXXXX或其任何组合，其中每个X独立地是任何氨基酸序列，并且进一步可选地其中每个X独立地选自天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，包含、基本上由或由SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，其中对应于选自半胱氨酸85、104和146或其任何组合的SEQ ID NO：3的氨基酸残基的半胱氨酸缀合到一个或多个这样的部分，相对于缺少该部分的多肽，该部分提高所述多肽的抑制力、溶解度和/或药代动力学特性；和/或缀合到一种或多种发色团、荧光团和/或放射性核苷酸。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种用于治疗患有与不期望的ADAM9生物活性相关的疾病的受试者的多肽，所述多肽包含、基本上由或由SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，可选地其中与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病选自癌症、炎症、COPD、纤维化、阿尔茨海默氏病、伤口和不良的血管生成，可选地其中所述多肽在SEQ ID NO：3-23和28-430、947的一个或多个氨基酸处聚乙二醇化。在一些实施方案中，所述多肽是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及ADAM9生物活性抑制剂在治疗患有与不期望的ADAM9生物活性相关的疾病的受试者中的用途。在一些实施方案中，ADAM9生物活性抑制剂选自抗体或其片段，可选地其中所述抗体是单克隆抗体、蛋白、肽、抑制性核酸和/或小分子，可选地其中与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病选自癌症、炎症、COPD、纤维化、阿尔茨海默氏病、伤口和不良的血管生成。在一些实施方案中，所述受试者是人。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及一种用于在需要的受试者中预防与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病的至少一种症状发展和/或减轻其严重程度的多肽，所述多肽包含、基本上由或由SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，可选地其中与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病选自癌症、炎症、COPD、纤维化、阿尔茨海默氏病、伤口和不良的血管生成，可选地其中所述受试者倾向于发展至少一种症状。在一些实施方案中，所述多肽是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，与不期望的ADAM9生物活性有关的疾病选自COPD和纤维化，可选地其中所述纤维化是肝纤维化。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，所述多肽包含、基本上由或由SEQID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，其中修饰存在于其中的至少一个弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样切割位点，以与未修饰的至少一个弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样切割位点相比，使至少一个弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样切割位点更耐弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样转化酶的切割。在一些实施方案中，至少一个弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样切割位点由四肽序列RXRR、RXKR、RXXR或RXRK组成，其中X为任何氨基酸。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，所述多肽包含、基本上由或由SEQID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO：2的一个或多个带电荷的氨基酸的取代，使得相对于这样的多肽，所述多肽在预定溶剂中的溶解度增加，所述多肽包含、基本上由或由SEQ ID NO：2组成，并且进一步其中预定溶剂选自生物流体和细胞培养基。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列，并且进一步包含含有一个或多个带电荷残基的C-端间隔基，该残基任选地选自Asp、Glu、Arg和Lys，其中相对于预定溶剂，具有C端间隔基的多肽的溶解度大于不具有C端间隔基的相同多肽的溶解度。

在一些实施方案中，本公开的主题还涉及多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：3-23和28-430、947中任何一个所示的氨基酸序列，并且进一步包含含有一个或多个带电荷残基的N-端间隔基，该残基任选地选自Asp、Glu、Arg和Lys，其中具有N端间隔基的多肽相对于预定溶剂的溶解度大于没有N端间隔基的相同多肽的溶解度。

在一些实施方案中，本公开的肽、多肽和/或本公开的主题的融合蛋白通过氨基酸取代、化学修饰或其组合进行修饰，使得与缺少修饰的肽、多肽和/或融合蛋白相比，肽、多肽和/或融合蛋白不易被meprin裂解。在一些实施方案中，所述修饰是SEQ ID NO：3的半胱氨酸85、104和/或146中的一个或多个的修饰，或在肽、多肽和/或融合蛋白中对应于SEQ IDNO：3的半胱氨酸85、104和/或146中的一个或多个的位置处的修饰。

在一些实施方案中，本公开的肽、多肽和/或本公开的主题的融合蛋白存在于组合物，任选地药物组合物中，其中所述组合物被配制用于向受试者施用，或者是配制用于向人施用的药物组合物。

上面已经陈述了本公开的主题的目的，特别是鉴于附图，通过阅读以下详细描述和实施例，其他目的和优点将变得显而易见。

附图说明

图1描绘了染色的凝胶，其显示了野生型ADAM9前结构域肽(SEQ ID NO：2)在-20℃下的存储作用，特别是对于二聚体和三聚体的形成。储存后，在2周后沉淀出SEQ ID NO：2。凝胶显示新鲜制备的SEQ ID NO：2(左图)和在-20℃保存两周后尿素增溶的沉淀物(右图)。

图2是在37℃在20mM Tris缓冲液pH 8中改变孵育时间后，新鲜重折叠并透析的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10(0.5Mg/ul)的SDS PAGE凝胶。通过运行SDS PAGE凝胶进行可视化，然后用SimplyBlue(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)染色。MWM表示预先染色的分子量标记。两种肽均含有游离巯基(SEQ ID NO：9具有C146S突变)，并且易于氧化，其中二聚体和三聚体的形成量随时间增加。

图3描绘了染色的凝胶，其显示了用ALEXA

图4描绘了染色的凝胶，其显示了在0、30和60分钟时用弗林蛋白酶切割各种修饰的ADAM9前结构域肽。SEQ ID NO：12是最稳定的突变体。另外，与非弗林蛋白酶突变体SEQID NO：13相比，其他弗林蛋白酶突变体对切割的抵抗力也较小。

图5描绘了染色的凝胶，其显示了在0和10分钟时用美普林对各种修饰的ADAM9前结构域肽的切割。最右边的泳道是分子量标记，其带的位置分别对应于15kDa、25kDa和35kDa标记。相对于所有所示的meprin突变体，没有meprin突变的SEQ ID NO：12不稳定。

图6描绘了染色的凝胶，其显示了在0、10和40分钟时用美普林切割各种修饰的ADAM9前结构域肽。相对于氨基酸62或138处的修饰，SEQ ID NO：19在氨基酸161和163处具有取代基是最稳定的。

图7描绘了染色的凝胶，其显示了在0分钟和10分钟时未聚乙二醇化或用美普林聚乙二醇化的各种修饰的ADAM9前结构域肽的裂解。SEQ ID NO：12代表非聚乙二醇化的肽，而SEQ ID NO：21-23之前的“p”表示这些肽已被聚乙二醇化，半胱氨酸146处为SEQ ID NO：21，N端处为SEQ ID NO：22，C端为SEQ ID NO：23。

图8描绘了染色的凝胶，其显示了野生型ADAM9前结构域肽在0、10、40和120分钟时被美普林裂解。前结构域单体和二聚体的位置被标记。最左边的泳道是分子量标记，其带的位置分别对应于15kDa、25kDa、30kDa和40kDa标记。凝胶显示野生型ADAM9前结构域肽被meprin裂解。

图9A和9B是柱状图，其显示了关于人ADAM9前结构域肽在体外抑制各种已知ADAM9底物(MMP9、FGF-4、1309、MCP-3、MCP-4和TGFa)脱落的能力的实验结果(图9A)，其通过荧光单位(FU)测量，并且关于抑制VEGFR2活性的能力(图9B)。在30nM和300nM处测试了弗林蛋白酶突变体SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13(无弗林蛋白酶突变)。另外，还以100nM测试了C-末端聚乙二醇化的SEQ ID NO：20。对于每个基板，图9A中有六(6)条，从左到右平均为3nM合并的SEQ ID NO：12和13(不表示抑制)，300nM弗林蛋白酶突变体SEQ ID NO：12，30nM弗林蛋白酶突变体SEQ ID NO：12，300nM SEQ ID NO：13(无弗林蛋白酶突变)，30nM SEQ ID NO：13(无弗林蛋白酶突变)和100nM C端聚乙二醇化的SEQ ID NO：20(弗林蛋白酶突变体比SEQID NO：12更易于裂解，但比SEQ ID NO：13更好)。在图9B中，显示了30nM和300nM弗林蛋白酶突变SEQ ID NO：12、30nM和300nM SEQ ID NO：13(无弗林蛋白酶突变)和100nM C端聚乙二醇化SEQ ID NO：20相对于媒介物对照(设定为100％)的VEGFR2信号抑制百分比。误差线是平均值的标准误差(S.E.M.)。SEQ ID NO：12比SEQ ID NO：13降低了大多数蛋白质水平，且具有更好的效能。聚乙二醇化的SEQ ID NO：20(使用体外酶法测定也具有最好的IC50)似乎是最有效的抑制剂。

图10是显示关于人ADAM9前结构域肽在急性吸烟(CS)模型中抑制弹性蛋白降解的能力的实验结果的柱状图，如通过ELISA测定的地塞明。误差线是平均值的标准误差(S.E.M.)。鼻内给予SEQ ID NO：10或赋形剂对照两周。弹性蛋白降解被SEQ ID NO：10施用完全阻断。

图11是将prodomain或运载体对照经腹膜内注射到小鼠中并如所述进行测量后72小时血清中prodomain水平的柱状图。数据代表2-3个血清的平均值。误差线指示每个样品的SEM，peg指示前结构域肽被聚乙二醇化。对美普林和弗林蛋白酶切割最稳定的N-末端聚乙二醇化的SEQ ID NO：22在72小时后具有最高的血清水平。其他的聚乙二醇化前结构域的血清水平低于非聚乙二醇化的SEQ ID NO：12，表明N-末端聚乙二醇化是最好的。SEQ IDNO：14对meprin更稳定，但弗林蛋白酶位点不完全抗裂解，其血清水平低于SEQ ID NO：12(无meprin突变)，表明除meprin稳定性外，弗林蛋白酶稳定性增强了药代动力学特性。

图12是一系列曲线图，显示了用弗林蛋白酶突变体SEQ ID NO：12治疗(治疗)或未治疗(车辆)的小鼠在急性肝损伤模型中各种肝酶功能标记物的水平。左上方的面板显示了天冬氨酸转氨酶(AST)的水平，右上方的面板显示了丙氨酸转氨酶(ALT)的水平，左下图显示胆红素水平，右下图显示肝脏重量，下部中间的条形图显示了肝脏的重量，右下方的条形图显示了通过确定胶原蛋白沉积量测得的肝纤维化评分。相对于赋形剂对照，通过SEQ IDNO：12处理，肝酶水平、胆红素水平、肝脏重量和纤维化得分均降低。误差线是平均值的标准误差(S.E.M.)。

图13是一系列图表，显示了来自上述图12所述急性肝损伤模型的小鼠肝匀浆中MMP9(左上图)、MMP13(右上图)和ADAM8(下图)的酶浓度。数据显示，SEQ ID NO：12处理降低了肝脏样品中MMP9和ADAM8的水平，而MMP13却增加了。误差线是平均值的标准误差(S.E.M.)。

紧凑光盘上提交的序列表的引用

与本公开内容相关的序列表已经以671MB文件的形式一式三份提交在三(3)张光盘(CRF复制，副本1和副本2)上，每个光盘的内容都是相同的。用不可磨灭的墨水标记以标识申请人，标题，文件名(FINAL_3217_4_PCT_ST25.txt)，创建日期(2019年1月31日)，计算机系统(ASCII DOS格式)，文件编号(3217/4 PCT)和相应的美国申请的序列号。在光盘上提交的序列表在此通过引用全文并入本文。

序列表的简要说明

SEQ ID NO：1是生物序列数据库的登录号NP_003807.1中列出的示例性人ADAM9基因产物的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是示例性人ADAM9前结构域肽的氨基酸序列。它对应于SEQ ID NO：1的氨基酸30-203。

SEQ ID NO：3是本公开主题的修饰的ADAM9前结构域肽的共有cote氨基酸序列。它基于SEQ ID NO：2，并且由于本公开主题的修饰的ADAM9前结构域肽在其核心内由“X”表示的位置与SEQ ID NO：2不同，因此与SEQ ID NO：2不同，其中X是其任何氨基酸或修饰。

SEQ ID NO：4是添加了N端半胱氨酸的SEQ ID NO：3。

SEQ ID NO：5是添加了C端半胱氨酸的SEQ ID NO：3。

SEQ ID NO：6是修饰的ADAM9前结构域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在弗林蛋白酶识别位点的24、26和27位氨基酸处被取代。

SEQ ID NO：7是修饰的ADAM9前结构域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在弗林蛋白酶识别位点的氨基酸24、26和27处被丝氨酸取代，并在半胱氨酸85和104处被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：8是修饰的ADAM9前结构域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在半胱氨酸85和104处被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：9是修饰的ADAM9前结构域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已经在氨基酸26的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸和半胱氨酸146的丝氨酸取代所取代。

SEQ ID NO：10(本文中也称为″Seq 11″)是修饰的ADAM9前结构域肽，其中SEQ IDNO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在弗林蛋白酶识别位点的氨基酸26处被丙氨酸取代，并且在半胱氨酸85、104和146处也被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：11(本文中也称为″Seq 17B″)是修饰的ADAM9前结构域肽，其中SEQ IDNO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在氨基酸24的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸和在半胱氨酸85、104和146的丝氨酸取代所取代。

SEQ ID NO：12(本文中也称为″Seq 25″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已经在氨基酸27的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸和在半胱氨酸85、104和146的丝氨酸取代所取代。

SEQ ID NO：13(本文中也称为″Seq 26″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在半胱氨酸85、104和146处被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：14(本文中也称为″Seq 27″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已经在氨基酸26的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸取代，在氨基酸62的第二甲氧普林识别位点被丙氨酸取代，并且在半胱氨酸85、104和146被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：15(本文中也称为″Seq 28″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在甘氨酸的氨基酸27位的弗林蛋白酶识别位点被甘氨酸取代，在半胱氨酸85、104和146处也被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：16(本文中也称为″Seq 29″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在氨基酸27的弗林蛋白酶识别位点被丝氨酸以及在半胱氨酸85、104和146处的丝氨酸取代所取代。

SEQ ID NO：17(本文中也称为″Seq 30″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽的氨基酸1-6已被缺失，弗林蛋白酶识别位点已在氨基酸27处被丙氨酸取代，半胱氨酸85、104和146已被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：18(本文中也称为″Seq 31″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在氨基酸27的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸取代，在氨基酸138的第三个meprin识别位点被丝氨酸取代，在半胱氨酸85、104和146处被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：19(本文中也称为″Seq 32″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ ID NO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在第27个氨基酸的弗林蛋白酶识别位点中用丙氨酸取代，在天青素取代第161位和第163位氨基酸的第4个meprin识别位点，在半胱氨酸85、104和146处用丝氨酸取代。

SEQ ID NO：20(本文中也称为″Seq 11C2″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ IDNO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在弗林蛋白酶识别位点的氨基酸26处被丙氨酸取代，在半胱氨酸85、104和146处被丝氨酸取代；并且在其C末端添加了五肽。

SEQ ID NO：21(本文中也称为″Seq 25-1″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ IDNO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在丙氨酸的半胱氨酸85和104的氨基酸27的弗林蛋白酶识别位点被丝氨酸取代。

SEQ ID NO：22(本文中也称为″Seq 25-2″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ IDNO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在氨基酸27的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸，在半胱氨酸85、104和146的丝氨酸取代；并且在其N端添加了五肽。

SEQ ID NO：23(本文中也称为″Seq 25-3″)是修饰的ADAM9前域肽，其中SEQ IDNO：2的野生型人ADAM9前结构域肽已在氨基酸27的弗林蛋白酶识别位点被丙氨酸，在半胱氨酸85、104和146的丝氨酸取代；并且在其C末端添加了五肽。

SEQ ID NO：24是由六(6)个His氨基酸组成的His标签肽的序列。SEQ ID NO：25是示例性的meprin识别序列，其对应于SEQ ID NO：2的ADAM9前结构域肽的第四种meprin识别序列。

SEQ ID NO：26是示例性五肽序列，其可以连接至本公开主题的修饰的

SEQ ID NO：27是示例性的五肽序列，其可以连接至本发明的修饰的ADAM9前结构域肽的C-末端，以提供缀合PEG基团的功能。

SEQ ID NO：28-430,947是本发明的示例性ADAM9前结构域肽的氨基酸序列。

具体实施方式

在一些实施方案中，本文公开的主题涉及修饰的ADAM9调节肽和相关组合物，其可用于研究ADAM9的生物学功能和/或用于治疗与不良ADAM9生物学活性有关的疾病和病症，例如但不限于癌症、炎症、COPD(以任何或所有表型为特征，例如小气道纤维化、粘液化生和肺气肿)、纤维化、阿尔茨海默氏病、伤口以及不良的血管生成和至少部分特征在于存在表1中所述的一种或多种炎症、细胞过度增殖、血管生成、纤维化以及可溶性蛋白质过多或减少的疾病和病症。

因此，在一些实施方案中，本公开的主题提供ADAM9活性的特异性抑制剂和用于使用其研究ADAM9的生物学功能和/或用于治疗与不良ADAM9生物活性有关的疾病和病症的方法。

现在将在下文中更全面地描述当前公开的主题，其中描述了当前公开的主题的一些但不是全部实施例。实际上，当前公开的主题可以以许多不同的形式来体现，并且不应该被解释为限于在此阐述的实施例；相反，提供这些实施例是为了使本公开满足适用的法律要求。

本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并不旨在限制当前公开的主题。

虽然相信以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是提出以下定义以促进对当前公开的主题的解释。

除非下文另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。对本文采用的技术的引用旨在指代本领域中通常理解的技术，包括对那些技术的变型或对本领域技术人员显而易见的等效技术的替代。虽然相信以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是提出以下定义以促进对当前公开的主题的解释。

在描述当前公开的主题时，将理解，公开了许多技术和步骤。这些中的每一个都有各自的益处，并且每个也可以与一个或多个或在某些情况下所有其他所公开的技术结合使用。

因此，为了清楚起见，该描述将避免以不必要的方式重复各个步骤的每种可能的组合。然而，应当在理解这样的组合完全在本发明和权利要求的范围之内的情况下阅读说明书和权利要求。

根据长期的专利法惯例，当在包括权利要求书的本申请中使用时，术语“一个”、“一种”和“该”指的是“一个或多个”。例如，短语“一种抗体”是指一种或多种抗体，包括多种相同的抗体。类似地，短语“至少一个”在本文中用于指代实体时，是指例如该实体中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100个或多个，包括但不限于1到100且大于100之间的整数值。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分数量，反应条件等的所有数字在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。如本文所用，术语“约”在涉及诸如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比之类的可测量值时，在一些实施例中意在涵盖包括±20％的变化，在一些实施例中意在涵盖包括±10％的变化，在一些实施例中意在涵盖包括±5％的变化，在一些实施例中意在涵盖包括±1％的变化，在一些实施例中意在涵盖包括±0.5％的变化，在一些实施例中意在涵盖包括±0.1％的变化，各种变型适合于执行所公开的方法。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是近似值，其可以根据当前公开的主题寻求获得的期望特性而变化。

如本文所用，术语“和/或”在实体列表的上下文中使用时，是指实体单独或组合存在。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”分别包括A、B、C和D，但也包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合。

与“包括”，“包含”或“特征在于”同义的术语“包括”是包括性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的要素和/或方法步骤。“包括”是本领域的术语，其意味着存在命名的元素和/或步骤，但是可以添和其他元素和/或步骤，并且仍然落在相关主题的范围内。

如本文所用，短语“由...组成”不包括未具体叙述的任何要素、步骤或成分。应注意的是，当短语“由...组成”出现在权利要求的主体的一条中，而不是紧接在前言之后，它仅限制该条款中阐述的元素；总体上，其他要素也不排除在权利要求范围内。

如本文中所使用的，短语“基本上由...组成”将相关公开或权利要求的范围限制为指定的材料和/或步骤，以及实质上不影响所公开和/或要求保护的(一个或多个)基本和新颖特征的那些。例如，药物组合物可以“基本上由药物活性剂或多种药物活性剂组成，这意味着所述的药物活性剂是药物组合物中存在的唯一药物活性剂。然而，应注意的是，载体、赋形剂和其他惰性剂可以并且可能存在于药物组合物中。

关于术语“包括”、“由......组成”和“基本上由......组成”，在此使用这三个术语之一的情况下，当前公开和要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任一个。例如，在一些实施方案中，当前公开的主题涉及包含抗体的组合物。在回顾本公开之后，本领域的普通技术人员将理解，因此，本公开的主题因此包括基本上由本公开的主题的抗体组成的组合物，以及由当前公开的主题的抗体组成的组合物。

如本文所用，短语“慢性阻塞性肺疾病(COPD)”是指慢性阻塞性肺疾病及其关键的COPD样表型，包括但不限于：肺气肿，小气道纤维化和粘液细胞化生(因为它发生在COPD患者的大气道中，并导致慢性支气管炎表型)。

如本文所用，术语“受试者”是指任何无脊椎动物或脊椎动物物种的成员。因此，术语“受试者”旨在涵盖动物界的任何成员，包括但不限于Chordata门(例如，类骨鱼类(bony鱼)，两栖动物(两栖动物)，Reptilia(爬行动物)，Aves(鸟类)和哺乳动物(哺乳动物))，以及其中包含的所有氏族和家族。

当前公开的主题的组合物和方法对于温血脊椎动物特别有用。因此，当前公开的主题涉及哺乳动物和鸟类。更特别地提供了衍生自和/或用于哺乳动物例如人类和其他灵长类动物(对人类具有重要经济意义(在人类饲养的农场饲养的动物)和/或对人类具有重要社会意义的动物(作为宠物或在动物园饲养的动物)，例如，人类以外的食肉动物(例如猫和狗)，猪(猪、猪和野猪)，反刍动物(例如牛、牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)，啮齿动物(例如老鼠、大鼠和兔子)，有袋动物和马)以及由于濒临灭绝而重要的哺乳动物(例如西伯利亚虎)的组合物和方法。还提供了所公开的方法和组合物在鸟类上的用途，包括在动物园中饲养的濒临灭绝的鸟类，以及家禽，更特别是家禽，例如家禽，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等，因为它们对人类也具有经济重要性。因此，还提供了所公开的方法和组合物在牲畜上的用途，包括但不限于驯养的猪(猪和猪)、反刍动物、马、家禽等。

类似地，本文公开的所有基因、基因名称和基因产物旨在对应于适用于本文公开的组合物和方法的任何物种的同源物。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应当理解，当公开了来自特定物种的基因或基因产物时，本公开仅意图是示例性的，并且不应解释为限制性的，除非其出现的上下文明确指出。因此，例如，对于本文提出的基因，公开的人氨基酸序列意图涵盖来自其他动物的同源基因和基因产物，所述其他动物包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类。还涵盖编码所公开的氨基酸序列的任何和所有核苷酸序列，包括但不限于在相应的

表2提供了本公开主题的示例性ADAM9核酸和多肽的基因序列数据库登录号。注意，表2中的条目仅是示例性的。

注意，表2中提供的

术语“癌症”和“肿瘤”在本文可互换使用，并且可以指对象的原发性和转移性实体瘤和任何组织的癌，包括但不限于乳房；结肠；直肠；肺；口咽；下咽；食管；胃；胰腺；肝；胆囊；胆管；小肠；尿路包括肾脏，膀胱和尿道上皮；女性生殖道，包括子宫颈，子宫，卵巢(例如绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)；男性生殖道，包括前列腺，精囊，睾丸和生殖细胞肿瘤；内分泌腺，包括甲状腺，肾上腺和垂体；皮肤(例如，血管瘤和黑色素瘤)，骨骼或软组织；血管(例如卡波西肉瘤)；大脑，神经，眼睛和脑膜(例如，星形细胞瘤，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，神经瘤，神经母细胞瘤，神经鞘瘤和脑膜瘤)。如本文所用，术语“癌”和“肿瘤”还意图指多细胞肿瘤以及单个赘生性或赘生性细胞。在一些实施方案中，癌症或肿瘤包括上皮组织的癌症或肿瘤，例如但不限于癌。在一些实施方案中，肿瘤是腺癌，在一些实施方案中是胰腺，乳腺，卵巢，结肠或直肠的腺癌，和/或从其衍生的转移性细胞。

如本文所用，术语“伤口”是指多种类型的伤口，包括但不限于擦伤，割伤，挫伤，烧伤，穿透性伤口，刺伤，皮肤割伤，手术伤口，褥疮(例如但不限于褥疮和褥疮)，糖尿病伤口和溃疡，纤维化伤口，枪伤(枪支伤痕)，热伤(灼伤，烧伤和冻伤)，化学伤，咬伤以及电伤。

在一些实施方案中，本文公开的主题提供了修饰的ADAM9前结构域肽，与未修饰的对应物相比，其具有所需的生物学活性。作为示例而非限制，在一些实施方案中，本公开主题的修饰的ADAM9前结构域肽可对弗林蛋白酶和弗林蛋白酶样蛋白的切割或多或少地敏感，在一些实施方案中对对meprin和Furin的切割或多或少敏感。在一些实施方案中，在一些实施方案中，蛋白类似物蛋白，并且在一些实施方案中或多或少地通过半胱氨酸交联形成它们自身或ADAM蛋白家族的其他成员(包括但不限于ADAM9)的二聚体和其他多聚体的可能性。

如本文所用，短语“修饰的ADAM9前结构域肽”、“修饰的ADAM9肽”、“ADAM9调节肽”等是指具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的一个或多个修饰的多肽和/或其他修饰，与没有修饰的ADAM9肽相比，可导致修饰的AD AM9肽具有某些所需的生物学或生化特性，包括但不限于其所基于的野生型ADAM9前结构域肽。作为示例而非限制，可以引入当前公开的主题的修饰的ADAM9肽中的修饰类型包括氨基酸取代、缺失、添加和其他类型的修饰，旨在改变修饰的ADAM9肽的一种或多种生物学或生化特性，例如但不限于在给定溶剂中的溶解度(包括但不限于生物液，例如血液，血清，脑脊髓液等)，相对于结合伴侣的解离常数，对酶的最大抑制浓度(IC50)的一半上限(例如但不限于ADAM9或整合素和金属蛋白酶的ADAM家族的另一个成员)，和/或改善感兴趣的各种药代动力学特性。

关于修饰范围包括在当前公开的主题内，可以利用ADAM家族的成员的至少三个生物学相关特征，例如ADAM9，其可用于产生当前公开主题的修饰的ADAM9肽。举例来说而非限制性地，ADAM9蛋白和从其衍生的前结构域肽的特征在于弗林蛋白酶和类弗林蛋白酶的内切蛋白酶的识别位点，美普林和类癌蛋白类似的金属肽酶的识别位点以及可通过形成二硫键形成同型和异型二聚体和更高阶多聚体的半胱氨酸残基。弗林蛋白酶和类似弗林蛋白酶的内切蛋白酶以及美普林和美普林类似的金属肽酶的切割以及二硫键的形成与Ihe ADAM家族成员的某些生物学活性有关，例如ADAM9，而负责这些活性的氨基酸序列可以为了调节ADAM家族成员如ADAM9的生物学活性而进行了修饰。

例如，由SEQ ID NO：2表示的野生型人ADAM9前结构域肽在SEQ ID NO：2的氨基酸24-27处具有弗林蛋白酶识别位点。如本文所公开的，SEQ ID NO：2的氨基酸24、26和/或27的修饰产生修饰的ADAM9肽，其对弗林蛋白酶和弗林蛋白酶样内切蛋白酶的切割具有或多或少的敏感性。类似地，由SEQ ID NO：2表示的野生型人ADAM9前结构域肽具有四个(4)meprin识别位点：SEQ ID NO：2的氨基酸5-7(在本文中称为“第一meprin位点”)；SEQ IDNO：2的氨基酸60-62(在本文中称为“第二美普林位点”)；SEQ ID NO：2的氨基酸136-138(在本文中称为“第三美普林位点”)；氨基酸159-164(在本文中称为“第四甲羟丙啶位点”)。如本文所公开的，SEQ ID NO：2的第一个meprin位点的氨基酸6和/或7和/或SEQ ID NO：2的第二个美普林位点的氨基酸61和/或62和/或SEQ ID NO：2的第三个meprin位点的氨基酸137和/或138和/或SEQ ID NO：2的第四个meprin位点的氨基酸160-164中的任何一个或其任何组合的修饰导致修饰的ADAM9肽对甲普蛋白和类似甲普蛋白的金属肽酶的抑制和/或切割具有或多或少的敏感性。同样类似地，涉及二硫键形成的SEQ ID NO：2的任何半胱氨酸的修饰，包括但不限于SEQ ID NO：2的半胱氨酸85、104和146，结果导致修饰的ADAM9肽具有或多或少的与ADAM9蛋白和/或其他ADAM家族成员蛋白形成二硫键的能力。如本领域普通技术人员还将理解的那样，弗林蛋白酶位点修饰、美普林位点修饰和/或半胱氨酸的组合可以产生根据需要具有多个新功能的修饰的ADAM9肽。

因此，在一些实施方案中，本公开的主题肽的ADAM9调节肽具有衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：2(即弗林蛋白酶识别序列)的氨基酸24、26和/或27中至少一个、SEQ ID NO：2的氨基酸6、7、61、62、137、138和160-164中的至少一个(即，meprin识别序列)、和/或SEQ ID NO：2的半胱氨酸85、104和146中的至少一个的一个氨基酸取代或其他修饰。应当理解的是，诸如但不限于氨基酸取代的修饰可以以任何组合在SEQ ID NO：2的氨基酸6、7、24、26、27、61、62、85、104、137、138、146和160-164中的任意一个或多个处发生，并且在这些氨基酸位置的任何组合或亚组合处的氨基酸取代的所有组合和亚组合均被本发明所涵盖。

更特别地，ADAM9前结构域的第一个甲胃泌素蛋白位点是SEQ ID NO：2的氨基酸5-7，其中氨基酸6和/或氨基酸7被取代。在一些实施方案中，氨基酸6和/或氨基酸7被任何氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸6和/或氨基酸7独立地被天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸取代。

替代地或另外地，可以将取代引入到ADAM9前结构域的第二美普林位点中，其是SEQ ID NO：2的氨基酸60-62，其中氨基酸61和/或氨基酸62被取代。在一些实施方案中，氨基酸61和/或氨基酸62被任何氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸61和/或氨基酸62独立地被天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸取代。

进一步可替代地或另外地，可以将取代引入到ADAM9前结构域的第三个meprin位点中，其是SEQ ID NO：2的氨基酸136-138，其中氨基酸137和/或氨基酸138被取代。在一些实施方案中，氨基酸137和/或氨基酸138被任何氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸137和/或氨基酸138独立地被天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸取代。

甚至进一步可替代地或另外地，可以将取代引入到ADAM9前结构域的第四个meprin位点中，所述第四个meprin位点是SEQ ID NO：2的氨基酸159-164(即SEQ ID NO：25)，其中一个、两个、三个、四个或全部五个氨基酸160-164被取代。在一些实施方案中，氨基酸160-164中的一个、两个、三个、四个或全部五个被任何氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸160-164中的一个、两个、三个、四个或全部五个独立地被天冬酰胺，丙氨酸，丝氨酸或甘氨酸取代。在一些实施方案中，氨基酸160-164中的至少三个被任何氨基酸取代，在一些实施方案中其可以独立地是天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。这样，在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的氨基酸159-164(即SEQ ID NO：25)被取代为KXEXEX、KDXEXX、KDXXXE、KXEXXE或KXXEXE，其中X在一些实施方案中为任何氨基酸，在一些实施方案中，每个X独立地选自天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。在一些实施方案中，氨基酸160-164中的至少四个被任何氨基酸取代，在一些实施方案中其可以独立地是天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。这样，在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的氨基酸159-164(即SEQ ID NO：25)被取代为KDXXXX、KXEXXX、KXXEXX、KXXXEX或KXXXXE，其中在一些实施方案中，X为任何氨基酸，并且在一些实施方案中，每个X独立地选自天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。在一些实施方案中，氨基酸160-164的所有五个被任何氨基酸取代，在一些实施方案中其可以独立地是天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。这样，在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的氨基酸159-164(即SEQ ID NO：25)被KXXXX取代，其中在一些实施方案中，X是任何氨基酸，在一些实施方案中，每个X独立地选自天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。

除了和/或替代本文上面描述的任何美普林修饰，在一些实施方案中，可以通过取代位置6上的氨基酸、位置7上的氨基酸或两者来修饰SEQ ID NO：2的氨基酸5-7处的甲羟戊酸识别位点。在一些实施方案中，位置6上的氨基酸、位置7上的氨基酸或两者的取代是任何氨基酸。在一些实施方案中，第6位的氨基酸、第7位的氨基酸或两者的取代独立地选自天冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸。

除了和/或替代本文上面描述的任何美普林和/或弗林蛋白酶修饰，可以修饰参与二硫键形成的一个或多个半胱氨酸。在一些实施方案中，这些半胱氨酸包括任何组合或亚组合的SEQ ID NO：2的半胱氨酸85、104和/或146。因此，在一些实施方案中，本发明的ADAM9前结构域肽包括半胱氨酸85的修饰、半胱氨酸104的修饰、半胱氨酸146的修饰、半胱氨酸85和104的修饰、半胱氨酸104和146的修饰、半胱氨酸85、104和146的全部或修饰。在一些实施方案中，这些半胱氨酸的修饰是任何氨基酸的取代，半胱氨酸85、104和146的每一个独立地被相同或不同的氨基酸取代。在一些实施方案中，半胱氨酸85、104和/或146独立地被丝氨酸取代。

除了在SEQ ID NO：3的6、7、24、26、27、61、62、85、104、137、138、146和160-164位上的修饰外，SEQ ID NO：3的氨基酸序列的其他修饰可以被引入。作为示例而非限制，可以将一个或多个氨基酸(在一些实施方案中，为1、2、3、4、5或更多个氨基酸)添加至SEQ ID NO：3的肽的N-末端和/或C-末端。作为另外的实例而非限制，可将单独或与其他氨基酸组合的半胱氨酸残基添加至N端和/或C端以提供已知为拥有半胱氨酸残基。例如，可将单独或与其他氨基酸组合的半胱氨酸残基添加至N端和/或C端，以提供聚乙二醇化ADAM9调节肽的位点。示例性的聚乙二醇化位点包括但不限于在N端和/或C端的单个半胱氨酸残基、SEQ ID NO：26的五肽和/或SEQ ID NO：27的五肽。

因此，在一些实施方式中，通过将肽序列添加至包括可连接PEG基团的半胱氨酸的N-和/或C-末端，可以将ADAM9调节肽缀合至约1-40kDa的PEG基团。当前公开的主题的ADAM9调节肽可包括在大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物系统等中成功表达ADAM9调节肽所必需的在N-和/或C-末端含有其他序列(例如氨基酸)的肽。另外，可以添加一种或多种标签，其有助于纯化本公开主题的ADAM9调节肽。标签可以包括但不限于His标签、C-myc标签、Flag标签、HA标签、链霉亲和素标签、二硫键和生物素标签。在一个或多个标签和前结构域肽之间的序列可以在一些实施方案中包含蛋白酶切割位点，例如对于肠激酶、凝血酶和/或Tev蛋白酶发现的那些。当前公开的主题的ADAM9调节肽可以包括稳定该肽以供体内使用的修饰。此类修饰是本领域技术人员通常已知的，并且包括但不限于脂肪酸修饰和聚乙二醇化、D氨基酸的掺入以及氨基酸的取代、缺失和/或添加。

可以对本公开主题的ADAM9调节肽的结构进行修饰和改变，并且仍然获得具有ADAM9调节特性的分子。例如，某些氨基酸可以在不明显损失肽活性的情况下取代序列中的其他氨基酸。因为多肽的相互作用能力和性质决定了多肽的生物学功能活性，所以可以在多肽序列(或者，当然是其基础的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列的取代，但是仍然可以获得具有ADAM9调节特性的多肽。

在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予多肽相互作用生物学功能中的重要性在本领域中通常被理解(Kyte&Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可以替代具有相似亲水指数或得分的其他氨基酸，并且仍然产生具有相似生物活性的多肽。根据其疏水性和电荷特性，已为每个氨基酸指定了亲水指数。这些索引是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(--3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

据信，氨基酸的相对亲水性决定了所得多肽的二级结构，其进而限定了该多肽与其他分子例如酶、底物、受体、抗体、抗原等的相互作用。在本领域中已知氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一氨基酸取代并且仍然获得功能上等效的多肽。在这种变化中，亲水指数在±2之内的氨基酸的取代是优选的，在±1之内的那些氨基酸是特别优选的，并且在±0.5之内的那些氨基酸甚至是更特别优选的。

也可以基于亲水性来取代相似的氨基酸，特别是在由此产生的生物学功能等效多肽或肽打算用于免疫学实施方案的情况下。美国专利号4,554,101(通过引用并入本文)指出，多肽的最大局部平均亲水性受其相邻氨基酸的亲水性控制，与其免疫原性和抗原性相关：即具有多肽的生物学特性。如美国专利号4,554,101中所述，以下亲水性值已分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以替代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，特别是免疫学上等同的多肽。在这种变化中，亲水性值在±2之内的氨基酸的取代是优选的，在±1之内的那些氨基酸是特别优选的，并且在±0.5之内的那些氨基酸甚至是更特别优选的。

如上所述，因此，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到上述各种特征的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸(参见表3)。因此，目前公开的主题考虑了如上所述的肽的功能或生物学等效物。

肽或多肽的生物学或功能等同物可以根据本领域众所周知的方法，使用位点特异性诱变来制备。因此，可以通过使用标准分子生物学技术将氨基酸残基添加至本公开主题的ADAM9调节肽或从其中删除，而无需改变肽的功能性。具体实例包括当前公开主题的人ADAM9前结构域肽。

在一些实施方案中，本公开主题的ADAM9前结构域肽由SEQ ID NO：3-23和28-430,947中任一氨基酸组成的、基本上由其组成或包含的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO：3-23和28-430，947中的任何一个具有至少87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的ADAM9前域肽。在一些实施方案中，ADAM9前结构域肽包含SEQ ID NO：3-23和28-430，947之一，或者是与SEQ ID NO：3-23和28-430，947之一具有至少87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的ADAM9调节肽，并且被聚乙二醇化。

鉴于以上内容，当前公开的主题的示例性修饰的ADAM9肽可以包含、基本上由和/或由SEQ ID NO：3-23和28-430，947中任何一个所示的氨基酸序列组成。SEQ ID NO：3是通用共有序列，其中位置6、7、24、26、27、61、62、85、104、137、138、146和160-164可以被任何氨基酸取代，如本文所述。本公开主题的其他非限制性示例性修饰的ADAM9肽可以包含、基本上由氨基酸序列组成或由其组成，所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO：3具有以下取代：

●SEQ ID NO：3的半胱氨酸85、104和146中的一个、两个或全部三个被丝氨酸取代，而精氨酸26被丙氨酸取代；

●SEQ ID NO：3的半胱氨酸146被丝氨酸取代，精氨酸26被丙氨酸取代，半胱氨酸85和104均被约1-40kDa的PEG基团取代，这在某些实施方案中改善修饰的ADAM9肽的体外和/或体内生物学和/或生化特性；

●半胱氨酸85、半胱氨酸104和半胱氨酸146均被丝氨酸取代，精氨酸24被丙氨酸取代；

●半胱氨酸85、半胱氨酸104和半胱氨酸146全部被丝氨酸取代，而精氨酸26被丙氨酸取代；

●半胱氨酸85、半胱氨酸104和半胱氨酸146均被丝氨酸取代，精氨酸27被丙氨酸取代；

●半胱氨酸85、半胱氨酸104和半胱氨酸146均被丝氨酸取代，一个或多个氨基酸24、26和/或27的精氨酸被丙氨酸或任何减少或消除弗林蛋白酶或PC转化酶裂解的氨基酸取代，任选地，在氨基酸174之后的C末端放置一个半胱氨酸；

●半胱氨酸85、半胱氨酸104和半胱氨酸146均被丝氨酸取代，一个或多个氨基酸24、26和/或27的精氨酸被丙氨酸或任何减少或消除弗林蛋白酶或PC转化酶裂解的氨基酸取代，任选地，在氨基酸1之前在N末端放置半胱氨酸；

●半胱氨酸85和半胱氨酸104被丝氨酸取代，一个或多个氨基酸24、26和/或27的精氨酸被丙氨酸取代，半胱氨酸146被约1-40kDa的PEG基团聚乙二醇化；

●半胱氨酸85、半胱氨酸104和半胱氨酸146均被丝氨酸取代；

●一个或多个氨基酸24、26和/或27的精氨酸被丙氨酸取代，以减少或消除弗林蛋白酶的裂解或PC转化酶，并且半胱氨酸85、104和146中的一个或多个被修饰为包括马来酰亚胺酯，例如但不限于小分子烷基酯或具有连接的官能团或比色、荧光或放射性标记基团的酯，其可使半胱氨酸具有抗氧化性。

在一些实施方案中，本公开的主题提供了包含ADAM9调节肽和生理上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含ADAM9调节肽，其由SEQ ID NO：3-23和28-430,947所示的氨基酸序列组成或基本上由其组成和/或包含其。

当前公开的主题的组合物通常以含有标准，众所周知的无毒的生理上可接受的载体，佐剂和媒介物的剂量单位制剂进行肠胃外给药，视需要而定。如本文所用，术语肠胃外包括静脉内、肌肉内、动脉内注射、腹膜内、局部或输注技术。

根据已知技术，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液和/或在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。

可以使用的示例性，非限制性可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，发现脂肪酸如油酸可用于注射剂的制备中。优选的载体包括用磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲的中性盐溶液。

当前公开的主题的ADAM9调节肽和包含或基本上由其组成的组合物可用于体外和体内调节ADAM9蛋白活性。在一些实施方案中，本公开的主题提供了一种在体外调节ADAM9活性的方法，该方法包括在足够的条件下和量下将ADAM9调节性结构域肽与包含ADAM9蛋白的溶液或细胞接触(在本文中称为“有效量”，或者在治疗或预防方法的情况下称为“治疗有效量”)，以调节ADAM9蛋白的活性。

在一些实施方案中，本公开的主题提供了一种在体内调节ADAM9活性的方法，该方法包括以治疗有效量并通过足以调节ADAM9活性的给药途径向受试者给药包含ADAM9调节前域肽的组合物(在一些实施方案中为药物组合物)。在一些实施方案中，所述受试者患有至少部分以过量的ADAM9生物活性(即，ADAM9生物活性的不良水平)的存在为特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病的特征在于炎症、过敏反应、哮喘、血管生成、传染病、癌症、其易感性和/或其症状或后果中的一种或多种。在一些实施方案中，所述疾病是癌症，并且其症状或后果包括纤维化。

因此，在一些实施方案中，该疾病或病症的特征在于阿尔茨海默氏病、癌症、炎症、COPD、新血管疾病或其易感性和/或其症状或后果中的一种或多种。

实施例

以下实施例提供了说明性实施方案。鉴于本公开和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员将理解，以下实施例仅是示例性的，并且在不背离当前公开的主题的范围的情况下，可以采用改变。

实施例1

通过将编码SEQ ID NO：2的核酸序列与His标签(SEQ ID NO：24)一起克隆到质粒表达载体中来制备ADAM9前结构域肽。通过转化BL21DE3细胞，然后在16℃下表达来制备一些前结构域肽。这在包涵体中产生了可溶性的前结构域肽和前结构域肽。其他通过在37℃下表达而制备，产生包涵体。通过将细菌在20mM Tris pH 8中溶解或不包含2-5mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP；Gold Biotechnology，Inc.，美国密苏里州圣路易斯)与1mg/ml溶菌酶(美利坚合众国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Corp.)、安息香酶，(Sigrma-Aldrich)蛋白酶抑制剂混合物的溶液中裂解细菌来纯化(Gold Biotechnology)和

如上所述，通过使细菌破裂来制备包涵体，然后将材料在3,000rpm下离心30分钟。然后将沉淀重悬于裂解缓冲液中，并在室温下摇动30分钟，然后再次旋转以沉淀包涵体。通过在含或不含2-4mM TCEP的8M尿素、20mM Tris pH 8中溶解，从包涵体中纯化原域，然后与Fisher Scientific(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的Ni-NTA珠一起摇动。用几种体积的8M尿素、20mM Tris(有或没有TCEP)洗涤珠子，然后用6M尿素和20mM Tris pH9(有或没有2-4mMTCEP和666mM咪唑pH 9)洗脱材料。从尿素中折叠原结构域，然后使用20mM Tris缓冲液pH 8透析除去残留的尿素和咪唑。透析后将原域浓缩，并在不同浓度下与人或小鼠ADAM9在20mMTris pH 8和

实施例2

为了确定特异性，将野生型人ADAM9或SEQ ID NO：10与ADAM9所述相同的底物缓冲液混合物(浓度大于2μM)与ADAM 10或ADAM 17(R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯)孵育。还使用15μMPEPDAB008、BioZyme Inc(美利坚合众国北卡罗莱纳州顶点)在20mMTris/150mM NaCl/10μMCaCl

实施例3

野生型前结构域肽(SEQ ID NO：2)具有三个半胱氨酸。根据Ellman试剂测试，所有这些半胱氨酸都是游离的，并且没有二硫键。在低温或更高温度下孵育时，或在-20℃下冷冻保存时，蛋白质巯基在氧化时会相互反应形成二硫键(见图1)。当去除还原剂后重新制备时，抑制ADAM9的IC50通常约为20nM。但是，在透析和1周后测定后，即使将其冷冻，也会发生二聚体形成，IC50增至120nM。最终在-20℃下储存1个月后，蛋白质进一步二聚化和三聚化，最终在融化时沉淀。同样，在37℃孵育0-25小时后，野生型前结构域(SEQ ID NO：2)和SEQID NO：9的二聚体和三聚体形成增加，后者在146位具有半胱氨酸到丝氨酸取代(见图2)，但仍在氨基酸85和104位保留半胱氨酸。

实施例4

在从Ni-NTA珠粒在8M尿素、20mM Tris和666mM咪唑(pH 9)中洗脱后，将SEQ IDNO：10稀释到20mM Tris pH9中，并在4℃放置过夜。然后将物质浓缩，并通过在20mM Tris，pH 8、40mM NaCl中平衡的

如实施例1所述，将其C末端具有半胱氨酸的SEQ ID NO：10的一种形式(SEQ IDNO：20)从包涵体中溶解并用Ni-NTA珠纯化，然后通过在尿素和磷酸盐缓冲液中平衡的ZEBA

实施例5

WT前结构域(SEQ ID NO：2)通过在尿素和磷酸盐缓冲液中平衡的ZEBA TM品牌脱盐旋转柱。在4℃下，使10ug的前结构域与2pg的可以与巯基特异性反应的ALEXA 647品牌的马来酰亚胺酯(Fluoroprobes，Scottsdale，Arizona，美国)反应。3.5小时后，将TCEP添加至20mM，并使反应在4℃下再静置1小时。然后将材料重新折叠并透析。

使用体外测定法确定抑制ADAM9的1C50(IC50125±68nM)。反应后，使用Ellman试剂评估游离巯基的含量。约1-3％的材料未反应。运行SDS凝胶以确认已发生标记。结果显示在图3中。没有检测到的起始物质，并且前结构域的分子量转移到约3kDa的更高分子，表明该蛋白质已正确标记。

实施例6

ADAM9的前结构域中有一个上游位点，并且被弗林蛋白酶切割。据推测，在该位点的修饰可以通过ADAM9的前结构域改善抑制脱落事件或药代动力学性质的IC50。在1.7m1Eppendorf管中，使约50μg的每个前结构域以约100ul的体积与弗林蛋白酶或美普林反应。对于弗林蛋白酶测定，缓冲液为20niM Tris pH 8/150mM NaCl/10mM CaCl

图4所示的弗林蛋白酶的结果，图5-7所示的梅普林的结果。结果表明该突变体对弗林蛋白酶的切割具有抗性。SEQ ID NO：12是最稳定的。SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：11仍被弗林蛋白酶切割，但程度比没有弗林蛋白酶突变的SEQ ID NO：13小得多。

业已表明，Meprin可以切割ADAM 10的前结构域，但未知是否Meprin也可以切割ADAM9的前结构域。测试了改善前结构域对防止美普林的抑制的选择性，同时还改善了对切割的稳定性。图8显示野生型前结构域(SEQ ID NO：2)被美普林切割。

SEQ ID NO：2中至少有四个可能的甲胃素蛋白位点。对每个位点进行了修饰。删除位点1，使得前结构域在SEQ ID NO：2中的氨基酸1-6之后开始(参见SEQ ID NO：17)。第二位点从PED(SEQ ID NO：2的氨基酸60-62)突变为PEA(参见SEQ ID NO：14)。将第三个位点(SEQID NO：2的氨基酸136-138)从MDD修饰为MDS(参见SEQ ID NO：18)，最终位点(aa 159-164)从KDEEEE(SEQ ID NO：25)修饰为KDNENE(参见SEQ ID NO：19)。基于SEQ ID NO：2的切割，假设最初的切割发生在位点4(氨基酸159-164)。meprin突变体比非meprin突变体更稳定(图5；将SEQ ID NO：12与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19进行比较)。此外，聚乙二醇化的非meprin突变体对meprin裂解的抵抗力更高，特别是聚乙二醇化的具有N-末端聚乙二醇化位点的SEQ ID NO：22(参见图7)。出乎意料的是，在N端的聚乙二醇化保护了prodomain免受C端裂解。相反，没有保护C末端的聚乙二醇化前结构域免受C末端的切割。从形成的切割产物，可以确定C末端是大概在KDEEEE(SEQ ID NO：25)基序上的初始切割位点。将该位点修饰为KDNENE，降低了切割速率(参见SEQ ID NO：19；图6)，并提高了对ADAM9的效力(参见表4)。

实施例7

根据制造商的说明书，使用胰蛋白酶激活人Meprin beta(R&D Systems，明尼苏达州，明尼苏达州)，然后用1mM 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF；Therrno FisherScientific)淬灭。前结构域在室温下以不同浓度与活化的Meprinβ和荧光底物PEPDAB022(美国北卡罗莱纳州Apex的BioZyme Inc)在15mM的20mM Tris pH 8、

实施例8

将BT474细胞(20,000)接种在具有生长培养基的96孔板中，并从3nM-2.5μM加入血清和前结构域或运载体对照。除去培养基，并与来自RayBiotech(Norcross，乔治亚，美国)的血管生成阵列一起孵育。通过扫描平板以检测荧光信号来定量蛋白质水平。图9显示了以30和300nM温育SEQ ID NO：12(弗林蛋白酶突变体)和SEQ ID NO：13(无弗林蛋白酶突变)的数据。另外，还以100nM测试了聚乙二醇化的SEQ ID NO：20。

结果显示，所有前结构域都是VEGFR2和TGFa脱落的有效抑制剂(VEGFR2和TGFa是ADAM9的已知底物)，弗林蛋白酶抗切割突变体的效力比非弗林蛋白酶突变体的效力高。另外，前结构域降低了培养基中其他蛋白质的水平，例如MMP9、FGF4、MCP-3、MCP-4和1309(请参见图9A)。

实施例9

将SEQ ID NO：10用于小鼠的药代动力学研究。简而言之，小鼠(3-6只/组)接受单次腹膜内(i.p.)或经皮剂量或媒介物对照。对于ip注射后，分别通过心脏穿刺从两组中采集血样，或在鼻内给药后治疗后收集支气管灌洗液。制备血清或支气管灌洗液，并储存在-80℃。定量测定通过前域处理增加或减少的血清或支气管灌洗液中的蛋白质。还使用生物测定法根据液体对ADAM9酶活性的抑制能力，间接测定了ADAM9前域肽的血清或支气管灌洗液浓度。将5-50ul的液体与45ul 30uM底物、含有蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、AEBSF，贝他汀和E-64(反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷；CAS号：66701-25-5；西格玛奥德里奇)的PEPDAB064(BioZyme Inc.)孵化；并掺入10μl不同浓度的ADAM9前结构域，并添加ADAM9开始反应。为了确定标准曲线，使用已知浓度的ADAM9血清前域来确定标准曲线。然后，取5-50ul样品，并加至55ul以上的底物溶液中，并用溶解有前结构域的缓冲液(20mMTris缓冲液pH 8、40mM NaCl和10％甘油)稀释至1∶6。确定抑制百分比，其取自注射了媒介物对照的对照组小鼠的相对液体。

当以6mg/kg施用时，在48小时后血清中的前结构域浓度为约9.4±1.9uM。为了确定SEQ ID NO：10在体内具有生物学作用，使用Raybiotech阵列(Norcross，佐治亚州，美国)，通过比较载体对照与治疗小鼠来评估血清中不同因子的水平。表6列出了通过SEQ IDNO：10施用上调或下调的一些因素。

实施例10

将聚乙二醇化的SEQ ID NO：21、22、23和非聚乙二醇化的SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：14与媒介物对照(20mM Tris pH8、40mM NaCl和10％甘油)一起腹膜内注射到2-3Balb/C小鼠中。72小时后，通过心脏穿刺收集血液并准备血清。通过首先制备标准曲线来测量前结构域水平，其中将不同量的每个前结构域在黑色His标签涂覆的板(Fisher Scientific)中孵育。

为了制备标准曲线，将含蛋白酶抑制剂混合物的75ul封闭缓冲液掺入对照小鼠血清(未处理)和前域。30分钟后，将溶液吸出，并先后用洗涤缓冲液和测定缓冲液(20mM TrispH 8，

为了从PK实验计算前结构域的水平，如上所述，将在72小时收集的血清添加到75ul的封闭缓冲液中，并孵育30分钟。洗涤后，加入含PEPDAB064和ADAM9的测定缓冲液，并再次定量抑制百分比。通过将抑制百分比与每个前域产生的标准曲线拟合来计算血清水平。

PK实验的结果显示在图10中，其中在72小时测量血清水平。聚乙二醇化的SEQ IDNO：22是最稳定的构建体，并且也是最不易被甲普林和弗林蛋白酶结合降解的构建体。其他聚乙二醇化的构建体(SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23)的血清水平比SEQ ID NO：12和聚乙二醇化的SEQ ID NO：22更差。聚乙二醇化的SEQ ID NO：22也比非聚乙二醇化等价物SEQ IDNO：12更稳定，其对美普林切割不稳定。注意，没有最稳定的弗林蛋白酶切割位点的SEQ IDNO：14，即使其具有更稳定的美普林位点也具有较差的PK值。

实施例11

将C57BL/6品系T小鼠(年龄8-12周)在Teague TE 10z密室(Teague Enterprises，Woodland，美国加利福尼亚州)。两周后，通过鼻内给药，隔天给予给予CS的小鼠30ul媒介物对照(20mM Tris pH 8、40mM NaCl和10％甘油)或SEQ ID NO：10(30μl，0.75mg/Kg)。再经过两周的CS暴露后，获得了支气管肺泡灌洗液(BAL)和弹性蛋白降解(desmosine的ELISA；美国德克萨斯州休斯顿的Cusabio Technology LLC)，以及促炎和消炎介质阵列(RayBiotech)。

表7列出了比较对照组和治疗组时，CS暴露小鼠的BAL降低的因素清单。增加的因素包括IL1-RA和IL-10，它们都是抗炎介质。在暴露于CS的小鼠中，以地高辛水平衡量的弹性蛋白降解非常高。BAL desmosine水平示于图11。施用SEQ YD NO：10完全防止了弹性蛋白的降解。在施用后30分钟，也使用如上文实施例8中所述的生物测定法测定SEQ ID NO：10水平。当以0.75mg/kg施用时，BAL水平为约10uM。

实施例12

根据体重将18只8周大的雄性BALB/c小鼠随机分为研究组。在所有小鼠中开始用CCU溶液治疗，并持续2周。治疗性治疗与CCU启动同时进行。如表8所述，为期两周的预防性给药研究，化合物给药和CC14溶液相隔至少4小时。

BIW：每两周一次；EOD：每隔一天

在研究结束时，将大约400ul全血收集到血清分离管中以进行ALT、AST、ALP和胆红素分析。终末抽血后，每只小鼠的肝脏被分离，称重并切成四部分，如下所示：左叶中央部分经福尔马林固定(FFPE)进行组织学分析；三(3)较小的独立切片，将剩余左叶之一，右叶两个(各为-50-100mg)速冻并保存在-0℃。

图11给出了研究结果。与对照组相比，肝脏重量减少，表明使用复方治疗具有有益效果。治疗组的AST和ALT水平以及胆红素水平也均降低。最后，肝纤维化评分也降低了。使用蛋白水解活性矩阵分析(PrAMA；Miller等人，2011)对具有五(5)种不同荧光底物的肝脏样品进行取样并制备裂解物，并对MMP和ADAM家族成员的酶水平进行定量。通过该分析，治疗组的MMP9和ADAM8水平降低，而MMP 13水平升高(见图13)。

实施例13

为了确定ADAM9前结构域是否具有体内抑制肿瘤生长的治疗潜力，在无胸腺小鼠中使用衍生的异种移植肿瘤模型进行了功效研究。简而言之，将1×10

在异种移植肿瘤模型中，ADAM9前结构域肽以合适的剂量与其他癌症药物联合使用。单独或与ADAM9前结构域肽组合施用癌症药物，并如上所述进行实验。

实施例14

发生脉络膜新生血管(CNV)是严重视力丧失的主要原因，主要发生在与年龄相关的黄斑变性患者中。CNV的鼠模型用于测试ADAM9前结构域肽抑制新血管形成的能力。通过用无菌水腹膜内注射0.3ml盐酸氯胺酮(1∶10稀释)腹腔注射麻醉十三只成年C57BIJ6J雄性小鼠(每组13只，两组)。将瞳孔用1％的托吡卡胺散瞳，并使用裂隙灯传输系统和盖玻片作为隐形眼镜，将三烧um激光光凝(50um光斑大小；0.0S秒持续时间；350至400mW)传输到每个视网膜。激光时产生气泡表明布鲁赫膜破裂。

研究中包括产生气泡的烧伤。在视网膜后极的9、12和3点钟位置进行烧伤，以便可以在验尸后识别每次烧伤，并就荧光素血管造影和组织病理学特征进行比较。在1-4周的腹腔中给予Prodomain肽或媒介物对照(20mM Tris pH8，10％甘油)，在此期间，在腹腔注射0.3ml 1％荧光素钠(美利坚合众国德克萨斯州沃思堡爱尔康)的腹腔后，用TRC-50FT相机(Topcon，Paramus，新泽西州，美国)拍摄连续眼底照片，对一些小鼠进行荧光素血管造影。激光治疗后的不同时间，处死小鼠，摘除眼球，在4℃或在仅含4％多聚甲醛的相同缓冲液中的0.1M椰油酸酯缓冲液(pH 7.4)中的2％多聚甲醛/2％戊二醛中固定并摘除眼睛。为了估算激光治疗后各个时间点的CNV发生率，在治疗期间随机选择烧伤。通过光学显微镜检查病变，并通过透射电子显微镜分析一些病变。

实施例15

将C57/B16(8-10周大；每组8只；2组)的小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪来麻醉一次。剃掉背部的头发，并用70％的乙醇擦拭皮肤。如前所述，通过切开皮肤和圆锥角膜，在每只动物的背部产生两个全层切除伤口(直径4毫米)。使伤口干燥以形成痂。通过IP注射或局部施用媒介物对照(20mM Tris pH 8，10％甘油)或prodomain，每1-3天一次，持续两周。在受伤后的不同时间点处死小鼠，并分离出包括上皮边缘在内的完整伤口。将伤口沿朝颅方向一分为二，并将组织包埋在O.C.T.中。化合物(Tissue Tek，Vogel，吉森，德国)，用于免疫组化。在伤口中央部分的连续切片上进行组织学分析。用苏木精和曙红(H&E；Shandon，法兰克福，德国)对伤口的冷冻切片(5um)染色，并用Leica显微镜(DMLB，Wetzlar，德国)进行测量。

实施例16

在3-7个月的过程中，每1-7天对八周大的PDAPP、APPrv7inn或Tg2576小鼠(每组10只，两组)进行鼻内或鼻内赋形剂对照或前域。解剖大脑并进行免疫组织化学和定量噬菌斑分析。简而言之，将一个半球固定在PBS中的4％多聚甲醛中24小时，并将前四分之一嵌入石蜡中。用检测Aβ40和42的抗体6F/3D鉴定淀粉样斑块。枕骨低聚甲醛固定的四分之一用于定量测定下丘脑中淀粉样蛋白斑的含量，方法是使用硫代黄素S染色的弧菌切开切片(40微米厚)。荧光图像是在装有3CCD数码相机(Sony DXC-9100P；索尼公司，科隆，德国)的倒置显微镜(Leica DMR；Leica Microsystems，德国本斯海姆)上获取的，并使用专用软件(LeicaQWin系统)进行分析。测量淀粉样蛋白沉积物的总表面积，并表示为下颌总表面的百分比。

对于电生理学，使用玻璃纤维刀从麻醉小鼠制备海马切片。然后将切片在浸没室中与温暖的含氧人工脑脊液一起孵育。然后使用双极钨微电极刺激沙弗侧支途径。小鼠也遭受莫里斯水迷宫。使用带有浸没平台的莫里斯水迷宫任务，每组有九只小鼠在玉米中训练。每天进行四次为期4天的试验，最大长度为90秒，试验间隔为90秒。

最初，允许小鼠在平台上停留30秒。在第五天，在没有平台的情况下进行了60秒的试用。测量到达假定平台位置的时间，并将其表示为延迟。此外，还计算了环的交叉数量。

参考文献

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