二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒或肺部纤维化的药物中的应用

摘要

本发明提供了二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒或肺部纤维化的药物中的应用，二氢杨梅素对新冠病毒具有抑制作用，能够结合SARS‑CoV‑2Mpro并抑制其体外的酶活性，其针对新冠病毒主蛋白酶Mpro的IC50值为1.716±0.419μM，具有显著效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒或肺部纤维化的药物中的应用。

背景技术

国际病毒分类委员会将新冠病毒命名为SARS-CoV-2,现已迅速传播到全球213个国家。截至目前为止，全球已累计确诊144,617,554例，累计死亡3,067,367例，新冠肺炎出现以来美国FDA批准了多款药物的临床试验，如瑞德西韦、法匹拉韦和阿比朵尔等，然而临床试验结果表明，这些药物的临床疗效并不显著。目前仍缺乏且迫切需要开发治疗新冠肺炎的有效药物。

SARS-CoV-2基因组由约3万个核苷酸组成，其复制酶基因编码两个重叠的多蛋白pp1a和pp1ab，这是病毒复制所必需的。主蛋白酶(M

肺纤维化是多种间质性肺疾病的最后阶段，其特征是肺实质被破坏并且细胞外基质沉积在肺间质及肺泡腔内。目前针对该病的上市药物只有两个，分别是罗氏的吡非尼酮和勃林格殷格翰的尼达尼布，但都不能有效提高患者生存期，治疗费用高，且临床需求远未得到满足。因此，探索新的潜在的药物靶点，开发出针对肺纤维化的疗效确认、相对安全、价格合理的药物具有重要的社会意义和医学意义。

二氢杨梅素是一种广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物中的二氢黄酮类化合物，别名双氢杨梅素、白蔹素，1940年首次由Purrmann等在楝叶玉葡萄中分离得到。既往的研究已证实二氢杨梅素具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调血脂、保肝等多种活性。近年来，二氢杨梅素在抗菌、抗病毒方面的活性引起了广大药学工作者的关注。但目前尚未有二氢杨梅素可抑制新冠病毒或减缓肺纤维化的相关报道。

发明内容

有鉴于此，为了解决上述问题，本发明提出了二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒的药物中的应用，。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒的药物中的应用。

进一步的，所述二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒复制的药物中的应用。

进一步的，所述二氢杨梅素是SARS-CoV-2M

本发明的另一目的在于提出一种抑制新冠病毒的药物，包括二氢杨梅素或二氢杨梅素与二氢杨梅素在药学上可接受的酸、碱、盐、水合物、酯或其他辅料中的一种或多种。

进一步的，所述药物为片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。

相对于现有技术，本发明所述的二氢杨梅素在制备抑制新冠病毒的药物中的应用具有以下优势：本发明的研究表明，二氢杨梅素对新冠病毒具有抑制作用，能够结合SARS-CoV-2M

本发明的另一目的是提出了二氢杨梅素在制备抑制肺部炎症的药物中的应用。

本发明还提出了一种抑制肺部炎症的药物，包括二氢杨梅素或二氢杨梅素与二氢杨梅素在药学上可接受的酸、碱、盐、水合物、酯或其他辅料中的一种或多种。

相对于现有技术，本发明所述的二氢杨梅素在制备抑制肺部炎症的药物中的应用具有以下优势：本发明的研究表明，二氢杨梅素可有效的抑制博来霉素诱导的肺部炎症，对肺部炎症有良好的功效。

本发明的另一目的是提出了二氢杨梅素在制备抑制肺部纤维化的药物中的应用。

本发明还提出了抑制肺部纤维化的药物，包括二氢杨梅素或二氢杨梅素与二氢杨梅素在药学上可接受的酸、碱、盐、水合物、酯或其他辅料中的一种或多种。

进一步的，所述药物为片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。

相对于现有技术，本发明所述的二氢杨梅素在制备抑制肺部纤维化的药物中的应用具有以下优势：本发明的研究表明，二氢杨梅素可有效的抑制博来霉素诱导的肺部纤维化，对缓解、改善肺部纤维化具有良好的功效。

附图说明

图1为实施例1所述的26种中药单体对M

图2为实施例1所述的20种中药单体对M

图3为实施例1所述的25种中药单体对M

图4为实施例1所述的杨梅素对M

图5为实施例1所述的二氢杨梅素对M

图6为实施例2所述的各组小鼠肺部炎症因子的抑制效果的柱状对比图；

图7为实施例2所述的各组小鼠炎性细胞总数、巨噬细胞和淋巴细胞的抑制效果的柱状对比图；

图8为实施例2所述的各组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞的细胞涂片染色结果示意图；

图9为实施例3所述的各组小鼠肺功能情况的柱状对比图；

图10为实施例3所述的各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量柱状对比图；

图11为实施例3所述的各组小鼠肺纤维化组织切片HE染色结果对比图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

以下实施例中，涉及的实验材料及其来源如下：

1.实验药物与试剂

二氢杨梅素：粉末状，由上海陶素生化科技有限公司提供。

吡非尼酮：大连美仑生物技术有限公司。

SARS-CoV-2Mpro酶活检测试剂盒：碧云天。

ELISA试剂盒：上海酶联生物。

DMEM高糖培养基：购自赛默飞世尔科技有限公司。

胰蛋白酶：购自上海生工生物工程有限公司，货号：T0458-10，批号：0301C314，级别：USP，规格：10g。

胎牛血清：Gibcol。

水合氯醛：货号：Sigma-23100，上海北诺生物科技有限公司。

甲醛溶液：货号：3A6A16163，艾览(上海)化工科技有限公司。

苏木素染液：货号：ZLI-9610，天津均尧商贸有限公司。

水溶性伊红染液：货号：ZLI-9613，天津均尧商贸有限公司。

抗体试剂：Affinity。

2.实验主要仪器

生物安全柜：西班牙泰事达(Telstar)，型号：Bio II A。

CO

倒置相差显微镜：厂家：奥林巴斯，型号：CKX41。

多功能酶标仪：厂家：Thermo Fisher。

电子天平：上海奥豪斯仪器有限公司，型号：AR2202CN。

台式冷冻离心机：赛默飞世尔科技公司，型号:ST16R。

超声波细胞破碎机：赛默飞世尔(Thermo Fisher),型号：SCIENTZ-IID。

4℃冰箱：青岛海尔股份有限公司，型号：BCD-192KJ。

涡漩混匀器:海门市其林贝尔仪器制造有限公司,型号：QZ-861。

AniRes2005动物肺功能分析系统：北京贝兰博科技有限公司，型号：Version 3.5。

实施例1

1.1对71种药物或化合物进行M

1.1.1实验方法

利用荧光共振能量转移的方法评价71种化合物对SARS-CoV-2M

1.1.2实验过程

酶促反应体系的体积为100μL。M

空白对照孔由93μL反应缓冲液、5μLDMSO和2μL底物组成。

100％酶活对照孔由92μL反应缓冲液、1μLM

药物检测孔由92μL反应缓冲液、1μLM

在96孔板中加入M

1.1.3检测结果

如图1-3所示，通过初步的酶活筛选，可知71种化合物中筛选出两种M

1.2杨梅素及二氢杨梅素抑制SARS-CoV-2M

1.2.1实验过程

酶促反应体系的体积为100μL。M

空白对照孔由93μL反应缓冲液、5μLDMSO和2μL底物组成。

100％酶活对照孔由92μL反应缓冲液、1μLM

药物检测孔由92μL反应缓冲液、1μLM

在96孔板中加入M

1.2.2检测结果

如图4-5所示，经过对不同浓度梯度的杨梅素和二氢杨梅素进行M

实施例2

2.1二氢杨梅素抑制博来霉素诱导的肺部炎症

2.1.1模型建立及给药

选择6-8周龄、体重在22-24g之间的C57BL/6J小鼠，Day0天将小鼠按实验需求进行分组。称量小鼠体重并记录后将其固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开约1cm长的开口，用手术镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，手术组按2U/kg的剂量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布；假手术组向小鼠气管内注射等量的注射用生理盐水。

分组情况：小鼠随机分为6组，每组5只小鼠；

分别为：空白对照组、模型组、阳性药吡非尼酮组、二氢杨梅素50mpk组、二氢杨梅素100mpk组、二氢杨梅素200mpk组。

从day0天起至day6天连续给药7天，各组灌胃给药，对照组给予相同体积的生理盐水。

2.1.2结果检测

炎症因子检测：所有动物均于造模后第7天(即给药后第7天)小鼠全身麻醉后，经气管插入导管，用1mL生理盐水灌洗肺部3次后收集。肺泡灌洗液室温下3000rpm离心10分钟，上清用于后续ELISA检测细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α。

炎性细胞计数：肺泡灌洗液室温下3000rpm离心10分钟，细胞沉淀用1mL的红细胞裂解液重悬，室温静置5min，3000rpm离心10分钟，弃上清，1mL PBS重悬。取200μL细胞悬液置于细胞计数仪中计算细胞总数，剩下的细胞悬液涂片于载玻片，待涂片干后用中性福尔马林溶液固定10min后，纯水冲洗晾干，之后用苏木素和伊红进行染色。染色结束后在显微镜放大倍数为40倍下对200个细胞进行分类计数，分别计算出巨噬细胞和淋巴细胞的数量。

2.1.3实验结果

如图6所示，不同浓度的二氢杨梅素对博来霉素诱导的肺炎小鼠的肺泡灌洗液中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平的抑制作用，结果显示二氢杨梅素可以显著下调肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平且与阳性药吡非尼酮组相当或优于阳性药组。

如图7-8所示，小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞的数量统计，结果显示，二氢杨梅素可显著抑制肺炎小鼠炎性细胞如巨噬细胞和淋巴细胞的浸润，且二氢杨梅素200mpk组优于阳性药吡非尼酮组。

实施例3

3.1二氢杨梅素抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

3.1.1模型建立及给药

选择6-8周龄、体重在20-22g之间的C57BL/6J小鼠，将小鼠按实验需求进行分组。称量小鼠体重并记录后将其固定于操作台，颈部用70％酒精消毒，用手术刀在小鼠颈部垂直划开约1cm长的开口，用手术镊分离组织暴露气管，将注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，手术组按2U/kg的剂量缓慢注入与其体重相适应体积的博莱霉素，立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布；假手术组向小鼠气管内注射等量的注射用生理盐水。

分组情况：小鼠随机分为6组，每组5只小鼠；

分别为：空白对照组、模型组、阳性药吡非尼酮组、二氢杨梅素50mpk组、二氢杨梅素100mpk组、二氢杨梅素200mpk组。

造模7天后从day7天开始到day13天连续给药7天，各组灌胃给药，对照组给予相同体积的生理盐水。

3.1.2结果检测

肺功能检测：在博来霉素造模后第14天时，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠(0.5ml/100g)，取仰卧位固定于操作台，剪开颈部皮毛，暴露气管，并钝性分离气管，于气管近头部处剪一切口，将插管的气管接头处插入气管，并用棉线固定，转移小鼠至体描仪平台，连接呼吸机与气管接头，记录小鼠的用力肺活量、0.1秒用力呼气量、肺动态顺应性等肺功能指标的变化。

羟脯氨酸含量的测定：在博来霉素造模后第14天处死小鼠，分离小鼠右肺，放入5ml安培瓶中，120℃烘箱烘干，盐酸水解后调整PH至6.5-8.0，过滤残渣，加入PBS调整总体积为10ml，取50μL样品，加入350μL去离子水、200μL氯胺T溶液室温孵育20分钟，加入200μL高氯酸室温孵育5分钟，加入200μL对二甲氨基苯甲醛65℃孵育20分钟。取200μL至96孔板中测定样品570nm的吸光值，利用标准品读数绘制标准曲线，进而根据标准曲线所得公式求得所测样品羟脯氨酸浓度Cs。按以下公式换算为全部右肺所含羟脯氨酸的量W:W＝Cs×8(所测样品稀释倍数)×10(样品总体积)。

病理切片：第14天取样后，将小鼠的左肺置于5％甲醛固定液中，置于摇床室温过夜。再脱水、固定、切片、染色、拍照，最后统计切片肺纤维化面积。

3.1.3实验结果

如图9所示，二氢杨梅素对肺纤维化小鼠肺功能的影响，结果显示，二氢杨梅素可显著提升小鼠的用力肺活量和肺顺应性，并显著改善博来霉素导致的小鼠呼吸组里和吸气阻力的提高，二氢杨梅素组作用效果略优于阳性药吡非尼酮。

如图10所示，小鼠肺组织羟脯氨酸的测定结果，结果显示，二氢杨梅素可显著下调博来霉素导致的小鼠肺组织羟脯氨酸含量。

如图11所示，小鼠肺组织切片的结果，图中可看出博来霉素可导致小鼠明显的纤维化表现，而二氢杨梅素可显著缓解小鼠肺纤维化的发生且效果优于阳性药吡非尼酮。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。