抗体药物偶联物和用于抗体的药物递送的应用

摘要

本发明的目的在于提供一种以新生血管为靶的新的药物递送方法。目的在于提供一种以通透性亢进的血管为靶的新的药物递送方法。此外，目的在于提供用于以恶性肿瘤为代表的各种疾病的处置或诊断的方法和检测试剂。给予抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与药物的偶联物，使其摄入到血管生成亢进或通透性亢进的血管的血管内皮细胞中，将该药物递送到细胞内。另外，提供用于使用上述偶联物来处置或诊断以恶性肿瘤为代表的各种疾病的方法和检测试剂。

说明书

技术领域

本发明涉及使用抗HMGB1抗体的抗体药物偶联物以及用于抗HMGB1抗体和其抗原结合性片段的药物递送的应用。

背景技术

近年来，为了癌、其它疾病的处置，开发了以病变细胞的特定分子为靶的抗体、抗体药物偶联物等分子靶向药。但是，例如，对于癌，已知有因癌细胞的变异而产生对抗体的耐性、抗性。另外，根据癌的种类而呈递的抗原的种类不同，因此特定抗体可应用的癌的种类受限。

因此，例如对于实体癌，开发出了不以肿瘤细胞本身为靶而以肿瘤组织内新生的血管为靶的抗体(VEGF抗体等)。另外，将解除对肿瘤的天然免疫应答的抑制的免疫检查点抑制剂(抗PD－1抗体、抗CTLA－4抗体等)开发成可广泛应用于各种肿瘤的药剂。但是，以新生血管为靶的抗体有时不仅抑制肿瘤血管的新生，而且抑制正常血管的新生。另外，已知免疫检查点抑制剂实际上也仅对一部分癌症起效。

因此，迫切期待用于通过新的机制来处置肿瘤的抗肿瘤药。

另一方面，作为与癌症同样地发生血管的动态变化的现象，血脑屏障(BBB)的破坏受到关注。由于脑梗塞、中风、脑外伤或脑内炎症，作为内源性损伤相关分子模式分子(DAMPs)的HMGB1(High Mobility Group Box 1，非专利文献1)被从神经细胞等的细胞核中释放到细胞外。而且，HMGB1成为诱因，导致脑内致炎性的细胞因子增加，并且提高血脑屏障中的脑血管的通透性。其结果，引起BBB破坏。因BBB破坏和炎症而引起脑水肿、低氧症，并且炎症促进HMGB1的进一步释放，因此给症状的恶化带来正反馈。此外，表明在癫痫中也有HMGB1、BBB破坏参与(非专利文献2、3)。

例如专利文献1中记载了使用抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段作为中和抗体来治疗或预防各种炎症性疾病。然而，上述技术使用抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段本身来治疗或预防各种炎症性疾病。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2014/115430号公报

非专利文献

非专利文献1：Annual Review of Immunology,2011,Vol.29,pp.139-162非专利文献2：日本药理学杂志，2018年，第151卷，4-8页

非专利文献3：Journal of Pharmacological Science,2019,Vol.140,pp.94-101

发明内容

本发明鉴于上述情况，目的在于提供一种以新生血管为靶的新的药物递送方法。

另外，本发明鉴于上述情况，目的在于提供一种以通透性亢进的血管为靶的新的药物递送方法。

此外，本发明的目的在于提供一种用于以恶性肿瘤代表的的各种疾病的处置或诊断的方法和检测试剂。

本发明人等进行了深入研究，结果发现抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与药物的偶联物能够被摄入到血管生成亢进的血管内皮细胞中，将该药物递送到细胞内。

此外，本发明人等发现抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与药物的偶联物被摄入到癫痫中的脑血管等通透性亢进的血管的内皮细胞中。

另外，本发明人等发现抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与药物的偶联物实际上不会被摄入到正常血管中。

本发明人等基于以上见解完成了本发明。

即，本发明提供以下的抗体药物偶联物。

[1]一种抗体药物偶联物，包含特异性地结合于HMGB1的抗体或其抗原结合性片段部分以及连接于上述抗体或其抗原结合性片段部分的药物部分。

[2]根据[1]所述的抗体药物偶联物，其中，上述药物部分与上述抗体或其抗原结合性片段部分由1种以上的连接子连接。

[3]根据[1]或[2]所述的抗体药物偶联物，其中，上述药物部分包含选自细胞毒剂、细胞保护剂、探针、抗血管生成剂、免疫抑制剂、降压药、升压药、疼痛缓解剂、细胞因子、抗生素和免疫检查点抑制剂中的1种或2种以上。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的抗体药物偶联物，由下述式(I)表示，

A－(L－(D)

(式中，A为特异性地结合于HMGB1的抗体或其抗原结合性片段，

L为连接子，

D为药物部分，

m为1～8的整数，

n为1～20的整数)。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，上述抗体或抗原结合性片段特异性地结合于人HMGB1，是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或者它们的片段。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，上述抗体为单克隆抗体。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，上述抗体或抗原结合性片段特异性地结合于包含序列号1或序列号2的氨基酸序列的人HMGB1的表位。

[8]根据[2]～[7]中任一项所述的抗体药物偶联物，其中，上述连接子选自切割性连接子、非切割性连接子、亲水性连接子、预先带电荷的连接子和基于二羧酸的连接子。

另外，本发明提供以下的医药组合物。

[9]一种医药组合物，含有[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物和药学上可接受的载体。

[10]根据[9]所述的医药组合物，用于血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病的处置。

[11]根据[9]或[10]所述的医药组合物，用于如下疾病的处置：

(a)良性或恶性肿瘤、渗出性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症、血管瘤、眼内新生血管疾病、增殖性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎、或牛皮癣；或者

(b)癫痫、中风、脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、慢性炎症、神经变性疾病、急性炎或败血症。

[12]根据[9]～[11]中任一项所述的医药组合物，进一步与选自其它抗体、其它抗体药物偶联物、细胞毒剂、细胞保护剂、探针、抗血管生成剂、免疫抑制剂、降压药、升压药、疼痛缓解剂、细胞因子、抗生素和免疫检查点抑制剂中的1种或2种以上并用。

此外，本发明提供以下的检测试剂。

[13]一种检测试剂，包含[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物。

[14]根据[13]所述的检测试剂，其中，上述药物部分至少包含探针。

此外，本发明提供以下的应用。

[15]一种用于向细胞递送药物的特异性地结合于HMGB1的抗体或其抗原结合性片段的应用。

[16]根据[15]所述的应用，其中，上述细胞为血管内皮细胞。

[17]根据[15]或[16]所述的应用，包含利用[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物进行处置。

此外，本发明提供用于以下的处置或诊断的方法。

[18]一种用于血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病的处置或诊断的方法，包含将[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物给予需要该抗体药物偶联物的对象。

[19]一种用于如下疾病的处置或诊断的方法，包括将含有[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物的医药组合物给予需要该医药组合物的对象，

(a)良性或恶性肿瘤、渗出性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症、血管瘤、眼内新生血管疾病、增殖性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎、或牛皮癣；或者

(b)癫痫、中风、脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、慢性炎症、神经变性疾病、急性炎或败血症。

[20]根据[18]或[19]所述的方法，进一步包括将选自其它抗体、其它抗体药物偶联物、细胞毒剂、细胞保护剂、探针、抗血管生成剂、免疫抑制剂、降压药、升压药、疼痛缓解剂、细胞因子、抗生素和免疫检查点抑制剂中的1种或2种以上给予上述对象。

[21]根据[18]～[20]中任一项所述的方法，进一步包括对上述对象照射质子束、重粒子束、γ射线、X射线或光。

此外，本发明包含以下的抗体药物偶联物。

[22]根据[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物，用于血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病的处置或诊断。

[23]根据[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物，用于如下疾病的处置或诊断：

(a)良性或恶性肿瘤、渗出性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症、血管瘤、眼内新生血管疾病、增殖性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎或牛皮癣；或者

(b)癫痫、中风、脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、慢性炎症、神经变性疾病、急性炎或败血症。

另外，本发明包含用于以下制造的应用。

[24]一种用于制造医药组合物的[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物的应用，该医药组合物用于血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病的处置或诊断。

[25]一种用于制造医药组合物的[1]～[8]中任一项所述的抗体药物偶联物的应用，

该医药组合物用于如下疾病的处置或诊断：

(a)良性或恶性肿瘤、渗出性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症、血管瘤、眼内新生血管疾病、增殖性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎或牛皮癣；或者

(b)癫痫、中风、脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、慢性炎症、神经变性疾病、急性炎或败血症。

根据本发明的构成，连接于抗体或其抗原结合性片段的药物被特异性地递送至血管生成亢进或血管通透性亢进的血管的内皮细胞。然后，所递送的药物作用于血管内皮细胞，能够有效地预防、改善或治疗血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病。另外，根据本发明，能够提供用于以恶性肿瘤为代表的各种疾病的处置或诊断的方法和检测试剂。

附图说明

图1A是表示实施例中使用的连接有阿霉素的抗体中的阿霉素和其连接子部分的化学结构式。阴影部相当于抗体的赖氨酸侧链的氨基部分。

图1B是表示实施例中使用的连接有美坦新(emtansine)的抗体中的美坦新部分的化学结构式。阴影部相当于抗体的赖氨酸侧链的氨基部分。

图2A是表示试验例1中与经荧光标记的抗HMGB1抗体(#10-22)或抗KLH抗体以各种时间孵育后的培养血管内皮细胞中的抗体的局部存在的照片。从左侧开始表示添加抗体起1、2、4小时后。荧光标记抗体(Alexa Fluor 488)用绿色表示，细胞核(DAPI)用蓝色表示，F－肌动蛋白用红色表示。

图2B－C是表示试验例1中与经荧光标记的抗HMGB1抗体(#10-22，#11-19)或经荧光标记的抗KLH抗体孵育4小时后的培养血管内皮细胞中的抗体的局部存在的照片。图2B表示二维局部存在，图2C表示三维局部存在。荧光标记抗体(Alexa Fluor 488)用绿色表示，细胞核(DAPI)用蓝色表示。

图3A－B是表示试验例2中与连接有阿霉素的抗HMGB1抗体(#10-22)或连接有阿霉素的抗KLH抗体孵育4小时后的培养血管内皮细胞中的抗体的局部存在的照片。

图4A－D是表示试验例3中对黑色素瘤荷瘤小鼠给予后的Alexa Fluor 488标记抗HMGB1抗体的分布的照片。图4A表示黑色素瘤组织血管中的分布，图4B表示肝脏中的分布，图4C表示肺中的分布，图4D表示脑中的分布。

图5A是表示试验例4的试验计划的概要的图。

图5B是表示试验例4中从药剂给予开始到11天后的各处置组(n＝4)的小鼠的肿瘤体积的变化的图表。各组间的检验使用没有对应的t检验。α-HMGB1Ab-Dox组与PBS组、α-KLHAb-Dox组和阿霉素组之间的两侧p值分别为0.047、0.047和0.021。

图5C是表示试验例4中从药剂给予开始到11天后的各处置组(n＝4)的小鼠的体重的变化的图表。各组间的检验使用学生t检验。α-HMGB1Ab-Dox组与PBS组、α-KLHAb-Dox组和阿霉素组之间的两侧p值均大于0.05。

图5D是试验例4中由药剂给予11天后的各组的小鼠得到的黑色素瘤组织切片的Ki67染色图像。

图5E是对试验例4中由药剂给予11天后的各组的小鼠得到的黑色素瘤组织切片的Ki67染色图像的Ki67阳性细胞数进行比较的图表。p值分别为++：p＝0.000029、##：p＝0.00428、*：p＝0.015。应予说明，检验使用学生t检验。

图5F是试验例4中由药剂给予11天后的各组的小鼠得到的黑色素瘤组织切片的发生了细胞凋亡的细胞的染色图像。发生了细胞凋亡的细胞(Tunel染色)用绿色表示，细胞核(DAPI)用蓝色表示。低倍率观察图像的＊表示血管内腔。

图5G是对试验例4中由Tunel染色图像得到的各组的黑色素瘤组织切片的发生了细胞凋亡的细胞的比例进行比较的图表。图表上的p值均是通过学生t检验得到的值。

图6是表示试验例5中对毛果芸香碱诱导癫痫持续状态(PILO－SE)模型小鼠给予的荧光标记抗HMGB1抗体蓄积于脑血管部的照片。荧光标记抗体(Alexa Fluor 488)用绿色表示，细胞核(DAPI)用蓝色表示。

图7是表示试验例6的试验计划的概要的图。

具体实施方式

[术语的说明]

本说明书中，与本发明相关联而使用的科学术语和专业术语以本领域技术人员通常可理解的含义使用。此外，根据上下文，只要没有特别说明，则单数术语包含复数，复数术语包含单数。一般而言，与本说明书中记载的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质化学、核酸化学以及杂交技术相关联而使用的命名法在该领域是公知的，且是通常使用的。

本说明书中，HMGB1表示上述的High Mobility Group Box 1(参照非专利文献1)。HMGB1是存在于几乎所有真核细胞中的非组蛋白染色体蛋白，是内源性损伤相关分子模式分子(DAMPs)之一。例如，人HMGB1的基因在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中为NCBI Gene ID:3146的基因。本说明书中，HMGB1蛋白质只要具有上述HMGB1的特征，则其同工型没有特别限定。

HMGB1蛋白质是由富含赖氨酸残基的215个氨基酸构成的25kDa的蛋白质，在哺乳动物间具有非常高度保守的氨基酸序列。其结构由被称为A－box(或box－A)和B－box(或box－B)的2个DNA结合结构域、以及仅由天冬氨酸和谷氨酸构成的C末端区域(也被称为C末端结构域或酸性尾部)这3个结构域构成。A－box和B－box分别由高度保存的约80个氨基酸残基构成，强带正电。B－box中存在TLR4(toll-like receptor 4)结合结构域和RAGE(receptor for advanced glycation end products)结合结构域。已知C末端区域的氨基酸序列在哺乳动物间仅有2～3处差异，高度保守。

HMGB1蛋白质不仅局部存在于细胞核内，而且随着巨噬细胞、各种免疫系统细胞的活化而从细胞核转移到细胞质并向细胞外分泌(主动分泌)。另外，如上所述，明确了随着由缺血、损伤所致的细胞坏死或细胞凋亡而局部存在于细胞核中的HMGB1被迅速释放(被动释放)。然后，释放出的HMGB1介由TLR4、RAGE等而作为强大的炎症介体发挥作用，引起炎症性免疫应答。

本说明书中，“抗体”是指能够与抗原非共价结合且特异性地结合于抗原的免疫球蛋白家族的多肽。

天然的免疫球蛋白分子中，IgG由4条多肽链、即2条重链和2条轻链且利用二硫键相互结合的多肽链构成。各重链由重链可变区(有时称为“VH”)和重链恒定区(重链恒定区由3个结构域构成，分别称为“CH1”、“CH2”、“CH3”)构成。各轻链由轻链可变区(有时称为“VL”)和轻链恒定区(有时称为“CL”)构成。

另一方面，VH和VL在参与抗体的结合特异性的方面很重要。抗体主要通过VH和VL的氨基酸残基与靶抗原相互作用，因此可变区内的氨基酸序列与位于可变区外的序列相比各个抗体间的差异大。此外，VH和VL中还可以进一步细分为各种抗体间保持更恒定的被称为框架区(FR：framework region)的区域和被称为互补决定区(CDR：complementaritydetermining region)的高变区。VH和VL分别由3个CDR和4个FR构成，它们按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序从氨基末端排列到羧基末端。

本说明书中，“抗HMGB1抗体”是指特异性地结合于HMGB1的抗体。

本说明书中，“互补决定区”或“CDR”是指参与抗原特异性的VL和VH的高变区。本说明书中，有时将作为重链可变区的CDR的重链CDR1～3表示为CDRH1～3。另外，本说明书中有时将作为轻链可变区的CDR的轻链CDR1～3表示为CDRL1～3。

本说明书中，CDR和框架区的位置根据Kabat的定义来确定。即，基于Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242来规定。

本说明书中，“抗原结合性片段”是指保持与抗原的表位特异性相互作用的能力，且具有原始抗体的抗原特异性相互作用的功能的抗体片段。

作为抗体片段，没有特别限定，例如可举出由Fab片段、F(ab’)

本说明书中，“表位”是指抗体或抗原结合性片段特异性地结合的抗原上的部位。

本说明书中，“人抗体”是指FR和CDR这两者具有来自人免疫球蛋白的可变区和可变区的抗体。

本说明书中，“嵌合抗体”是指例如将来自非人动物抗体的可变区与人抗体的恒定区组合而成的抗体等。

本说明书中，“人源化抗体”是指例如将来自非人动物抗体的可变区中的CDR移植到人抗体所得的抗体、将来自非人动物抗体的CDR和FR的一部分移植到人抗体所得的抗体等。

人抗体或人源化抗体的FR可以包含例如由于体内或体外导入的随机变异、位点特异性突变等而未被人的免疫球蛋白基因编码的氨基酸残基。

本说明书中，“抗体药物偶联物”或“偶联物”是指将抗体或其抗原结合性片段和与它们不同的细胞毒剂、细胞保护剂、作为探针等的药物连接而得的物质。

本说明书中，“连接(conjugation)”可以包含共价键、非共价键(没有特别限定，例如为配位键、疏水键、氢键、静电结合等)或它们两者。

另外，“连接的(conjugated)”不限于抗体或其抗原结合性片段与其它药物从原本分离的状态变为连接状态的情况。即，“抗体药物偶联物”还包含例如连接子和药物部分的全部或一部分为多肽且将抗体或抗原结合性片段部分中的至少1个多肽与连接子和药物部分中的多肽部分融合为1个多肽而制造的情况。

本说明书中，“细胞毒剂”是指对细胞的生长和增殖有害并以减少、细胞、抑制细胞增殖或破坏细胞的方式发挥作用的药物。

本说明书中，“细胞保护剂”是指对细胞的生长和增殖有益并以增加细胞、抑制细胞死亡、修复细胞结构或改善细胞功能的方式发挥作用的药物。

本说明书中，“探针”是指将器官、组织或细胞或者其一部分的形态或状态可视化的物质。探针优选实质上不具有作为细胞毒剂的功能，更优选实质上不具有细胞毒剂和细胞保护剂的功能。

本说明书中，“连接子”是能够将抗体或抗体片段(例如，抗原结合性片段)连接于药物部分等的其它部分的任意的化学部分。

本说明书中，“对象”是指个体(人、非人动物等)、器官、组织或细胞。个体为人时，只要没有特别说明，“患者”可与“对象”互换使用。

本说明书中，“处置(treatment)”或“进行处置(treat)”除“治疗(medicaltreatment)”、“预防(prevention)”以外，还包含对器官、组织或细胞等非个体的药物暴露。“治疗”表示使疾病、症状或健康状态治愈、好转或缓和，或者使疾病、症状或健康状态的恶化减少、防止或延迟，或者使疾病或症状的进展反转、减少、防止或延迟。

本说明书中，“预防”表示防止疾病或症状的发病，或者降低疾病或症状的发病的风险。

[用于抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段的药物递送的应用]

本发明的应用涉及用于向细胞的药物递送的特异性地结合于HMGB1的抗体(抗HMGB1抗体)或其抗原结合性片段的应用。特异性地结合于HMGB1的抗体或其抗原结合性片段可以使用与后述的[抗体药物偶联物]的项中记载的抗体或其抗原结合性片段相同的抗体或其抗原结合性片段。

一个方式中，作为本发明的应用对象的细胞是指生物体内或从生物体分离的器官、组织等中含有的细胞、或者经分离、培养或分化诱导的细胞。

一个方式中，本发明的应用中，药物被递送到血管内皮细胞中，优选被特异性地递送到血管生成亢进或血管通透性亢进的血管的内皮细胞中。

一个方式中，上述药物被连接于抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段，以抗体药物偶联物的状态被摄入到上述细胞中。该抗体药物偶联物可以使用后述的[抗体药物偶联物]的项中记载的抗体药物偶联物。

机制尚不明确，连接有药物的抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段特异性地蓄积于血管生成亢进或血管通透性亢进的血管的内皮细胞而摄入到细胞内，实质上不会蓄积于正常血管的内皮细胞。从这样的特性出发，根据本发明，例如，可带来以下的效果或用途。

(1)能够高效地将药物递送到包含血管生成亢进或血管通透性亢进的血管的组织(例如，肿瘤等)，消除或减少由药物所致的全身性副作用。

(2)一个方式中，能够应用于预期血管生成亢进或血管通透性亢进的疾病。

(3)另一个方式中，通过在药物中使用细胞毒剂，能够损伤例如如肿瘤等这样对生物体不利的病变部的血管，抑制向病变部供给营养和氧。

(4)另外，另一个方式中，通过在药物中使用细胞保护剂，能够在例如血管通透性异常亢进的血脑屏障中改善该状态，进行与血管通透性相关的疾病的处置。

(5)一个方式中，能够用于得到个体、器官、组织或细胞的形态或者状态的信息。例如，通过使用作为药物的探针，能够得到血管生成亢进或血管通透性亢进的血管、其细胞的形态、状态的信息。

[抗体药物偶联物]

本发明的抗体药物偶联物包含特异性地结合于HMGB1的抗体(抗HMGB1抗体)或其抗原结合性片段以及连接于上述抗体或其抗原结合性片段部分的1个或多个药物部分。

在本发明的抗体药物偶联物连接有多种药物时，可以将各药物与抗体直接连接。或者，本发明的抗体药物偶联物中可以将1种以上的药物介由其它药物间接地连接于抗体或其抗原结合性片段。

一个方式中，本发明的抗体药物偶联物包含1种以上的连接子，通过共价键和/或非共价键将抗体或其抗原结合性片段部分与药物部分连接。

一个方式中，本发明的抗体药物偶联物由下述式(I)表示。

A－(L－(D)

(式中，A为特异性地结合于HMGB1的抗体或其抗原结合性片段，

L为连接子，D为药物部分，m例如为1～8的整数；n为1～20的整数)

更优选在上述式(I)的抗体药物偶联物中m例如为1以上的整数、优选1、2、3或4的整数；n例如为1以上的整数、优选为1～10、2～8或2～5的整数。

表示本发明的抗体药物偶联物的每1分子抗体的平均药物分子数的药物/抗体比(DAR)没有特别限定，可以根据所使用的药物的种类、应用对象等而适当地选择。从提高抗肿瘤活性的观点考虑，本发明的抗体药物偶联物的DAR例如为1以上或2以上，优选为3以上，更优选为4以上，进一步优选为5以上，进一步更优选为6以上。另外，从抑制副作用的观点考虑，本发明的抗体药物偶联物的每1分子抗体的DAR例如可以为15以下、12以下、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下或1以下。

(抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段部分)

抗HMGB1抗体可以为单克隆抗体和多克隆抗体中的任一种，但从医药的品质均匀性的观点考虑，优选为单克隆抗体。作为单克隆抗体，可举出来自非人动物的抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等，优选为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，更优选为人抗体或人源化抗体。

抗HMGB1抗体只要具有与作为其抗原的HMGB1的结合活性，则也可以在与其它抗HMGB1抗体或与HMGB1以外的抗原结合的其它抗体之间更换了抗体的重链和/或轻链的全长或一部分、恒定区部分的全部或一部分、CDR的全部或一部分所得的抗体。

作为抗HMGB1抗体识别的抗原的HMGB1例如可以为来自人或来自人以外的哺乳动物的HMGB1，优选为来自与抗体药物偶联物的对象相同的生物的HMGB1。

单克隆抗体的同型例如可举出IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等)、IgM、IgA(IgA1、IgA2等)、IgD、IgE等，优选为IgG或IgM，更优选为IgG2。

本发明的抗体药物偶联物中使用的抗HMGB1抗体的表位例如可以为HMGB1的C末端区域或B－Box区域的多肽。

例如该抗人HMGB1抗体的表位优选包含作为C末端区域的表位的EEEDDDDE(序列号1)或作为B－Box区域的表位的LKEKYEKDIA(序列号2)的氨基酸序列。

抗HMGB1抗体的对HMGB1表位的亲和性例如可通过由使用表面等离振子共振法的测定得到的解离常数Kd来进行评价。Kd优选为1×10

作为对人HMGB1具有特异性的单克隆抗体，例如可举出WO2014/115430中公开的识别序列号1表示的表位的#10-22人源化抗体或识别序列号2的氨基酸序列表示的表位的#11-19人源化抗体。

该对人HMGB1具有特异性的单克隆抗体不仅限定于识别上述序列号1或序列号2的氨基酸序列表示的表位的抗体的CDR序列的组合。例如，可以为这些抗体的CDRH1～3和CDRL1～3的合计6个CDR序列中具有例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基的缺失、置换、插入、添加或它们中的任2个以上的组合的变异的氨基酸序列。

另外，该对人HMGB1具有特异性的单克隆抗体不仅限定于识别上述序列号1或序列号2的氨基酸序列表示的表位的人源化抗体的重链可变区或轻链可变区的组合。例如，可以为这些人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列中具有例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基的缺失、置换、插入、添加或它们中的任2个以上的组合的变异的氨基酸序列。

或者，对于该对人HMGB1具有特异性的单克隆抗体，该抗体的重链可变区和轻链可变区与识别上述序列号1或序列号2的氨基酸序列表示的表位的人源化抗体的重链可变区和轻链可变区之间的同源性分别为90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上，进一步优选为99％以上。

或者，对于该对人HMGB1具有特异性的单克隆抗体，该抗体的FR整体与识别上述序列号1或序列号2的氨基酸序列表示的表位的人源化抗体的FR整体之间的同源性为90％以上，优选为95％以上，更优选为98％以上，进一步优选为99％以上。

本说明书中，氨基酸序列的同源性由以NCBI BLAST的blastp suite的默认设定进行比对而得到的identity的数值表示。

本发明的抗体药物偶联物中使用的抗HMGB1抗体例如可以由将包含HMGB1整体或表位的多肽对动物进行免疫而得到的B淋巴细胞来源的杂交瘤产生。作为具体的方法，例如可以使用WO2007/049468、US2009/0252739、WO2014/115430、FASEB J.2007,Vol.21,pp.3904-3916等中记载的方法。

免疫中使用的动物没有特别限定，例如可举出温血动物，可优选举出兔子、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、牛、马、豚鼠、猴子、狗、猫、仓鼠、鸡等。

另外，抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段也可以通过如下方法产生，即，将包含编码抗体的可变区的全部或一部分的碱基序列的多核苷酸导入到例如动物细胞(中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾细胞(COS)、HEK293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)等)、非动物真核细胞(昆虫细胞等)、细菌(大肠杆菌等)、酵母、昆虫、植物、转基因动物(牛、鸡等)或体外翻译系统(真核生物来源、大肠杆菌来源的无细胞翻译系统等)中，使抗体表达。兔源抗体、小鼠嵌合抗体、人嵌合抗体、人源化抗体或它们的抗原结合性片段的制造中，优选通过这样的多核苷酸导入来制造抗体。

(药物部分)

本发明的抗体药物偶联物的药物部分中使用的药物没有特别限定，可以根据对象的疾病等而适当地选择。另外，该药物可以为1种，也可以为多种。例如，作为该药物，可举出选自细胞毒剂、细胞保护剂(他汀、细胞凋亡抑制剂、神经保护剂、萝卜硫素等)、探针、抗血管生成剂、免疫抑制剂、降压药、升压药、疼痛缓解剂、细胞因子、抗生素和免疫检查点抑制剂中的1种或2种以上。

该药物的化学种类例如可以使用天然有机化合物、合成有机化合物、蛋白质(抗体、抗体片段、酶等)、DNA、RNA、核酸类似物(PNA、LNA、吗啉代核酸、硫代寡核苷酸等)、肽、纳米粒子、量子点、原子(放射性核素等)、囊泡(PLGA纳米粒子等)、糖、多糖等。

对于细胞毒剂，例如可举出化学治疗剂、放射性同位素、放射增敏剂、近红外线吸收剂(IR700(Nature Medicine,2011,Vol.17,pp.1685-1691)等)、V－ATPase抑制剂、促细胞凋亡剂、Bcl2抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、MCL1抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、mTor抑制剂、奥瑞他汀、海兔毒素、美坦素、美登素、美坦新、倍癌霉素、卡奇霉素、单端孢霉烯、白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、(来自铜绿假单胞菌的)外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白(modeecin)A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolacca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP－S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria oficinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecenes)CC1065、MetAP(蛋氨酸氨基肽酶)、CRM1核运输抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、蛋白质合成抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、DNA损伤剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA烷化剂、DNA插入剂、DNA小沟区结合剂、DHFR抑制剂、抗癌抗生素等。

对于化学治疗剂，例如可举出阿扎利宾(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿扎胞苷(azacytidine)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、草苔虫素－1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、10－羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin)、卡莫司汀(carmustine)、塞来昔布(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)、卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素葡萄糖醛酸苷(daunomycin glucuronide)、柔红霉素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素葡萄糖醛酸苷(doxorubicinglucuronide)、表阿霉素(epirubicin)、乙炔雌二醇(ethinyl estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷葡萄糖醛酸苷(etoposideglucuronide)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉西他滨(gemcitabine)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、羟基脲(hydroxy urea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、亚叶酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、美登醇(maytansinoid)、氮芥(mechlorethamine)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨喋呤(methotrexate)、米拖蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、苯丁酸(phenylbutyrate)、泼尼松(prednisone)、甲基苄肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉烷类(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、沙利度胺(thalidomide)、巯鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、鬼臼噻吩甙(teniposide)、拓扑替康(topotecan)、乌拉莫司汀(uracil mustard)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)、曲妥珠单抗(trastuzumab)等。

对于放射性同位素，例如可举出碘(

作为探针，没有特别限定，例如可举出荧光物质、发光物质、放射性探针(

对于荧光物质，例如可举出绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物、Alexa Fluor(注册商标)的各种荧光体(Alexa Fluor 430等)、罗丹明系、香豆素系、

对于抗血管生成剂，例如可举出阿昔替尼、沙利度胺、血管抑素、内皮抑素、メタスタチン(Metastatin)、抗VEGF抗体(例如，贝伐珠单抗)、VEGFR－2抑制剂(例如，SU5416、SU6668)等。

(连接子)

本发明中使用的连接子可以是在化合物或抗体保持活性的条件下受到以溶酶体等酸性条件切割的酸诱导性切割(腙、缩醛、类顺式乌头酸酯的酰胺等)、光诱导性切割、由组织蛋白酶和其它溶酶体的肽切割酶诱导的肽酶诱导性切割、酯酶诱导性切割和二硫键切割等切割的影响的连接子(切割性连接子)。或者，连接子也可以实质上对切割具有耐性(例如，稳定性连接子或非切割性连接子)。或者，例如连接子也可以为预先带电荷的连接子(例如参照US2009/0274713)、亲水性连接子或基于二羧酸的连接子。

一个方式中，本发明的抗体药物偶联物可以使用具有能够向药物部分和抗体连接的反应性官能团的交联试剂来制备。例如，半胱氨酸、硫醇或胺、例如N末端或氨基酸链侧链(例如，抗体或抗原结合性片段上的赖氨酸侧链)能够与交联试剂的官能团形成键。而且，由交联试剂的全部或一部分、或者多种交联试剂构成连接子部分。

一个方式中，连接子具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应而形成共价键的官能团。非限定性且例示性的这样的反应性官能团可举出马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α－卤代乙酰基、活化酯、例如琥珀酰亚胺酯、4－硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯、异硫氰酸酯等。

一个方式中，连接子具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能团。这样的亲电子基团例如可举出醛基或酮羰基。一些实施方式中，连接子的反应性官能团的杂原子能够与抗体上的亲电子基团反应而形成与抗体单元的共价键。这样的反应性官能团例如可举出酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、芳肼等。

一个方式中，连接子选自双马来酰亚胺基三氧基乙二醇(BMPEO)、N－(β－马来酰亚胺丙氧基)－N－羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N－(ε－马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)、N－[γ－马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6－己烷－双乙烯基砜(HBVS)、琥珀酰亚胺基－4－(N－马来酰亚胺甲基)环己烷－1－羧基－(6－酰胺己酸酯)(LC－SMCC)、间马来酰亚胺苯甲酰基－N－羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4－(4－N－马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼(MPBH)、琥珀酰亚胺基－3－(溴乙烯胺)丙酸酯(SBAP)、琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、琥珀酰亚胺基(4－碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N－琥珀酰亚胺基－3－(2－吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N－琥珀酰亚胺基－4－(2－吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、琥珀酰亚胺基－4－(N－马来酰亚胺甲基)环己烷－1－甲酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基－4－(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基－6－[(β－马来酰亚胺丙酰胺)己酸酯](SMPH)、亚氨基硫烷(IT)、磺基－EMCS、磺基－GMBS、磺基－KMUS、磺基－MBS、磺基－SIAB、磺基－SMCC、磺基－SMPB和琥珀酰亚胺基－(4－乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)。

用于形成这样的连接子的试剂包含双马来酰亚胺试剂：二硫代双马来酰亚胺乙烷(DTME)、1,4－双马来酰亚胺丁烷(BMB)、1,4－马来酰亚胺基－2,3－二羟基丁烷(BMDB)、顺式马来酰亚胺己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)

一个方式中，连接子包含多肽。没有特别限定，包含二肽、三肽、四肽和五肽。二肽没有限定，例如选自缬氨酸－瓜氨酸(vc或val－cit)、丙氨酸－苯丙氨酸(af或ala－phe)；苯丙氨酸－赖氨酸(fk或phe－lys)；苯丙氨酸－高赖氨酸(phe－homolys)；和N－甲基－缬氨酸－瓜氨酸(Me－val－cit)。三肽没有限定，例如选自甘氨酸－缬氨酸－瓜氨酸(gly－val－cit)和甘氨酸－甘氨酸－甘氨酸(gly－gly－gly)。

连接子中含有的多肽的氨基酸单元可以包含天然存在的氨基酸残基和/或瓜氨酸这样的非天然存在氨基酸类似物和/或其它氨基酸。氨基酸单元可以对利用特定的酶、例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或血纤维蛋白溶酶蛋白酶的酶切进行设计和优化。

这些多肽可以与抗体或抗原结合性片段或构成药物部分的多肽融合地通过翻译来合成。

连接子部分的碳原子数例如可以为3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、12以上或15以上，例如可以为50以下、40以下、30以下或20以下。

[医药组合物]

本发明的医药组合物含有上述的[抗体药物偶联物]的项中记载的抗体药物偶联物和药学上可接受的载体。

本发明的医药组合物例如可以为溶液(例如可注射、可经肠给予或可输液的溶液)、微乳剂、分散液、悬浮剂、片剂、散剂、粒剂、胶囊、含片、丸剂、脂质体、栓剂、泥罨剂、贴剂等、液体、半固体、糊状、固体或粉末的剂型。优选的形态根据希望的给予形态、给予量、给予频率、给予期间、给予对象的症状·年龄·性别·体重、预防和治疗的应用目的而不同，但为可注射、可经肠给予或可输液的溶液的形式。

本发明的医药组合物的优选的给予方式为非口服给予(例如静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内、消化管内等)。一个方式中，本发明的医药组合物通过静脉输液、经管输液或静脉注射来给予。另一个方式中，本发明的医药组合物通过肌肉内注射或皮下注射来给予。

可注射的制剂可以通过使将活性成分溶解于液体或者使活性成分冷冻干燥后封入到燧石或琥珀色小瓶、安瓿、塑料容器、玻璃容器或预充式注射器中来提供。

本发明的医药组合物一般优选在制造和储存的条件下是无菌或稳定的。本发明的医药组合物可以以溶液、微乳剂、分散液、脂质体等已叙述的形态配置处方。

例如，无菌的可注射的溶液可以通过将所需量的活性成分(即本发明的抗体药物偶联物)根据需要与上述成分中的1种或组合一起混合在适当的溶剂中，然后，进行过滤灭菌等灭菌处理来制备。

例如，分散液可以将含有活性成分的粉末制剂使用含有基本的分散介质和上述列举的成分中所需的其它成分的无菌媒介物(vehicle)来制备。另外，粉末制剂例如可通过上述灭菌过滤溶液的真空冷冻干燥和喷雾干燥而得到。

作为药学上可接受的载体，包含生理学上相容的任意的或全部的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂、吸收促进剂和吸收阻滞剂等。药学上可接受的载体的例子包含水、盐类溶液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、单糖类、二糖类、寡糖、多糖类(糊精、葡聚糖、异麦芽糖糊精、纤维素、普鲁兰多糖、甲壳质、壳聚糖、瓜尔胶、卡拉胶等)等糖质和它们的衍生物、甘油、乙醇等醇类等，它们可以单独或适当地组合使用。作为注射剂等使用时，可以将pH调节剂、等渗剂、例如上述糖质、甘露醇、山梨糖醇、麦芽糖醇等糖醇、或者氯化钠等中的1种或多种适当地组合使用。

药学上可接受的载体可以根据医药组合物的形态而进一步含有润湿剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、冷冻保护剂、稳定剂、赋形剂、增量剂、pH调节剂等维持或增大抗体或其抗原结合性片段部分的保存性或有效性的适量的辅助物质。

缓冲剂例如可以使用pH5.0～7.0(在最佳的情况下，pH约为6)的L－组氨酸(1～50mM)，在最佳的情况下为5～10mM的L－组氨酸。其它适当的缓冲剂例如可举出琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。

冷冻保护剂或赋形剂例如可以使用0～10％(在最佳情况下为0.5～5％)的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖质。其它适当的冷冻保护剂或赋形剂可使用甘露醇、麦芽糖醇、海藻糖、乳糖等糖质。

稳定剂例如可以使用1～50mM(在最佳情况下为5～10mM)的L－蛋氨酸等的氨基酸。对于其它适当的稳定剂，可举出甘氨酸、精氨酸和聚山梨酯80等。

增量剂没有特别限定，可举出已叙述的糖质或它们的衍生物，特别是例如1～10％的海藻糖、麦芽糖醇、甘露醇(在最佳情况下为2～4％)。

本发明的医药组合物如上所述能够将药物递送到包含血管生成亢进或血管通透性亢进的血管的生物体组织，因此能够适用于血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病。

本说明书中所谓的血管生成亢进相关疾病是指伴有血管生成亢进的疾病。作为血管生成亢进相关疾病，例如可举出良性或恶性肿瘤(特别是实体瘤)、渗出性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症、血管瘤、眼内新生血管疾病、增殖性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎或牛皮癣。

其中，从通过血管生成的抑制或新生血管的破坏而明显得到周围组织的营养或氧供给抑制的效果的方面出发，本发明的医药组合物能够适用于良性或恶性实体瘤。

将本发明的医药组合物应用于这些血管生成亢进相关疾病时，优选该医药组合物的抗体药物偶联物中至少包含细胞毒剂或抗血管生成剂作为药物。

对于恶性肿瘤，例如可举出恶性黑色素瘤(Melanoma)、鳞状细胞癌、基底细胞癌、肺癌(可举出小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包含胃肠癌)、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴部癌、甲状腺癌、眼睑肿瘤(包含皮脂腺癌、基底细胞癌)、结膜肿瘤、眼眶肿瘤(包含泪腺肿瘤)、眼内肿瘤(包含视网膜母细胞瘤、脉络膜恶性黑色素瘤)、恶性淋巴瘤、眼内转移性肿瘤或各种类型的头颈癌(包含口腔癌、咽癌、鼻咽癌、中咽癌、下咽癌、喉癌、鼻/鼻窦癌、唾液腺癌、甲状腺癌等)。

本说明书中所谓的血管通透性亢进相关疾病是指伴有血管通透性亢进的疾病。血管通透性还因慢性或急性的强度或全身性炎症而亢进。因此，作为血管通透性亢进相关疾病，例如可举出癫痫、中风、脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、慢性炎症、神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病、脊髓小脑变性症等)、急性炎或败血症。

其中，本发明的医药组合物优选应用于伴有血脑屏障破坏的疾病。作为这样的疾病，例如可举出癫痫、中风、脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、慢性炎症、神经变性疾病等。

将本发明的医药组合物应用于这些血管通透性亢进相关疾病时，优选该医药组合物的抗体药物偶联物中至少包含细胞保护剂作为药物。

本发明的医药组合物的对象为人或非人动物，优选为人。

本发明的医药组合物例如可以以每天1次、每周1次、每1周1～7周、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每5周1次、每6周1次、每7周1次或每8周1次的间隔进行给予。

本发明的医药组合物的给予量没有特别限定，另外，可以根据其构成、载体、使用目的、对象的年龄、体重、性别、应用的疾病等而适当地变更。本发明的医药组合物的给予量换算成该医药组合物所含有的抗体药物偶联物的质量例如可以为0.0001mg/kg(对象体重)以上、0.001mg/kg(患者体重)以上、0.01mg/kg(对象体重)以上，而且可以为200mg/kg(患者体重)以下、100mg/kg(对象体重)以下、20mg/kg(对象体重)以下、10mg/kg(对象体重)以下、5mg/kg(对象体重)以下、2mg/kg(对象体重)以下、1mg/kg(对象体重)以下、0.5mg/kg(对象体重)以下、0.2mg/kg(对象体重)以下、0.1mg/kg(对象体重)以下。

本发明的医药组合物可以进一步与选自抗HMGB1抗体或与本发明的抗体药物偶联物不同的抗体或其它抗体药物偶联物、细胞毒剂、细胞保护剂、探针、抗血管生成剂、免疫抑制剂、降压药、升压药、疼痛缓解剂、细胞因子、抗生素和免疫检查点抑制剂中的1种或2种以上并用。

本发明的医药组合物的应用中也可以组合对对象的质子束照射、重粒子束照射、使用γ射线、X射线、光(例如，在IR700处被吸收的近红外线等)等的光动力疗法(PDT)等。

[检测试剂]

本发明的检测试剂含有上述的[抗体药物偶联物]的项中记载的抗体药物偶联物。

本发明的检测试剂中包含用于得到用于治疗、诊断或预防的信息的医药品或者用于研究等的试剂等非医药品。

一个方式中，本发明的检测试剂中含有的抗体药物偶联物的药物部分至少包含探针。

本发明的检测试剂的对象为人或非人动物的个体、器官、组织或细胞，优选为人个体。在人个体中使用时，优选通过静脉输液、静脉注射、肌肉内注射或皮下注射而进行给予，更优选通过静脉输液或静脉注射而进行给予。

一个方式中，在本发明的检测试剂的应用中，也可以向给予了该检测试剂的对象进一步给予与抗体药物偶联物不同的探针。

一个方式中，在本发明的检测试剂的使用中，也可以向给予了该检测试剂的对象单独或适当地组合X射线、光(包含近红外线等)、磁场(例如，MRI)等进行照射。

本发明的检测试剂例如用于得到血管生成亢进或血管通透性亢进的血管或血管内皮细胞的图像或状态的信息。

本发明的检测试剂例如用于血管生成亢进相关疾病或血管通透性亢进相关疾病的诊断，优选用于肿瘤的诊断。特定的实施方式中，本发明的检测试剂被用于黑色素瘤的诊断。

以下，通过实施例对本发明更进一步具体地进行说明，但本发明不受这些实施例任何限制。本实施例中使用的分子生物学程序只要没有特别说明，则可以参照MolecularCloning:A Laboratory Manual(Third Edition)(Sambrook等，Cold Spring HarbourLaboratory Press，2001)。

实施例

[使用试剂]

(抗体等)

(1)抗HMGB1抗体

本实施例中，作为抗HMGB1抗体，使用大鼠IgG。使用识别存在于HMGB1的C末端区域的序列号1的氨基酸序列表示的表位的#10-22大鼠IgG抗体(记载于WO2014/115430公报)以及识别存在于HMGB1的B－box区域的序列号2的氨基酸序列的表位的#11-19大鼠IgG抗体(记载于FASEB J.2007,Vol.21,pp.3904-3916)。对于这些大鼠抗体的对各自对应的表位的解离常数Kd，#10-22为1.5×10

各抗体由通过WO2007/049468、US2009/0252739、WO2014/115430的各公报、FASEBJ.2007,Vol.21,p.3904-3916等中记载的方法获得的产生抗体的杂交瘤而得到。以下示出杂交瘤的获得方法的概要。

(a)大鼠的免疫

将市售的来自牛胸腺的HMGB1与HMGB2的混合物(和光纯药工业公司制，代码编号：080－070741)与弗氏完全佐剂一起向大鼠的后肢足跖给予。2周后确定到抗体价上升。接着，5周后从肿大的髂骨淋巴结中以无菌的方式取出淋巴结细胞。

(b)细胞融合和抗HMGB1抗体产生细胞的克隆

使用聚乙二醇将上述髂骨淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤SP2/O－Ag14(SP2)细胞融合，将所得到的融合细胞在96孔微孔板中培养，经过利用ELISA的初步筛选和基于Western印迹法的二次筛选来克隆抗HMGB1抗体产生细胞。

(2)对照抗体

本实施例中，对抗KLH抗体进行适当标记或修饰，用作对照抗体。抗KLH抗体使用钥孔血蓝蛋白(KLH)(产品编号：H7017,SIGMA-AL DRICH公司制)作为抗原，除此以外，依据上述抗HMGB1抗体的制作方法来制作。

(3)Alexa Fluor 488标记抗体

使用将上述(1)的抗HMGB1抗体和(2)的抗KLH抗体进行Alexa Fluor 488标记的抗体。

(4)连接有阿霉素的抗体

委托Biologica株式会社(Biologica Co.,Japan)使作为细胞毒剂的阿霉素与上述(1)的抗HMGB1抗体和(2)的抗KLH抗体连接。具体而言，制作这些抗体的赖氨酸侧链的氨基和阿霉素的氨基与作为交联剂的戊二酸通过酰胺键连接而得的抗体药物偶联物(图1A)。连接有阿霉素的抗HMGB1抗体的药物/抗体比(DAR)为9.1，连接有阿霉素的抗KLH抗体的DAR为8.2。

(5)连接有美坦新的抗体

利用与(4)同样的方法，制作使美坦新代替阿霉素－连接子部分与抗HMGB1抗体和抗KLH抗体结合而得的连接有美坦新的抗体(图1B)。各连接有美坦新的抗体的DAR为0.9：1。

(同工凝集素)

为了特异性地标记血管内皮细胞，使用对作为凝集素之一的同工凝集素标记了作为红色荧光色素的Alexa Fluor 594的同工凝集素(产品编号：I21413,Invitrogen公司制)。

[试验例1.抗HMGB1抗体的向血管内皮细胞摄入的验证]

使用血管生成测试中使用的血管生成亢进的培养血管内皮细胞EA.hy926(CRL-2922,ATCC,Manassas,VA,USA)。将EA.hy926用含有10％胎牛血清(FCS)和4mM L－谷氨酰胺的DMEM以成为5×10

对于融合的EA.hy926培养血管内皮细胞，将Alexa Fluor 488标记抗HMGB1抗体(#10－22或#11－19)或作为对照的Alexa Fluor 488标记抗KLH抗体以成为最终浓度10μg/mL的方式添加于上述培养基。为了进一步提高细胞通透性，加入100ng/mL的脂多糖(LPS)。将细胞核用DAPI标记，将细胞膜用F－肌动蛋白标记。观察从添加这些标记试剂起1、2和4小时后的标记抗体的局部存在。观察使用共聚焦激光显微镜(LMS780，Carl Zeiss公司制)。

将结果示于图2A～C。如图2A所示，经荧光标记的抗HMGB1抗体和抗KLH抗体(对照抗体)的局部存在用绿色荧光表示。判明抗HMGB1抗体在1小时后被培养血管内皮细胞摄入，经时地在细胞核的周围以颗粒状蓄积。另一方面，抗KLH抗体在细胞内几乎没有观察到绿色荧光，因此认为没有发生向细胞内的摄入。

图2B是表示表位不同的Alexa Fluor 488标记抗HMGB1抗体的细胞局部存在的比较的图。表位不同的抗HMGB1抗体均被培养血管内皮细胞摄入。

图2C表示图2B的三维重建图像。在细胞核的周围存在颗粒状的荧光标记抗HMGB1抗体。由此判明抗HMGB1抗体药物偶联物被细胞质级分、尤其是细胞核周围的囊泡摄入。

根据以上的结果，归结为抗HMGB1抗体无论其表位的差异，胶囊被血管生成亢进或血管通透性亢进的血管的血管内皮细胞摄入。

[试验例2.连接有阿霉素的抗HMGB1抗体的向血管内皮细胞的摄入的验证]

对于通过与试验例1同样的方法得到的融合的EA.hy926培养血管内皮细胞，将连接有阿霉素的大鼠抗HMGB1抗体(#10-22)或连接有阿霉素的抗KLH抗体(对照抗体)以成为最终浓度10μg/mL的方式添加于培养基。进一步加入100ng/mL的脂多糖(LPS)作为刺激因子。将细胞核用DAPI标记，将细胞膜用F－肌动蛋白标记，观察添加后4小时后的标记抗体的局部存在。观察使用共聚焦激光显微镜(LMS780，Carl Zeiss公司制)。连接有阿霉素的抗体的检测使用阿霉素的红色自体荧光(exitation：485nm，emission：590nm)。

将结果示于图3A和图3B。连接有阿霉素的抗HMGB1抗体被培养血管内皮细胞摄入。另一方面，作为对照的抗体的抗KLH抗体即便进行LPS刺激也未被培养血管内皮细胞摄入。

根据以上的结果，连接有阿霉素代替荧光标记的抗HMGB1抗体也被培养血管内皮细胞摄入。因此，无论所结合的药物的种类，抗HMGB1抗体药物偶联物将军被血管生成亢进或血管通透性亢进的血管内皮细胞内摄入，能够将药物递送到该细胞内。

[试验例3.抗HMGB1抗体的肿瘤血管内皮细胞特异性蓄积的验证]

向小鼠(C57BL/6J，7周龄，雌性)背部皮下注射2.0×10

使用共聚焦激光显微镜(LSM，Carl Zeiss公司制)对所得到的切片以倍率200倍进行观察。

将黑色素瘤肿瘤块、肝、肺和脑的LSM图像分别示于图4A～D。如图4A所示，在黑色素瘤内的肿瘤血管内皮细胞中确认到荧光标记抗HMGB1的明显蓄积。另一方面，如图4B～D所示，在作为正常组织的肝、肺和脑的血管中没有确认到荧光标记抗HMGB1抗体的蓄积。

根据以上的结果，对生物体给予的抗HMGB1抗体特异性地局部存在于肿瘤血管。而且，如果与试验例1的结果综合来看，则结论是局部存在的抗HMGB1抗体被肿瘤血管内皮细胞选择性地摄入。

[试验例4.用于连接有阿霉素的抗HMGB1抗体的肿瘤缩小效果验证的体内试验]

向小鼠(C57BL/6J，7周龄，雌性)背部皮下注射2.0×10

(a)磷酸缓冲生理盐水(PBS)

(b)连接有阿霉素的大鼠抗KLH抗体2.5mg/kg(α-KLHAb-Dox)

(c)连接有阿霉素的大鼠抗HMGB1抗体(#10-22)2.5mg/kg(α-HMGB1Ab-Dox)

(d)游离体的阿霉素98μg/kg(Doxorubicin)

给予后第7天再次向各组的小鼠给予相同的药剂。然后，从最初给予起11天后从尾静脉给予荧光标记同工凝集素2mg/kg(小鼠体重)。在10分后使小鼠流血致死，灌流固定后进行组织切片制作。将以上的试验计划的概要示于图5A。

基于经时测定的肿瘤直径由以下的近似式算出从最初给予的开始时刻到给予11天后的小鼠的肿瘤体积。

肿瘤体积V＝(W

使用常规方法将上述的灌流固定的小鼠的黑色素瘤组织制成石蜡切片，使用抗Ki67抗体(产品编号：ab15580，abcam公司制)将增殖细胞染色。数出抗Ki67抗体染色图像中的每1个视野的阳性细胞数，进行各组的Ki67阳性细胞数的比较。

进而，利用下述所示的Tunel法对上述组织切片中的发生了细胞凋亡的细胞进行检测。对于各组的4个个体，将各个体的染色图像中的4个视野的细胞数和Tunel阳性细胞数进行合计，求出Tunel阳性细胞的比例。

＜Tunel法＞

使用市售的In situ Apoptosis Detection Kit(Takara Bio公司制)按照下述顺序来检测发生了细胞凋亡的细胞。

(1)制作由各组(PBS组、α-KLHAb-Dox组、α-HMGB1Ab-Dox组、阿霉素组)得到的黑色素瘤的石蜡切片。

(2)进行脱石蜡处理。

(3)用3％H

(4)将预先调整后冰冷的标记反应液50μL(TdT Enzyme 5μL+labeling buffer 45μL)载置于载玻片上，在润湿箱中，在37℃反应60分钟后，用PBS进行清洗，反应5分钟反应，将这一系列工序实施3次。

(5)用荧光显微镜观察切片。

将表示所测定的肿瘤体积的变化的图示于图5B，将体重的变化示于图5C。α-HMGB1Ab-Dox组中，与其它组相比，肿瘤体积的增加得到明显抑制。另一方面，小鼠的体重实质上没有组间的差异，没有观察到由给予所致的严重副作用。

将黑色素瘤组织的抗Ki67抗体染色图像示于图5D，将对Ki67阳性细胞数进行比较的图表示于图5E。α-HMGB1Ab-Dox组与阿霉素组等其它组相比，肿瘤的增殖得到明显抑制。

将肿瘤组织中的发生了细胞凋亡的细胞的染色图像示于图5F，将对Tunel阳性细胞的比例进行比较的图表示于图5G。α-HMGB1Ab-Dox组与α-KLHAb-Dox组和阿霉素组相比，以明显高的比例诱导了肿瘤细胞的细胞凋亡。α-HMGB1Ab-Dox组中发生了细胞凋亡的细胞在血管周边以同心圆状扩展。

根据以上的结果，结论为连接有阿霉素的抗HMGB1抗体被肿瘤的血管内皮细胞摄入而发生了由阿霉素带来的细胞损伤，结果肿瘤的增殖得到抑制。

[试验例5.抗HMGB1抗体的在病变脑血管内皮细胞中的蓄积的验证]

向小鼠(C57BL/6N，体重18～23g的雌性5只)腹腔内注射给予甲基东莨菪碱1mg/kg(小鼠体重)、静脉注射给予毛果芸香碱350mg/kg。由此，制作毛果芸香碱诱导癫痫持续状态(PILO－SE)模型小鼠。

在刚通过给予毛果芸香碱而诱导痉挛后静脉注射1mg/kg的大鼠抗HMGB1抗体(#10-22)。12小时后用4％多聚甲醛将脑进行灌流固定，制作冷冻切片。

对于切片，细胞核进行DAPI染色，抗HMGB1使用FITC标记抗大鼠IgG抗体进行染色。观察使用共聚焦激光显微镜(LMS780，Carl Zeiss公司制)。

将得到的LSM图像示于图6。中央的空洞表示血管。抗HMGB1抗体(绿色)局部存在于血管周围，表明局部存在于血管内皮细胞。

已知由于癫痫、中风、脑肿瘤或神经变性疾病等脑损伤而发现脑血管的生成或通透性的亢进。根据上述的结果，可判断抗HMGB1抗体药物偶联物特异性蓄积于这样的由脑损伤引起的血管生成亢进或通透性亢进的血管，并进一步被血管内皮细胞内摄入。

[试验例6.用于连接有美坦新(Emtansine)的抗HMGB1抗体的肿瘤缩小效果验证的体内试验]

向小鼠(C57BL/6J，7周龄，雌性)背部皮下注射2.0×10

(a)连接有美坦新的大鼠抗KLH抗体2.5mg/kg(α－KLHAb-DM1)

(b)连接有美坦新的大鼠抗HMGB1抗体(#10-22)2.5mg/kg(α-HMGB1Ab-DM1)

(c)大鼠抗KLH抗体2.5mg/kg(α－KLHAb)

(d)大鼠抗HMGB1抗体(#10-22)2.5mg/kg(α－HMGB1Ab)

(e)游离体的美坦新18μg/kg(Emtansine)

给予后第7天再次向各组的小鼠给予相同的药剂。然后，从最初给予起10天后从尾静脉给予荧光标记同工凝集素2mg/kg(小鼠体重)。10分钟后使小鼠流血致死，灌流固定后进行组织切片制作。将以上的试验计划的概要示于图7B。

利用与试验例4同样的方法，求出从最初给予的开始时刻到给予10天后的小鼠的肿瘤体积。

试验的结果，11天后的肿瘤体积在α-HMGB1Ab-DM1组中小于其它组，确认到最高的肿瘤增殖抑制效果。另外，α-HMGB1Ab-DM1组没有看到小鼠体重的减少。根据以上情况，结论为通过使连接于抗体的美坦新的分子数进一步增加，能够抑制副作用，并且进一步提高抗肿瘤效果。

产业上的可利用性

根据本发明的抗HMGB1抗体或其抗原结合性片段与药物的偶联物(抗体药物偶联物)，能够将期望的药剂选择性地递送到血管生成亢进或通透性亢进的血管的内皮细胞。另外，该抗体药物偶联物具有实质上不会被正常血管摄入的特征。因此，该抗体药物偶联物能够有效地发挥药剂的所期望的药理作用，由此能够避免或减少由药剂引起的副作用，具有能够减少对患者的负担的实际利益。上述本发明的产业上的有用性极大。

序列表

<110> 国立大学法人冈山大学

医疗法人创和会

<120> 抗体药物偶联物和用于抗体的药物递送的应用

<130> PCT20075MD

<150> JP 2019-228542

<151> 2019-12-18

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

1 5 10