一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法

摘要

本发明公开了一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法，将微球与流式分析技术相结合，对Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体进行联合检测，检测方法如下：对14种微球进行激活；将微球与捕获抗体进行偶联反应；对微球进行封闭处理；将微球进行混合；将血清样本加入混合反应体系中，进行抗原抗体免疫结合反应；加入过量的FITC标记的羊抗鼠IgG进行免疫荧光反应；检测分析，该检测方法大大缩短了检测所需操作时间，提高了对相关抗体的检测效率，也进一步提高了检测方法对相关标志性抗体检测的灵敏度和特异性，且可实现对检测样本指标的多参数分析。

说明书

技术领域

本发明属于临床医学检测技术领域，具体涉及一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法。

背景技术

副肿瘤综合症，是指由于肿瘤的产物异常的免疫反应或其他不明原因，可引起内分泌、神经、消化、造血、骨关节、肾脏及皮肤等系统发生病变，出现相应的临床表现，这些表现不是由原发肿瘤或转移灶所在部位直接引起的而是通过上述途径间接引起。副肿瘤综合征是发生在某些恶性肿瘤患者体内，在未出现肿瘤转移的情况下，即已产生影响远隔的自身器官，而引起功能障碍的疾病。影响的远隔自身器官如在神经系统，也称之为神经系统副肿瘤综合征。它并不是由肿瘤直接侵犯该组织或器官而产生的一组症状，而是全身性癌肿的远隔效应，如肺癌、卵巢癌等可以出现表现为中枢神经系统的灰质炎性和神经退行性变的远隔效应。

副肿瘤综合征一般发生在患者肿瘤发生之前较多一些，据统计约有80％左右的副肿瘤综合征(PNS)患者在肿瘤发生之前就有了明显的病变表现，这就为我们及早的发现恶性肿瘤的存在提供了一个契机，对于严重威胁人类生命健康的癌症，如果能及早的发现以及诊断治疗，那么就可以显著地提高患者的生存期。

目前临床用于诊断副肿瘤综合征疾病的相关标志性抗体检测主要包括Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14种抗体，对于上述14种抗体的检测主要适用于副肿瘤综合征辅助诊断或筛选检查，以及副肿瘤脑炎与自身免疫性脑炎的鉴别诊断，中枢神经系统脱髓鞘性脊髓炎与副肿瘤相关脊髓炎鉴别诊断，小脑共济失调鉴别诊断，自身免疫性周围神经病与副肿瘤相关周围神经病鉴别诊断等。

目前，临床上对于副肿瘤综合征的相关14项标志性抗体的检测主要通过免疫印迹法、酶联免疫吸附测定方法等进行测定，免疫印迹法是聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原，再转移至膜支持物上，然后与血清温育的测定方法，该方法的不足在于对于副肿瘤综合征的14项标志性抗体进行检测费时较长，而且需要用X射线底片或化学发光成像仪显示结果，利用酶联免疫吸附测定方法对副肿瘤综合征的相关14项标志性抗体进行检测则存在影响因素较多、标准化等问题。

发明内容

本发明的目的在于：针对以上现有技术所述现有测定方法测定副肿瘤综合征14项标志性抗体所存在的问题，本发明提供一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法，该检测方法将微球分析技术和流式分析技术相结合，对副肿瘤综合征相关的Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项标志性抗体进行联合检测，大大缩短了检测所需操作时间的同时，提高了检测方法对相关标志性抗体检测的灵敏度和特异性，且可实现对检测样本指标的多参数分析，相比于酶联免疫吸附的一一测定方法，大大提高了对相关抗体的检测效率及检测结果的准确性。

本发明采用的技术方案如下：一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法，所述检测方法将微球与流式分析技术相结合，针对Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体进行联合检测，具体如下：

1)准备14种微球，分别将14种微球进行激活；

2)准备与14种副肿瘤综合征相关标志性抗体相对应的14种捕获抗体，所述捕获抗体相当于抗原，用于与血清中的待检测标志性抗体进行抗原抗体免疫结合反应；

3)将步骤1)激活后的微球与步骤2)中准备好的捕获抗体分别进行偶联反应；

4)对步骤3)偶联反应完成后的微球进行封闭处理，用封闭液对微球上未结合捕获抗体的位点进行封闭；

5)将14种分别进行封闭处理完成后的微球进行混合，形成一个包含有14种偶联有不同捕获抗体的微球的混合反应体系，该混合体系可同时对血清中的待检标志性抗体进行检测；

6)将血清样本加入步骤5)中的混合反应体系中，偶联在微球上的捕获抗体会与血清中的待检测标志性抗体发生抗原抗体免疫结合反应，结合反应完成后，在微球上会形成待测标志抗体与捕获抗体相结合的抗原抗体复合物；

7)步骤6)反应完成后，清洗掉不反应的血清蛋白，加入过量的FITC标记的羊抗鼠IgG进行免疫荧光反应，用于对血清样本中待检测标志抗体的荧光定量分析；

8)对步骤7)中免疫荧光反应完成后得到的微球，通过流式细胞仪对微球进行检测分析。

步骤1)中所述微球是一种表面含有羧基并包埋了有机荧光分子的聚苯乙烯微球，所述粒径均一，可从相关的生物制品公司直接购买，所述微球规格约1.25×10

步骤1)中通过微球激活缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐及硫化N-羟基琥珀酰亚胺对微球进行激活，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺的浓度均为50mg/mL，可以从市场进行直接购买。

具体地，步骤1)中所述对微球的激活方法具体为：取微球原液，离心去上清，加入微球洗涤缓冲液进行洗涤，离心取上清，加入微球激活缓冲液，重悬，混匀，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐和硫化N-羟基琥珀酰亚胺，室温避光摇动，加入1×PBS缓冲液，混匀，离心去上清，加入1×PBS缓冲液，重悬，混匀，即得到激活后的微球，对微球进行激活中所使用的微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成，所使用的微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH

步骤2)中所述捕获抗体分别为：鼠抗人Hu单克隆抗体、鼠抗人Yo单克隆抗体、鼠抗人Ri单克隆抗体、鼠抗人CV2单克隆抗体、鼠抗人Amphiphysin单克隆抗体、鼠抗人Ma1单克隆抗体、鼠抗人Ma2单克隆抗体、鼠抗人SOX1单克隆抗体、鼠抗人Tr单克隆抗体、鼠抗人Zic4单克隆抗体、鼠抗人Titin单克隆抗体、鼠抗人Recoverin单克隆抗体、鼠抗人PKCγ单克隆抗体、鼠抗人GAD65单克隆抗体，以上捕获抗体均可在相关生物制品公司直接购买。

步骤4)中对微球进行封闭所使用的封闭液通过1×PBS缓冲液、牛血清白蛋白及叠氮化钠配制而成，所述牛血清白蛋白与1×PBS缓冲液之间的配制浓度为10g/l、所述叠氮化钠与1×PBS缓冲液之间配制浓度为0.5g/l，向pH值7.4的1×PBS中分别加入相应的牛血清白蛋白和叠氮化钠，即得到封闭液。

本发明提供的一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法的检测原理为：所述检测方法针对Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体，通过14种具有不同荧光染料标记的微球进行一次性联合检测，激活后的14种微球分别与14种捕获抗体对应偶联，偶联反应完成后，每一种微球均偶联上一种对应的捕获抗体，偶联在微球上的捕获抗体分别与血清样本的待检测标志性抗体进行抗原抗体免疫结合反应，将血清样本中的待检测抗体结合在相应的偶联有捕获抗体的微球上，形成微球-捕获抗体-待检测抗体体系，后续加入的FITC标记的羊抗鼠IgG，会与微球上形成的抗原抗体复合物相结合，流式细胞仪对完成反应后的血清样本进行检测时，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把各种颜色的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法，该检测方法首次将微球与流式分析技术相结合，针对Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体实现了联合检测；

(2)利用该检测方法对Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体进行测定，大大缩短了检测所需操作时间的同时，提高了检测方法对相关标志性抗体检测的灵敏度和特异性，且可实现对检测样本指标的多参数分析，大大提高了对相关抗体的检测效率及检测结果的准确性；

(3)在该检测方法中，因为将14种具有不同荧光颜色的微球放在了同一个反应体系内进行检测，可一次同时检测多种生理病理指标，对于一次需要检测多种抗体而言，该检测方法与传统逐个检测的方式在效率上有很大的不同。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。

一种副肿瘤综合征相关标志性抗体的检测方法，所述检测方法将微球与流式分析技术相结合，针对Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65等14项副肿瘤综合征相关标志性抗体进行联合检测，具体如下：

1)从市场直接购买14种不同颜色的微球，即微球1、微球2、微球3、微球4、微球5、微球6、微球7、微球8、微球9、微球10、微球11、微球12、微球13、微球14，所购买的微球原液规格约1.25×107个/mL，分别将14种微球进行激活，激活操作方法如下：1)取其中一种购买的微球原液2500μL于离心管中，10000r/min，离心10min，弃上清；2)向弃上清的离心管中加入2500μL的微球洗涤缓冲液，微球洗涤缓冲液由95％pH值7.4的1×PBS和5％Tween-20混合配制而成，漩涡震荡10秒，超声清洗10秒，洗涤后，10000r/min，离心10min，弃上清；3)向弃上清的离心管中加入2500μL的微球激活缓冲液，微球激活缓冲液为PH值6.2的0.1mol/L的NaH

2)从市场直接购买与14种副肿瘤综合征相关标志性抗体相对应的14种捕获抗体，14种捕获抗体分别为：鼠抗人Hu单克隆抗体、鼠抗人Yo单克隆抗体、鼠抗人Ri单克隆抗体、鼠抗人CV2单克隆抗体、鼠抗人Amphiphysin单克隆抗体、鼠抗人Ma1单克隆抗体、鼠抗人Ma2单克隆抗体、鼠抗人SOX1单克隆抗体、鼠抗人Tr单克隆抗体、鼠抗人Zic4单克隆抗体、鼠抗人Titin单克隆抗体、鼠抗人Recoverin单克隆抗体、鼠抗人PKCγ单克隆抗体、鼠抗人GAD65单克隆抗体，所购买的捕获抗体的初始浓度均为0.2mg/ml，

3)取100μL购买的捕获抗体原液加入200μL激活后的微球中，用1×PBS调节最终体积至800μL，偶联反应2h，15000r/min，离心5min，去上清，将偶联后的微球重悬于800μL1×PBS缓冲液中，即完成微球与捕获抗体的偶联过程，14种微球与14种捕获抗体均采用上述方法进行偶联反应；

4)对完成偶联捕获抗体后的微球进行封闭处理，用封闭液对微球上未结合捕获抗体的位点进行封闭：1)封闭液的制备：向10LpH值7.4的1×PBS中分别加入100g的牛血清白蛋白和5g叠氮化钠，即得到10L封闭液；封闭方法如下：对偶联后的微球缓冲液15000转/分，离心5min，弃上清，向离心后的微球中加入1500μL微球封闭缓冲液，15000转/分，离心5min，去上清，后再将微球重悬于800μL微球封闭缓冲液，即完成封闭过程，最终得到：微球1-鼠抗人Hu单克隆抗体、微球2-鼠抗人Yo单克隆抗体、微球3-鼠抗人Ri单克隆抗体、微球4-鼠抗人CV2单克隆抗体、微球5-鼠抗人Amphiphysin单克隆抗体、微球6-鼠抗人Ma1单克隆抗体、微球7-鼠抗人Ma2单克隆抗体、微球8-鼠抗人SOX1单克隆抗体、微球9-鼠抗人Tr单克隆抗体、微球10-鼠抗人Zic4单克隆抗体、微球11-鼠抗人Titin单克隆抗体、微球12-鼠抗人Recoverin单克隆抗体、微球13-鼠抗人PKCγ单克隆抗体、微球14-鼠抗人GAD65单克隆抗体共14种分别偶联捕获抗体的微球；

5)将步骤4)中得到的14种微球各取200μL进行混合，形成一个包含有14种偶联有不同捕获抗体的微球的混合反应体系共2800μL，该混合体系可同时对血清中的待检标志性抗体进行检测；

6)将预先准备好的血清样本200μL加入步骤5)中的混合反应体系中，偶联在微球上的捕获抗体会与血清中的待检测标志性抗体发生抗原抗体免疫结合反应，结合反应完成后，在微球上会形成待测标志抗体与捕获抗体相结合的抗原抗体复合物，最终得到：微球1-鼠抗人Hu单克隆抗体-Hu抗体、微球2-鼠抗人Yo单克隆抗体-Yo抗体、微球3-鼠抗人Ri单克隆抗体-Ri抗体、微球4-鼠抗人CV2单克隆抗体-CV2抗体、微球5-鼠抗人Amphiphysin单克隆抗体-Amphiphysin抗体、微球6-鼠抗人Ma1单克隆抗体-Ma1抗体、微球7-鼠抗人Ma2单克隆抗体-Ma2抗体、微球8-鼠抗人SOX1单克隆抗体-SOX1抗体、微球9-鼠抗人Tr单克隆抗体-Tr抗体、微球10-鼠抗人Zic4单克隆抗体-Zic4抗体、微球11-鼠抗人Titin单克隆抗体-Titin抗体、微球12-鼠抗人Recoverin单克隆抗体-Recoverin抗体、微球13-鼠抗人PKCγ单克隆抗体-PKCγ抗体、微球14-鼠抗人GAD65单克隆抗体-GAD65抗体；

为了后续对待检测的标志抗体进行定量分析，需要利用上述微球与血清样本同样的反应方法，开展14种待检测标志抗体的标准品的系列对照实验，14种待检测的标志抗体对应的标准品可直接在市场进行购买；

7)步骤6)反应完成后，清洗掉不反应的血清蛋白，该步骤中所使用的清洗方法可采用微球激活过程中的洗涤方法，先对抗原抗体免疫结合反应完成后的反应液进行离心，再将离心后的微球重悬于微球洗涤缓冲液中，洗涤后，再将微球重悬于2500μL的1×PBS缓冲液中，加入过量的FITC标记的羊抗鼠IgG进行免疫荧光反应，用于对血清样本中待检测标志抗体的荧光定量分析；

8)对步骤7)中免疫荧光反应完成后得到的微球，通过流式细胞仪对微球进行检测分析：流式细胞仪进行检测时，每个微球相当于一个细胞，顺次高速通过流式细胞仪的检测区，微球本身(FL2，FL3)和FITC标记(FL1)的荧光和散射光将被相应的检测系统检测和记录下来，根据FL2和FL3的强度可把不同颜色的微球分开，而根据FL1的平均强度，可以求得相应待检测标志抗体的浓度。

以上为一份血清样本中14项副肿瘤综合征相关标志性抗体的联合检测方法，可根据血清样本的数量参照上述进行具体实施。

效果实施例

为了进一步验证本发明提供的针对副肿瘤综合征相关的14项标志性抗体Hu、Yo、Ri、CV2、Amphiphysin、Ma1、Ma2、SOX1、Tr、Zic4、Titin、Recoverin、PKCγ、GAD65进行联合检测的可行性和有效性，将依照上述具体实施方式中的实施步骤对14种副肿瘤综合征相关标志性抗体进行联合检测的结果与目前临床上常规使用的酶联免疫吸附测定方法的结果进行对比，该对比例采用了20个血清样品进行比较，以±s(pg/mL)表示，结果如下表所示：

表1本发明提供的联合检测方法与Elisa测定方法测定结果对比表

上述检测结果表明，本发明所提供的针对副肿瘤综合征相关的14项标志性抗体进行联合检测的方法与目前临床常规使用的酶联免疫吸附测定方法对相关抗体进行测定的方法相比较，首先，本发明提供的联合检测方法从结果看来没有显著性差异，表明本发明提供的技术方案具备有效性和可行性；其次，从所测定得到的结果数字之间的波动性来看，本发明所提供的检测方法测定得到的数据预数据之间的波动性更小，结果可重复性较好，也进一步说明本发明所提供的技术方案对14种副肿瘤综合征相关标志性抗体进行联合检测的精确度和灵敏度较高。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。