针对禽流感病毒H5亚型的免疫原性组合物

摘要

本发明涉及兽医学领域。本发明提供了免疫原性组合物，其包含禽流感病毒H5亚型的血凝素蛋白。还提供的是区别由AIV自然感染的动物与用本发明的免疫原性组合物接种疫苗的动物的方法。本发明的免疫原性组合物可以对家禽提供更广泛、更有效、持久和早期发作的保护。

说明书

技术领域

本发明涉及兽医学领域，具体地涉及针对禽流感病毒H5亚型的免疫原性组合物。

背景技术

禽流感病毒(AIV)属于甲型流感病毒的类型，并且它天然存在于全世界的野生水鸟中，并且可以感染驯养家禽和其它鸟类包括哺乳动物。甲型流感病毒基于病毒的表面上的两种蛋白质分成亚型：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。存在18种已知的HA亚型和11种已知的NA亚型。HA和NA蛋白的许多不同组合是可能的。例如，“H5N1病毒”意指该病毒具有HA亚型5和NA亚型1。

存在九种已知的H5病毒亚型(H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N5、H5N6、H5N7、H5N8和H5N9，在本文中被称为"H5Nx")。全世界在野生鸟类和家禽中鉴定的大多数H5病毒是低致病性禽流感病毒，但一些含有H5的病毒属于高致病性禽流感(HPAI)病毒。H5Nx病毒快速进化，并且导致不同进化枝之间相当大的抗原变异，其揭示了不同H5谱系中的进化关系。用HPAI病毒感染家禽可以引起具有高死亡率的严重疾病。

对于具有地方流行性H5Nx病毒的国家，已使用疫苗接种来控制该疾病。最常见的AIV疫苗是含有灭活全病毒的疫苗(灭活疫苗)，其通过将整个病毒灭活并用适当的佐剂乳化进行制备。然而，灭活疫苗不能提供针对不同进化枝的广泛保护。由于AIV的快速进化，人们必须不断地开发针对不同进化枝的新疫苗。此外，灭活疫苗的生产需要大量的活AIV，并且因此生物安全性是严重的问题。

HA蛋白是甲型流感病毒的受体结合和膜融合糖蛋白。已知HA蛋白能够引发保护性抗体，并且因此研究人员变得对基于重组HA蛋白的亚单位疫苗的开发感兴趣。WO2007/019094公开了在受体结合位点中包含氨基酸取代的HA分子，与在其受体结合位点中缺少氨基酸取代的HA分子相比，所述氨基酸取代使得HA分子更具抗原性。WO2008/052173公开了包含一些氨基酸突变的禽流感病毒H5亚型的血凝素蛋白(下文被称为“AIV H5亚型的HA蛋白”或“H5 HA蛋白”)，并且包含佐剂化的H5 HA蛋白的疫苗可以提供免于由甲型流感病毒引起的临床疾病的预防。然而，上述公开内容与对不同进化枝的甲型流感病毒的更广泛保护无关。

WO2013/148164公开了基于人H5N1和猪H1N1流感分离株，用于生成优化的H5N1和H1N1流感HA多肽的方法。还制备了包含优化的流感HA多肽的流感病毒样颗粒(VLP)。实验结果显示了，VLP可以在小鼠中引发可以识别两种不同进化枝的流感病毒的抗体应答，但保护效率仅为40-60％。

需要开发疫苗，其可以对家禽提供针对AIV H5亚型更广泛、更有效、持久和早期发作的保护。

发明内容

本发明提供了免疫原性组合物，其包含禽流感病毒H5亚型的血凝素蛋白，其中所述血凝素蛋白包含：(a)氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S；以及(b)选自以下的一个或多个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I；其中编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸残基。

本发明还提供了制备免疫原性组合物的方法，其包括：(i)培养含有表达禽流感病毒H5亚型的血凝素蛋白的表达载体的细胞；并且(ii)收获整个细胞培养物；其中所述血凝素蛋白包含：(a)氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S；以及(b)选自以下的一个或多个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I；其中编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸残基。

还提供的是本发明的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由禽流感病毒，优选由H5Nx引起的感染。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1、H5N2和/或H5N6。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1。在一个实施方案中，H5Nx是H5N2。在一个实施方案中，H5Nx是H5N6。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1和H5N2。在一个实施方案中，H5Nx是H5N2和H5N6。

还提供的是区别由AIV自然感染的动物与用本发明的免疫原性组合物接种疫苗的动物的方法。

本发明的免疫原性组合物可以对家禽提供更广泛、更有效、持久和早期发作的保护。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物对家禽提供更广泛的保护。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物对家禽提供更有效的保护。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物对家禽提供持久的保护。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物对家禽提供早期发作的保护。

具体实施方式

在一个方面，本发明提供了包含H5 HA蛋白的免疫原性组合物，其中所述H5 HA蛋白包含：(a)氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S；以及(b)选自以下的一个或多个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I；其中编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸残基。

如本文使用的，术语“免疫原性组合物”，也称为“疫苗”，指包含引发针对组合物的免疫应答的至少一种抗原的组合物。宿主展示治疗性或保护性免疫应答，使得对新感染的抗性得到增强和/或临床体征的严重程度得到降低。

H5 HA蛋白的氨基酸序列通过一系列HA氨基酸序列比对、共有氨基酸序列的后续生成、以及在每个位置处最常见残基的分析进行设计。如本文使用的，术语“本发明的血凝素蛋白”、“AIV H5亚型的HA蛋白”和“H5 HA蛋白”是可互换的。

如本文使用的，SEQ ID NO:1代表毒株A/duck/China/E319-2/03的HA蛋白的氨基酸序列，但其缺少氨基末端的信号肽(毒株A/duck/China/E319-2/03的HA蛋白的氨基酸序列也公开于WO2008/052173中)。SEQ ID NO:1用作HA蛋白的标准序列，用于确定本发明的HA蛋白的氨基酸位置。

如本文使用的，本发明的HA蛋白的氨基酸位置编号指如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸位置。例如，名称“120N或120S”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置120的位置处的N或S。“155N”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置155的位置处的N。“223N或223S”意指在对应于SEQID NO:1的位置223的位置处的N或S。“61D”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置61的位置处的D。“87I”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置87的位置处的I。“99A”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置99的位置处的A。“102A”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置102的位置处的A。“110N”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置110的位置处的N。“136S”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置136的位置处的S。“140D”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置140的位置处的D。“149S”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置149的位置处的S。“156T”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置156的位置处的T。“157P”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置157的位置处的P。“170N”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置170的位置处的N。“172T”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置172的位置处的T。“178R”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置178的位置处的R。“190V”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置190的位置处的V。“191L”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置191的位置处的L。“200A”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置200的位置处的A。“226V”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置226的位置处的V。“243D”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置243的位置处的D。“268Y”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置268的位置处的Y。“279A”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置279的位置处的A。“298I”意指在对应于SEQ ID NO:1的位置298的位置处的I。用于确定氨基酸位置的方法是本领域已知的，包括但不限于通过使用BLAST程序进行的氨基酸比对。

在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白包含选自以下的任何一个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含选自以下的两个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含选自以下的三个、四个、五个、……或所有的氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I。来自天然存在的AIV的整个HA蛋白的长度为约568个氨基酸残基，并且氨基酸514上游的所有氨基酸残基都位于病毒表面上。本发明的上述氨基酸位点被鉴定为位于HA蛋白的氨基酸60-300的区域内，所述区域被认为包含大部分免疫原性表位。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白进一步包含氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含氨基酸残基120N、155N和223N。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含氨基酸残基120N、155N和223S。在一个实施方案中，本发明的H5HA蛋白包含氨基酸残基120S、155N和223N。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含氨基酸残基120S、155N和223S。

在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白包含氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120N、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223N、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120S、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223S、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120S、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223N、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120N、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223S、226V、243D、268Y、279A和298I。

在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白包含如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白包含如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白由如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，本发明的H5 HA蛋白由如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列组成。

如本文使用的，术语“本发明的H5 HA蛋白”可以是H5 HA蛋白的分离形式，或H5 HA蛋白的非分离形式，例如包含在细胞培养物中的H5 HA蛋白。在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白是H5 HA蛋白的非分离形式。在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白是H5 HA蛋白的分离形式。

在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白通过表达编码H5 HA蛋白的核酸分子进行制备。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以进一步进行密码子优化，用于细胞中的表达。如本文使用的，术语“密码子优化的核酸分子”意指这样的核酸分子，其已进行选择，使得密码子对于在特定系统(例如特定物种或物种组)中的表达是最佳的。密码子优化并不改变编码蛋白质的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸分子对于在昆虫细胞中的表达进行密码子优化。

在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含如SEQ ID NO:10中所示的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸分子由如SEQ ID NO:10中所示的核酸序列组成。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含如SEQ ID NO:11中所示的核酸序列。在一个实施方案中，本发明的核酸分子由如SEQ ID NO:11中所示的核酸序列组成。

本发明的核酸分子可以包含在表达载体中。在一个实施方案中，本发明的表达载体是病毒、质粒、粘粒或噬菌体。载体可以由DNA或RNA，优选DNA组成。

尤其是关于DNA表达载体，载体和用于制造和/或使用载体(或重组体)用于表达的方法可以是或类似于以下中公开的方法：美国专利号4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、5,942,235、5,364,773、5,762,938、5,770,212、5,942,235、382,425，PCT公开WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti，"Applications of pox virus vectors to vaccination:An update，"PNAS USA93:11349-11353，1996年10月；Moss，"Genetically engineered poxviruses for recombinant geneexpression，vaccination，and safety,"PNAS USA93:11341-11348，October 1996；Smith等人，美国专利号4,745,051(重组杆状病毒)；Richardson，C.D.(编辑)，Methods inMolecular Biology 39，"Baculovirus Expression Protocols"(1995Humana PressInc.)；Smith等人，"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infectedwith a Baculovirus Expression Vector"，Molecular and Cellular Biology，December，1983年12月，第3卷，第12期，第2156-2165页；Pennock等人，"Strong andRegulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells witha Baculovirus vector，"Molecular and Cellular Biology1984年3月，第4卷，第3期，第406页；EPA0 370 573；于1986年10月16日提交的美国申请号920,197；EP专利公开号265785；美国专利号4,769,331(重组疱疹病毒)；Roizman，"The function of herpessimplex virus genes:A primer for genetic engineering of novel vectors,"PNASUSA93:11307-11312，1996年10月；Andreansky等人，"The application of geneticallyengineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental braintumors,"PNAS USA93:11313-11318，1996年10月；Robertson等人，"Epstein-Barr virusvectors for gene delivery to B lymphocytes"，PNAS USA93:11334-11340，1996年10月；Frolov等人，"Alphavirus-based expression vectors:Strategies andapplications,"PNAS USA93:11371-11377，1996年10月；Kitson等人，J.Virol.65，3068-3075，1991；美国专利号5,591,439，5,552,143；WO 98/00166；两者均于1996年7月3日提交的许可的美国申请序列号08/675,556和08/675,566(重组腺病毒)；Grunhaus等人，1992，"Adenovirus as cloning vectors,"Seminars in Virology(第3卷)第237-52页，1993；Ballay等人EMBO Journal，第4卷，第3861-65页，Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月；Prevec等人，J.Gen Virol.70，42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994)，J.Biol.Chem.269，2550-2561，Science，259:1745-49，1993；以及McClements等人，"Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B，alone or in combination，induces protective immunity in animal models ofherpes simplex virus-2disease"，PNAS USA 93:11414-11420，1996年10月；以及美国专利号5,591,639、5,589,466和5,580,859，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人，Nature，以及Furth等人，Analytical Biochemistry。还参见WO 98/33510；Ju等人，Diabetologia，41:736-739，1998(慢病毒表达载体)；Sanford等人，美国专利号4,945,050；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人，Seminars in Immunology第9卷，第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人，美国专利号4,394,448(将DNA插入活细胞内的方法)；McCormick等人，美国专利号5,677,178(致细胞病变病毒的使用)；以及美国专利号5,928,913(用于基因递送的载体)；以及本文引用的其它文件。

在一个实施方案中，本发明的表达载体是病毒载体。

在一个实施方案中，本发明的表达载体是疱疹病毒，例如奥耶斯基氏病(Aujeszky'sdisease)病毒、马疱疹病毒或单纯疱疹病毒。在一个实施方案中，本发明的表达载体是腺病毒，例如猪腺病毒。在一个实施方案中，本发明的表达载体是痘病毒，例如牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒或猪痘病毒。

在一个实施方案中，病毒载体是重组杆状病毒。在一个实施方案中，本发明的重组杆状病毒衍生自BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，Calif.)。在一个实施方案中，本发明的重组杆状病毒衍生自Sapphire

在本发明的免疫原性组合物的一个实施方案中，H5 HA蛋白包含在细胞培养物中。本发明的细胞培养物可以是从细胞培养过程中获得的完整细胞培养物，包括细胞和培养基，或含有HA蛋白的细胞培养物的一部分，例如通过过滤或任何其它分离步骤获得的含有HA蛋白的细胞培养物的一部分。

在一个实施方案中，细胞培养物包含H5 HA蛋白，其中所述H5 HA蛋白包含：(a)氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S；以及(b)选自以下的一个或多个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I；其中编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸残基。在一个实施方案中，细胞培养物包含H5 HA蛋白，其中所述H5 HA蛋白包含氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120N、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223N、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，细胞培养物包含H5 HA蛋白，其中所述H5 HA蛋白包含如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，细胞培养物包含H5 HA蛋白，其中所述H5 HA蛋白包含如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。

本发明的免疫原性组合物进一步包含佐剂。在一个实施方案中，免疫原性组合物在佐剂中进行配制。如本文使用的“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL)、油包水乳状液、水包油乳状液、水包油包水乳状液。乳状液可以特别基于轻液体石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油例如角鲨烷或角鲨烯；起因于烯烃特别是异丁烯或癸烯寡聚的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳状液。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(它们都是任选乙氧基化的)，和聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter等人，The Theoryand Practical Application of Adjuvants(编辑Stewart-Tull，D.E.S.)，JohnWiley andSons，NY，第51-94页(1995)，以及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。示例性的佐剂是通过M.Powell和M.Newman编辑的“Vaccine Design，The Subunit and AdjuvantApproach”，Plenum Press，1995的第147页上描述的SPT乳状液，以及同一本书的第183页上描述的乳状液MF59。

佐剂的进一步实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是尤其由糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物通过术语卡波姆(Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)已知。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了由聚羟基化化合物交联的此类丙烯酸聚合物，所述聚羟基化化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，至少三个羟基的氢原子替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团。优选原子团是含有2–4个碳原子的原子团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯属不饱和基团。不饱和原子团自身可以含有其他取代基例如甲基。在名称卡波普(BF Goodrich，Ohio，USA)下销售的产品是特别合适的。它们由烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。在它们中，可以提及卡波普974P、934P和971P。最优选的是卡巴普971P的使用。在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物中，有其为马来酸酐和乙烯的共聚物的共聚物EMA(Monsanto)。这些聚合物在水中的溶解导致酸溶液，所述酸溶液将优选中和至生理pH，以便得到免疫原性、免疫或疫苗组合物自身将掺入其内的佐剂溶液。

进一步的合适佐剂尤其包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组体或其他形式)、霍乱毒素、IMS 1314或胞壁酰二肽、或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物或内源性细胞因子释放的刺激剂。

在一个实施方案中，将免疫原性组合物与合适的佐剂配制成油包水乳状液。佐剂可以包含油和表面活性剂。在一个实施方案中，佐剂是MONTANIDE

惊讶地发现，本发明的免疫原性组合物可以导致对家禽的更广泛保护。如本文使用的，术语“对家禽的更广泛保护”包括针对不同AIV H5亚型的广泛保护。此类亚型包括H5N1、H5N2和/或H5N6，或根据一个进一步的实施方案，由H5N1、H5N2和/或H5N6组成。根据一个进一步的实施方案，术语“对家禽的更广泛保护”还包括针对AIV H5亚型的不同进化枝的保护。此类AIV H5进化枝包括2.3.4.4、2.3.2.1、2.3.2.1d、2.3.4.4d和/或7.2，或根据一个进一步的实施方案，由2.3.4.4、2.3.2.1、2.3.2.1d、2.3.4.4d和/或7.2组成。

另外，由本发明的免疫原性组合物提供的保护具有早期发作和长效期。如本文使用的，术语“早期发作期”或“保护的早期发作”意指在接种疫苗7天后可获得的针对传染性AIV H5病毒的部分保护。在接种疫苗后14天可获得针对传染性AIV H5病毒的完全保护。术语“长效期”或“对家禽的长效保护”包括在疫苗接种之后至少42天的保护期。

本发明的免疫原性组合物可以对不同日龄，甚至新生禽，即生命第一天的禽类提供保护。本发明的免疫原性组合物不必局限于某种施用途径，并且本发明的免疫原性组合物的保护功效不受不同施用途径的影响。

在另一个方面，本发明还提供了制备免疫原性组合物的方法，其包括：(i)培养含有能够表达H5 HA蛋白的表达载体的细胞；并且(ii)收获H5 HA蛋白或包含H5 HA蛋白的整个细胞培养物，其中所述H5 HA蛋白包含：(a)氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S；以及(b)选自以下的一个或多个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I；其中编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸残基。

在本发明的方法的一个实施方案中，H5 HA蛋白包含氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120N、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223N、226V、243D、268Y、279A和298I。在一个实施方案中，H5 HA蛋白包含如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，H5 HA蛋白包含如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。

在本发明的方法的一个实施方案中，表达载体是包含本发明的核酸分子的重组杆状病毒。在一个实施方案中，本发明的核酸分子在SEQ ID NO:10中示出。在一个实施方案中，本发明的核酸分子在SEQ ID NO:11中示出。在一个实施方案中，重组杆状病毒衍生自以商标Sapphire

在本发明的方法的一个实施方案中，该方法包括制备包含本发明的核酸分子的重组杆状病毒的步骤。在一个实施方案中，本发明的核酸分子在SEQ ID NO:10中示出。在一个实施方案中，本发明的核酸分子在SEQ ID NO:11中示出。在一个实施方案中，重组杆状病毒衍生自以商标Sapphire

在本发明的方法的一个实施方案中，该方法包括用本发明的重组杆状病毒感染细胞的步骤。在一个实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一个实施方案中，昆虫细胞是SF+细胞。在一个实施方案中，SF+细胞是由Protein Sciences Corporation(Meriden，CT)销售的商业产品。

在本发明的方法的一个实施方案中，该方法包括制备包含本发明的核酸分子的重组杆状病毒，并且用该重组杆状病毒感染昆虫细胞。在一个实施方案中，重组杆状病毒衍生自以商标Sapphire

在本发明的方法的一个实施方案中，该方法包括：(i)制备包含本发明的核酸分子的重组杆状病毒；(ii)用该重组杆状病毒感染昆虫细胞；(iii)在培养基中培养昆虫细胞；并且(iv)收获本发明的H5 HA蛋白或包含本发明的H5 HA蛋白的整个细胞培养物。在一个实施方案中，重组杆状病毒衍生自以商标Sapphire

在本发明的方法的一个实施方案中，用于培养本发明的细胞的培养基由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，培养基是无血清昆虫细胞培养基。在一个实施方案中，培养基是Ex-CELL420(用于昆虫细胞的

在本发明的方法的一个实施方案中，在适合于H5 HA蛋白表达的条件下培养昆虫细胞。在一个实施方案中，昆虫细胞在长达十天，优选约两天至约十天，更优选约四天至约九天，且甚至更优选约五天至约八天的时期内进行温育。在一个实施方案中，适合于培养昆虫细胞的条件包括约22-32℃，优选约24-30℃，更优选约25-29℃，甚至更优选约26-28℃，且最优选约27℃的温度。

在本发明的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括灭活本发明的细胞培养物的步骤。任何常规的灭活方法都可以用于本发明的目的，包括但不限于化学和/或物理处理。

在一个实施方案中，灭活步骤包括添加环化二乙烯亚胺(BEI)，优选浓度为约1至约20mM，优选约2至约10mM，更优选约5mM或10mM。在一个实施方案中，灭活步骤包括添加2-溴乙撑胺氢溴酸盐的溶液，所述2-溴乙撑胺氢溴酸盐在NaOH中将环化以形成BEI。

在一个实施方案中，灭活步骤在25-40℃之间，优选在28-39℃之间，更优选在30-39℃之间，更优选在35-39℃之间进行。在一个实施方案中，灭活步骤进行24-72小时，优选30-72小时，更优选48-72小时。一般而言，进行灭活步骤直到无法检测到病毒载体的复制。

在本发明的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括在灭活步骤后的中和步骤的步骤。中和步骤包括加入等量的试剂，所述试剂中和溶液内的灭活剂。在一个实施方案中，灭活剂是BEI。在一个实施方案中，中和剂是硫代硫酸钠。在一个实施方案中，当灭活剂是BEI时，加入等量的硫代硫酸钠。例如，在将BEI加入至5mM的最终浓度的情况下，添加1.0M硫代硫酸钠溶液，以给出5mM的最终最小浓度，以中和任何残留的BEI。在一个实施方案中，当灭活剂是BEI时，中和步骤包括添加硫代硫酸钠溶液至1至20mM，优选2至10mM，更优选5mM或10mM的最终浓度。在一个实施方案中，中和剂在灭活步骤完成后加入，这意味着无法检测到病毒载体的复制。在一个实施方案中，中和剂在灭活步骤进行24小时后加入。在一个实施方案中，中和剂在灭活步骤进行30小时后加入。在一个实施方案中，中和剂在灭活步骤进行48小时后加入。在一个实施方案中，中和剂在灭活步骤进行72小时后加入。

本发明的免疫原性组合物中包含的H5 HA蛋白的量可以通过使用本领域已知的任何常规方法进行定量，所述方法例如血凝测定(参见OIE Terrestrial Manual 2015，第2.3.1和2.3.2章，Avian Influenza(infection with avian influenza viruses)。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物中包含的H5 HA蛋白的量通过用鸡红血细胞的血凝测定进行确定，并且H5 HA蛋白的量可以表示为血凝素测定单位(HAU)。

术语“HAU”指用于凝集红血细胞(RBC)的活性单位，并且1HAU的血凝素蛋白指当血凝素与RBC混合时引起凝集的最小单位。HAU可以通过血凝滴度测定进行评价。在该测定中，使含有血凝素蛋白的样品经受在96孔板中的两倍系列稀释，并且将RBC溶液加入孔中。HAU的值是导致RBC完全凝集的样品的最大稀释倍数。例如，如果25μl样品的最大稀释倍数为256，则样品中包含的血凝素蛋白的量为256HAU/25μl。

为了根据本发明引发有效的免疫应答，本发明的免疫原性组合物中包含的H5 HA蛋白的量为至少32HAU/剂量。因此，本发明的免疫原性组合物包含至少32HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少64HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少128HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少256HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。

本领域技术人员可以仅通过常规测试来确定H5 HA蛋白的量的上限。一般而言，由技术人员使用的上限在约1024HAU/剂量的范围内，但也可以更高。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少32至1024HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少64至1024HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少128至1024HAU/剂量的本发明的H5 HA蛋白。在一个进一步方面，本发明的免疫原性组合物包含至少256至1024HAU/剂量的本发明的H5HA蛋白。

与要求在生物安全等级2或3(BSL-2、BSL-3)下生产的常规全病毒灭活疫苗相比，用于生产H5 HA蛋白的上述制造方法已归类为生物安全等级1要求。

在另一个方面，本发明还提供了用于预防和/或治疗由AIV引起的感染的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的本发明的免疫原性组合物。本发明还提供了本发明的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由AIV引起的感染。

如本文使用的，术语“预防”指流感感染的临床体征的发生率或严重程度中的降低，直至包括此类临床体征的完全预防。免疫原性组合物的预防保护功效可以基于疫苗接种对象针对不同AIV进化枝的存活率进行评估。在一个实施方案中，与并未接受本发明的疫苗但暴露于感染水平的AIV的对象相比，免疫原性组合物的保护功效增加至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，更优选至少50％，还更优选至少60％，甚至更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，且最优选100％。在一个实施方案中，免疫原性组合物对于接种疫苗的对象针对不同AIV进化枝的保护效力为100％。

在一个实施方案中，有此需要的对象可以是家禽，甚至更优选鸟、鸡、鸭、火鸡等等。在一个实施方案中，对象是鸡或鸭。

在一个实施方案中，AIV是H5亚型。在一个实施方案中，AIV是H5Nx。在一个实施方案中，AIV是主要在亚洲、中东和非洲循环的HPAI H5Nx。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1、H5N2和/或H5N6。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1。在一个实施方案中，H5Nx是H5N2。在一个实施方案中，H5Nx是H5N6。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1和H5N2。在一个实施方案中，H5Nx是H5N2和H5N6。在一个实施方案中，AIV是进化枝2，优选进化枝2.3，且更优选进化枝2.3.4和2.3.2。在一个实施方案中，AIV是进化枝2.3.4.4、2.3.2.1、2.3.2.1d或2.3.4.4d。在一个实施方案中，AIV是进化枝7.2。

亚型H5N1、H5N2和/或H5N6的H5Nx是本领域众所周知的。

如本文使用的，术语“进化枝”指包括一个共同祖先的所有后代的一组生物分类群(例如物种)。A/goose/Guangdong/1/96被视为所有H5谱系病毒的祖先，并且被指定为进化枝0。这个命名法目前用于区分H5 HA基因的变体组，到目前为止，已正式鉴定了约20个不同的病毒进化枝。除进化枝0外，另外9个进化枝(1-9)基于所有保藏的序列进行描述且定义。然而，随着时间过去，大多数病毒进化枝变得灭绝。H5谱系病毒已在亚洲、中东和非洲部分地区的家禽和野生鸟类中继续循环并继续进化。导致几个不同国家的地方性传染的最主导进化枝是进化枝2病毒，并且起因于抗原漂移的进一步亚系已被描述为2级、3级、4级且甚至5级进化枝。命名法和出现的进化枝根据以下可见：WHO/OIE/FAO.Continuing progresstowards a unified nomenclature for the highly pathogenic H5N1 avian influenzaviruses:divergence of clade 2.2viruses.Influenza Other RespirationViruses.Letter.2009；3:59–62；WHO/OIE/FAO.Continued evolution of highlypathogenic avian influenza A(H5N1):updated nomenclature.Influenza OtherRespiration Viruses 2012；6:1–5；以及WHO-OIE-FAO HNEWG.Revised and updatednomenclature for highly pathogenic avian influenza A(H5N1)viruses.InfluenzaOther Respiration Viruses2014；8:384–388。

例如，进化枝2.3.4.4的H5Nx在Lee等人，Emerging Infectious Diseases，2016；第22(7)卷，第1283-1284页，以及Lee等人，Journal Veterinary Science 2017；第(S1)卷，第269-280页中进行描述。Smith等人，Emerging Infectious Diseases，2009；第15(3)卷，第402-407页中描述的禽流感分离株A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)属于进化枝2.3.2.1。进化枝2.3.2.1的进一步H5Nx分离株，包括A/chicken/India/CL03485/2011(H5N1)或A/chicken/India/CA0302/2011(H5N1)，例如在Bhat等人，2015，MicrobialPathogenesis；第88卷，第87-93页中进行描述。2.3.2.1以及2.3.4.4的亚进化枝的进一步H5Nx，包括2.3.4.4d例如A/duck/Vietnam/HU1-1507/2014(H5N6)或A/duck/Vietnam/HU1-1151/2014(H5N6)，在Nguyen等人，2019，Scientific Reports 9；Article 7723，第1-13页中进行描述。进化枝7.2的H5Nx分离株，包括例如(A/chicken/Gansu/62012(H5N1))，例如在Liu等人，Journal of Virology 2016，第90(21)卷，第9797-9804页中进行描述且表征。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以经由皮下(S.C.)或肌内(I.M.)施用进行施用。

本发明免疫原性组合物的施用次数可以通过本领域技术人员根据实际需要进行确定。例如，对于寿命为约40-50天的白肉鸡，本发明的免疫原性组合物可以以单一剂量施用；对于寿命为约70天的黄肉鸡，本发明的免疫原性组合物可以以两个剂量施用；并且对于寿命超过一年或更长的鸡例如种鸡，本发明的免疫原性组合物可以以多重剂量施用。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物以单一剂量施用进行施用。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物以多重剂量施用进行施用，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。在一个实施方案中，两次剂量之间的间隔为约4-6周，例如4周、5周或6周。

本领域技术人员也可以根据实际需要来确定何时给予施用的第一个剂量。例如，当给鸡接种疫苗时。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可以在1日龄或以后、在7日龄或以后、在10日龄或以后、在15日龄或以后、或者在21日龄或以后进行首次施用。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物在1日龄或以后、在7日龄或以后、在10日龄或以后、在15日龄或以后、或者在21日龄或以后进行施用。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物从1日龄起、从7日龄起、从10日龄起、从15日龄起、或从21日龄起，以单次施用进行施用。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物从1日龄起，以单次施用进行施用。

在另一个方面，本发明还提供了区别由AIV自然感染的动物与用本发明的疫苗或免疫原性组合物接种疫苗的动物的方法。本发明还提供了本发明的免疫原性组合物在试剂制备中的用途，所述试剂用于区别由AIV自然感染的动物与接种疫苗的动物。

在一个实施方案中，该方法包括：a)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析动物的样品是否存在禽流感标记物，所述禽流感标记物不存在于免疫原性组合物中，但存在于自然感染的动物中，其中所述免疫测试是酶联免疫测定或酶联免疫吸附测定、或琼脂凝胶沉淀测定、或蛋白质印迹测定，b)确定样品对于禽流感标记物呈阳性还是呈阴性，并且c)将测试结果与测试动物的状态相关联，其中对于禽流感标记物呈阳性的动物是自然感染的动物，而对于禽流感标记物呈阴性的动物是用本发明的免疫原性组合物或疫苗接种疫苗的动物。

在一个实施方案中，该方法包括：a)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析动物的样品是否存在禽流感标记物，所述禽流感标记物对于免疫原性组合物特异性，但不存在于自然感染的动物中，其中所述免疫测试是酶联免疫测定或酶联免疫吸附测定，b)确定样品对于禽流感标记物呈阳性还是呈阴性，并且c)将测试结果与测试动物的状态相关联，其中对于禽流感标记物呈阳性的动物是用本发明的免疫原性组合物或疫苗接种疫苗的动物。

在一个实施方案中，动物可以是家禽，甚至更优选鸟、鸡、鸭、火鸡等等。在一个实施方案中，动物是鸡或鸭。

在一个实施方案中，AIV是H5亚型。在一个实施方案中，AIV是H5Nx。在一个实施方案中，AIV是主要在亚洲、中东和非洲循环的HPAI H5Nx。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1、H5N2和/或H5N6。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1。在一个实施方案中，H5Nx是H5N2。在一个实施方案中，H5Nx是H5N6。在一个实施方案中，H5Nx是H5N1和H5N2。在一个实施方案中，H5Nx是H5N2和H5N6。

在一个实施方案中，AIV是进化枝2，优选进化枝2.3，且更优选进化枝2.3.4和2.3.2。在一个实施方案中，AIV是进化枝2.3.4.4或2.3.2.1、2.3.2.1d或2.3.4.4d。在一个实施方案中，AIV是进化枝7.2。

用本发明的包含H5 HA蛋白的疫苗或免疫原性组合物接种疫苗的动物，仅具有针对这种特异性抗原的抗体应答，而对其它病毒组分具有阴性应答。本发明的一个进一步优点在于它有益于具有特异性ELISA的DIVA概念，用于区别受AIV感染的动物和接种疫苗的动物。

在另一个方面，本发明还提供了试剂盒，其包含本发明的H5 HA蛋白、本发明的核酸分子、载体、细胞、或疫苗或免疫原性组合物。在一个实施方案中，试剂盒可以用于对象，例如家禽，甚至更优选鸟、鸡、鸭、火鸡等等。在一个实施方案中，当给鸡接种疫苗时，本发明的H5 HA蛋白、疫苗或免疫原性组合物可以用于在1日龄或以后、在7日龄或以后、在10日龄或以后、在15日龄或以后、或者在21日龄或以后的疫苗接种。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物从1日龄起、从7日龄起、从10日龄起、从15日龄起、或从21日龄起，以单次施用进行施用。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物从1日龄起，以单次施用进行施用。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员在提交申请时通常理解的含义相同。术语的含义和范围应明确；然而，在任何潜在歧义的情况下，此处提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。在本文中，除非另有说明，否则“或”的使用指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式例如“包含”和“包含”的使用不是限制性的。本文引用的所有专利和出版物均通过引用并入本文。

除非另有说明，否则本发明的实践采用病毒学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中充分解释。参见例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第I、II和III卷，第二版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney编辑1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986)；Perbal，B.，A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；Protein purification methods–a practical approach(E.L.V.Harris和S.Angal编辑，IRL Press at Oxford University Press)；以及Handbookof Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell Scientific Publications)。

还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不预期是限制性的。必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包含复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“抗原”包含两种或更多种抗原的混合物，提及“载体”包含两种或更多种载体的混合物等等。

本文还描述了下述技术方案和本发明的部分公开内容：

1.一种包含禽流感病毒H5亚型的血凝素蛋白的免疫原性组合物，其中所述血凝素蛋白包含：

(a)氨基酸残基120N或120S、155N和223N或223S；和

(b)选自以下的一个或多个氨基酸残基：61D、87I、99A、102A、110N、136S、140D、149S、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、226V、243D、268Y、279A和298I；

其中编号参考如SEQ ID NO:1中所示的氨基酸残基。

2.技术方案1的免疫原性组合物，其中所述血凝素蛋白包含：

(a)氨基酸残基61D、87I、99A、102A、110N、120N、136S、140D、149S、155N、156T、157P、170N、172T、178R、190V、191L、200A、223N、226V、243D、268Y、279A和298I；

(b)如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；或

(c)如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。

3.技术方案1或2的免疫原性组合物，其中所述血凝素蛋白包含如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。

4.技术方案1或2的免疫原性组合物，其中所述血凝素蛋白包含如SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。

5.技术方案1-4中任一项的免疫原性组合物，其中所述血凝素蛋白包含在细胞培养物中，并且所述细胞培养物通过培养含有表达载体的细胞进行制备，所述表达载体能够表达如技术方案1-4中任一项定义的血凝素蛋白。

6.技术方案1-5中任一项的免疫原性组合物，其中所述表达载体包含编码如技术方案1-4中任一项定义的血凝素蛋白的核酸分子。

7.技术方案6的免疫原性组合物，其中所述核酸分子在SEQ ID NO:10中示出。

8.技术方案6的免疫原性组合物，其中所述核酸分子在SEQ ID NO:11中示出。

9.技术方案5-8中任一项的免疫原性组合物，其中所述表达载体是杆状病毒，并且所述细胞是昆虫细胞。

10.技术方案5-9的免疫原性组合物，其中使所述细胞培养物经受灭活步骤，优选通过二乙烯亚胺的灭活步骤。

11.技术方案5-10中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含细胞培养物的一部分或全部。

12.技术方案1-11中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。

13.技术方案12的免疫原性组合物，其中所述佐剂是油包水乳状液。

14.技术方案1-13中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物以单一剂量施用或多重剂量施用进行施用；和/或

所述免疫原性组合物进行皮下或肌内施用；和/或

所述免疫原性组合物待施用于1日龄或更大、7日龄或更大、10日龄或更大、15日龄或更大、或者21日龄或更大的动物。

15.技术方案1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物待施用于1日龄或更大、7日龄或更大、10日龄或更大、15日龄或更大、或者21日龄或更大的动物。

16.技术方案1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物待施用于从第21日龄起的动物。

17.技术方案1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物待施用于从第15日龄起的动物。

18.技术方案1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物待施用于从第7日龄起的动物。

19.技术方案1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物待施用于从第1日龄起的动物。

20.技术方案1-14中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物待施用于从第1日龄起的动物。

21.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由禽流感病毒，优选由H5Nx，更优选由H5N1、H5N2和H5N6中的一种或多种引起的感染。

22.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由H5N1禽流感病毒引起的感染。

23.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由H5N2禽流感病毒引起的感染。

24.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由H5N6禽流感病毒引起的感染。

25.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2，优选进化枝2.3，且更优选进化枝2.3.4或2.3.2的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

26.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

27.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

28.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3.4的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

29.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3.4.4的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

30.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3.4.4d的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

31.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3.2的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

32.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3.2.1的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

33.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝2.3.2.1d的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

34.技术方案1-20中任一项的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗由进化枝7.2的H5Nx禽流感病毒引起的感染。

35.技术方案1-34中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物以单一剂量施用进行施用。

36.技术方案1-34中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物作为单一剂量施用进行施用，并且其中所述单一剂量有效预防和/或治疗由禽流感病毒引起的感染。

37.技术方案1-34中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物作为单一剂量施用进行施用，并且其中所述单一剂量有效预防和/或治疗由H5N1、H5N2和H5N6中的一种或多种引起的感染。

38.技术方案1-34中任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物作为单一剂量施用进行施用，并且其中所述单一剂量有效预防和/或治疗由如技术方案22-34中引用的任何H5Nx引起的感染。

39.一种区分由禽流感病毒自然感染的动物与用技术方案1-13中任一项的免疫原性组合物接种疫苗的动物的方法，其包括

(a)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析动物的样品是否存在禽流感标记物，所述禽流感标记物不存在于免疫原性组合物中，但存在于自然感染的动物中，其中所述免疫测试是酶联免疫测定或酶联免疫吸附测定，

(b)确定样品对于禽流感标记物呈阳性还是呈阴性，和

(c)将测试结果与测试动物的状态相关联，其中对于禽流感标记物呈阳性的动物是自然感染的动物，而对于禽流感标记物呈阴性的动物是用技术方案1-13中任一项的免疫原性组合物接种疫苗的动物。

40.一种区分由禽流感病毒自然感染的动物与用技术方案1-13中任一项的免疫原性组合物接种疫苗的动物的方法，其包括

(a)在免疫测试和/或基因组分析测试中分析动物的样品是否存在禽流感标记物，所述禽流感标记物对于免疫原性组合物特异性，但不存在于自然感染的动物中，其中所述免疫测试是酶联免疫测定或酶联免疫吸附测定，

(b)确定样品对于禽流感标记物呈阳性还是呈阴性，和

(c)将测试结果与测试动物的状态相关联，其中对于禽流感标记物呈阳性的动物是用技术方案1-13中任一项的免疫原性组合物接种疫苗的动物。

本发明在此详述并公开了下述序列：

SEQ ID NO:1：毒株duck/China/E319-2/03的HA蛋白的氨基酸序列，但其缺少氨基末端的信号肽。

SEQ ID NO:2：H5Con1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：H5Con3的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4：H5Con5的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5：H5Con5Mut的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6：H5Con5Mut的位置60至300的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7：H5Con1的优化核酸序列。

SEQ ID NO:8：H5Con3的优化核酸序列。

SEQ ID NO:9：H5Con5的优化核酸序列。

SEQ ID NO:10：H5ConMut的优化核酸序列。

SEQ ID NO:11：编码H5Con5Mut的位置60至300的氨基酸序列的优化核酸序列。

附图说明

下述附图构成本说明书的部分，并且被包括以进一步证实本发明的某些方面。通过参考与本文呈现的具体实施方案的详细描述的这些附图中的一个或多个，可以更好地理解本发明。

图1：根据从1996年到2012年分离的444个序列，用序贯法生成H5Con1序列。

图2：根据从1996年到2012年分离的297个特异性进化枝序列，用一轮法生成H5Con3序列。

图3：根据从2005年到2012年分离的196个序列，用一轮法生成H5Con5序列。

图4：转移质粒pVL1393-H5Con5Mut的构建。

包括下述实施例以进一步示出本文所述的发明，并且证实本发明的实施方案。本领域技术人员应该了解，在下述实施方案中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好作用的技术，并且因此可以视为构成了用于其实践的模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应了解，可以在所公开的具体实施方案中作出许多改变，并且仍获得在本发明的精神和范围内的相同或相似的结果。

为了生成H5N1流感HA共有氨基酸序列1(H5Con1)，收集并分析了从1996年到2012年，在中国分离的444个禽H5N1流感HA氨基酸序列。444个HA氨基酸序列由进化枝0、进化枝2.2、进化枝2.3.2、进化枝2.3.2.1、进化枝2.3.4、进化枝2.4、进化枝2.5、进化枝3、进化枝4、进化枝5、进化枝6、进化枝7和进化枝9组成。图1显示了从1996年到2012年分离的444个氨基酸序列生成H5Con1的序贯法。首先，生成了13个第1层共有氨基酸序列，并且每层代表个别的进化枝，使用(1)36个进化枝0序列；(2)31个进化枝2.2序列；(3)8个进化枝2.3.2；(4)49个进化枝2.3.2.1，(5)2个进化枝2.3.3；(6)210个进化枝2.3.4；(7)18个进化枝2.4；(8)6个进化枝2.5；(9)9个进化枝3；(10)5个进化枝4；(11)8个进化枝5；(12)3个进化枝6；(13)34个进化枝7；以及(14)21个进化枝9。最终共有氨基酸序列是第2层共有氨基酸序列，其通过用MEGA 5.0软件比对且分析所有13个第1层共有氨基酸序列而生成。这个最终共有氨基酸序列被指定为H5Con1(SEQ ID NO:2)。

为了生成H5N1流感HA共有氨基酸序列3(H5Con3)，收集并分析了从1996年到2012年，在中国分离的297个禽H5N1流感HA氨基酸序列。297个HA氨基酸序列仅由特异性进化枝，即进化枝2.3.2.1、进化枝2.3.4和进化枝7组成。图2显示了根据从1996年到2012年分离的特异性进化枝的297个氨基酸序列生成H5Con3的一轮法。通过用MEGA 5.0软件比对且分析(1)49个进化枝2.3.2.1，(2)214个进化枝2.3.4；以及(3)34个进化枝7，来生成最终共有氨基酸序列。这个最终共有氨基酸序列被指定为H5Con3(SEQ ID NO:3)。

为了生成H5N1流感HA共有氨基酸序列5(H5Con5)，收集并分析了从2005年到2012年，在中国分离的196个禽H5N1流感HA氨基酸序列。196个HA氨基酸序列来自进化枝0、2.2、2.3.1、2.3.2、2.3.2.1、2.3.4、2.4、7和9。图3显示了根据从2005年到2012年分离的196个氨基酸序列，生成H5Con5的一轮法。总共196个氨基酸序列用MEGA 5.0软件同时比对。最终共有氨基酸序列被指定为H5Con5(SEQ ID NO:4)。

生成H5Con1、H5Con3和H5Con5的策略概括于表1中。

表1.三个共有氨基酸序列的概括表

为了生成H5N1流感HA共有氨基酸序列5突变体(H5Con5Mut)，将两个氨基酸突变引入H5Con5的氨基酸序列中。在氨基酸位置120和223处，两个丝氨酸(S)都突变为天冬酰胺(N)，即S120N和S223N。H5Con5Mut的氨基酸序列由SEQ ID NO:5显示。

表2显示了H5Con1、H5Con3和H5Con5的共有氨基酸序列与来自流行进化枝的序列的同一性百分比。表3进一步显示了H5Con1、H5Con3和H5Con5的每个共有氨基酸序列在H5HA蛋白的一些预测抗原位点处的氨基酸使用。

表2.H5Con1、H5Con3和H5Con5的共有氨基酸序列与来自流行进化枝的序列的同一性百分比概括

表3.H5Con1、H5Con3和H5Con5的每个共有氨基酸序列在H5 HA蛋白的预测抗原位点处的氨基酸使用概括。

由表2和表3可见，与来自每个流行进化枝的序列相比，H5Con1、H5Con3和H5Con5在氨基酸序列中不同，并且在三个不同流行进化枝中，也具有抗原位点中的一些氨基酸变化。

为了对于更好的表达进行优化，通过Vector NTI软件，将如实施例1中鉴定的H5Con1、H5Con3和H5Con5的氨基酸序列各自反向推导成相应的核酸序列，并且对于在杆状病毒表达系统(Allele Biotechnology，目录ABP-BVP-10002)的昆虫细胞中的表达进行优化。H5Con1、H5Con3和H5Con5的优化核酸序列由GenScript(GenScript，NJ，USA)合成。H5Con1、H5Con3和H5Con5的优化核酸序列分别通过SEQ ID NO:7-9显示。基于H5Con5的优化核酸序列，通过使用定点诱变试剂盒(QuickChange Site-directed Mutagenesis kit，目录#200518，Agilent)，生成H5Con5Mut的优化核酸序列。H5ConMut的优化核酸序列通过SEQID NO:10显示。

将如上制备的H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的优化核酸序列各自插入杆状病毒表达系统转移载体pVL1393内，所述pVL1393包括在Sapphire

然后将pVL1393-H5Con1、pVL1393-H5Con3、pVL1393-H5Con5和pVL1393-H5Con5Mut各自与线性化的野生型Sapphire

如上制备的转染的sf9细胞在27℃培养箱中培养四天，并且收获细胞培养物的上清液。为了获得纯重组病毒，然后使收获的上清液经受噬斑纯化。进行三轮噬斑纯化，并且在第三轮噬斑纯化后，分别挑选含有rBacH5Con1、rBacH5Con3、rBacH5Con5和rBacH5Con5Mut的病毒噬斑，以便获得纯化的rBacH5Con1、rBacH5Con3、rBacH5Con5和rBacH5Con5Mut。

上述纯化的rBacH5Con1、rBacH5Con3、rBacH5Con5和rBacH5Con5Mut各自在摇瓶中的悬浮培养的昆虫细胞系SF+细胞(

分别含有H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的细胞培养悬浮液的HAU，通过血凝测定(参见OIE Terrestrial Manual 2015，第2.3.1和2.3.2章，Avian Influenza(infection with avian influenza viruses))用两倍系列稀释法进行测试。简言之，将10ml RBC(来自Southern Regent Plant，Zhejiang Province)以500g离心20分钟，并且将1体积的4％离心的RBC加入3体积的PBS内，以制备1％RBC。将25μl PBS分配到96孔板的孔1至孔11内。将25ul的每种细胞培养悬浮液加入孔1至孔11内，然后经受1:2至1:2048倍的系列稀释。将25μl 1％RBC加入所有孔中，并且在室温下温育约40分钟。

阴性孔在孔的中心作为点出现，而阳性结果在孔中形成均匀的淡红色。稀释终点对应于导致RBC完全凝集的样品的最大稀释度。结果显示了，H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut细胞培养悬浮液的HAU大于71.1HAU/25ul(对应256HAU/90ul或256HAU/剂量)。

HAU大于256/剂量的所收获的细胞培养悬浮液通过在37℃下加入10mM BEI溶液72小时，进一步经受二乙烯亚胺(BEI)处理，以便灭活杆状病毒的传染性。然后加入10mM 4℃硫代硫酸钠溶液，以中和BEI残留物。

在灭活后，再次评价细胞培养悬浮液的HAU，并且将HAU大于256/剂量的灭活细胞培养悬浮液用作活性抗原成分，以用于具有佐剂的下一个乳化程序。

将H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的免疫原性组合物制备成油包水乳状液。简言之，油包水乳状液是由连续油相和分散水相组成的两相系统，由此水相作为小液滴分散在油相中。用于制备免疫原性组合物的油相是商购可得的佐剂MONTANIDETM ISA 71R VG(由Seppic Inc制造，目录号：365187)，而水相含有H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut各自的灭活细胞培养悬浮液。对于免疫原性组合物的每个剂量(0.3ml)，将约3份水相(90ul)加入约7份油相(210ul)中，并且在室温下在低剪切速度(约11,000rpm共1分钟)下分散，然后在冰水浴中以16,000rpm的高剪切速度分散2分钟。Miccra分散器(分散机器，目录号：MiccraD-9，分散器头，目录号：DS-14/P)用于制备油包水乳状液。对于H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的每种免疫原性组合物，H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的量为至少256HAU/剂量。

SPF鸡胚蛋购自SPAFAS Jinan济南。在孵化后，随机挑选SPF鸡并保持在指定的隔离器中。在H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的交叉反应性测试中，使用Re-4到Re-8和03H5(MutK+)来评估H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的反应性测试。

Re-4至Re-8分别是针对进化枝7.2、2.3.4、2.3.2.1、7.2和2.3.4.4的全AIV(H5亚型)灭活疫苗，并且它们是来自Harbin Weike Biotechnology Development Co.，Ltd的商业产品。03H5(MutK+)是来自毒株A/duck/China/E319-2/03的杆状病毒表达的HA蛋白，另外具有下述氨基酸变化：S120N、D150N、S223N和另外的K328(参见WO2013024113A1)。通过使用与H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut相同的方法，将03H5(MutK+)配制成免疫原性组合物。

经由皮下注射，分别用一个剂量(0.3ml)的上述Re-4至Re-8和免疫原性组合物，给10只10日龄的无特殊病原体(SPF)鸡疫苗接种。接种疫苗的鸡继续保持在隔离器中。在疫苗接种前、疫苗接种后两周和疫苗接种后三周，收集个别鸡的血清样品。进一步地，通过使用血凝抑制(HI)测试(参见OIE Terrestrial Manual 2015，第2.3.4章，Avian Influenza(infection with avian influenza viruses)，测试由同一疫苗接种组内的10只鸡的库制备的血清样品，以确定H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的交叉HI反应性。在HI测试中，评估H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut与6个不同进化枝(rBac03H5代表进化枝2.3.2，Re4代表进化枝7.2，Re5代表进化枝2.3.4，Re6代表进化枝2.3.2.1，Re7代表进化枝7.2，且Re8代表进化枝2.3.4.4.)的抗原的交叉反应性。

Re-4至Re-8、03H5(MutK+)、H5Con1、H5Con3、H5Con5和H5Con5Mut的交叉HI反应性评分显示于表4中。在表4中，“+”代表衍生自测试血清可以与之交叉反应的不同进化枝的异源抗原数目。评分为“++++”的血清证实与4个不同进化枝的交叉反应性，评分为“+++”的血清证实与3个不同进化枝的交叉反应性，评分为“++”的血清证实与2个不同进化枝的交叉反应性,而评分为“+”的免疫血清证实仅与1个进化枝的交叉反应性。从“+”到“++++”的评分指示了更广泛的交叉反应性。选择生成“++++”评分的抗原用于接下来的实验。

表4.交叉反应性的评分

n/a＝不适用

基于交叉反应性结果，可以确定H5Con5Mut具有更广泛的交叉反应性。

在该实施例中进一步测试了03H5MutK+(进化枝2.3.2)、H5Con3和H5Con5Mut的保护功效。在保护功效测试中，评估了Re6+7+8、03H5MutK+(进化枝2.3.2)、H5Con3和H5Con5Mut。Re6+7+8是针对进化枝2.3.2.1、进化枝7.2和进化枝2.3.4.4的三价疫苗(Re6+Re7+Re8的混合物)，并且购自Harbin Weike Biotechnology Development Co.，Ltd。Re6+7+8用作针对攻击病毒的每个进化枝的保护功效的阳性对照疫苗。制备了高致病性禽流感(HPAI)H5Nx病毒的三个不同进化枝的原种，并用于攻击试验，1)毒株383(进化枝2.3.2.1)，2)毒株14079(进化枝2.3.4.4)，以及3)毒株13147(进化枝7.2)。SPF鸡在21日龄经由皮下途径，用一个剂量(0.3ml)的Re6+7+8，以及包含03H5MutK+(进化枝2.3.2)、H5Con3和H5Con5Mut(各自具有至少256/剂量的可比较HAU)的免疫原性组合物进行疫苗接种。接种疫苗的鸡保持在ABSL3(动物生物安全3级)设施中。

在疫苗接种后三周(21天)，通过用三种H5Nx攻击病毒之一/试验的滴鼻剂来攻击鸡。用于每只鸡的攻击剂量为6Log

针对每种攻击病毒的保护功效的评估基于下述标准：1)100％接种疫苗的鸡在两周的监测期过程内是否存活(0％死亡率)。

进行三个疫苗接种/攻击动物试验，并且表5显示了Re6+7+8、03H5MutK+(进化枝2.3.2)、H5Con3和H5Con5Mut的保护功效。

表5.针对每种病毒攻击的保护％

n/a＝不适用

证实了当用进化枝2.3.4.4、进化枝2.3.2.1和进化枝7.2的HPAI病毒攻击时，用包含H5Con5Mut的免疫原性组合物接种疫苗的鸡证实了100％的保护。也就是说，与常规疫苗如需使用Re6+Re7+Re8的混合物相比，包含H5Con5Mut的免疫原性组合物本身同时提供了针对三个不同AIV进化枝的更佳和更广泛的保护。

在该实施例中进一步测试了H5Con5Mut对不同HPAI H5亚型的保护功效。

组1a-5a被设定为H5Con5Mut施用于其的免疫组，并且组1b-5b被设定为仅对其进行HPAI攻击的对照组。每组含有12只10日龄的SPF鸡。在测试当天(D0)时，经由皮下途径用一个剂量(0.3ml)的包含H5Con5Mut的免疫原性组合物，给组1a-5a中的鸡接种疫苗。在免疫之后(dpi)21天后，所有组中的鸡用不同的HPAI H5亚型进行鼻内攻击，并且攻击剂量为6Log

HAPI的临床症状包括精神不足、羽毛粗糙、食欲明显降低、咳嗽、来自鼻和眼的分泌物、面部肿胀、紫绀、腹泻、神经系统症状。至少这些临床症状的出现被用于计算发病率。通过计数死鸡来计算死亡率。通过将受保护的鸡除以测试鸡的总量来计算保护％。

用于攻击的HPAI H5亚型如下：

攻击毒株获得自华南农业大学(五山路，天河区，广州，广东省，中国)，并且是上文描述的H5N1(进化枝2.3.3.1(d)和2.3.4.4)、H5N2(进化枝7.2)和H5N6进化枝(2.3.4.4(d))的代表性分离株。

观察到的H5Con5Mut针对不同AIV H5亚型的保护功效概括于表6中。

表6.针对不同HPAI H5亚型的保护％

表6显示了，在每个对照组中，在21dpi时的攻击是有效的，因为在攻击之后的14周期间观察到100％的死亡率，并且当鸡用H5N1、H5N2和H5N6进行攻击时，H5Con5Mut证实了100％的保护。数据证实了，H5Con5Mut提供了针对不同HPAI H5亚型的更佳和更广泛的保护功效。

在该实施例中进一步测试了H5Con5Mut针对HPAI攻击的保护发作。

组1a和2a被设定为H5Con5Mut施用于其的免疫组，并且组1b和2b被设定为仅对其进行HPAI攻击(14079毒株)的对照组。每组含有12只10日龄的SPF鸡，并且实验重复两次。在测试当天(D0)时，经由皮下途径用一个剂量(0.3ml)的包含H5Con5Mut的免疫原性组合物，给组1a和2a中的鸡接种疫苗。在免疫之后(dpi)7天后，组1a和1b中的鸡用14079毒株进行鼻内攻击。在免疫之后(dpi)14天后，组2a和2b中的鸡用14079毒株进行鼻内攻击。攻击剂量为6Log

表7.H5Con5Mut针对HPAI攻击的保护发作

表7证实了H5Con5Mut早在7dpi时就诱导了保护，在14dpi时具有100％的保护。数据证实了H5Con5Mut提供了针对HPAI攻击的快速和早期发作保护。

在该实施例中进一步测试了H5Con5Mut针对HPAI攻击的保护持续时间。

组1-3被设定为H5Con5Mut施用于其的免疫组，并且组4被设定为仅对其进行HPAI攻击(14079毒株)的对照组。每组含有12只10日龄的SPF鸡，并且实验进行两次。在测试当天(D0)时，经由皮下途径用一个剂量(0.3ml)的包含H5Con5Mut的免疫原性组合物，给组1-3中的鸡接种疫苗。在28dpi、35dpi和42dpi后，组1-3中的鸡分别用14079毒株进行鼻内攻击。在对照组中，鸡在28dpi后用14079毒株进行鼻内攻击。攻击剂量为6Log

表8.H5Con5Mut针对HPAI攻击的保护持续时间

表8显示了H5Con5Mut提供了持续至少42dpi的100％保护。数据证实了，H5Con5Mut提供了针对HPAI攻击的持久且有效的保护。

在该实施例中进一步测试了H5Con5Mut针对HPAI攻击对不同日龄的鸡的保护。

组1-2被设定为H5Con5Mut施用于其的免疫组，并且组3被设定为仅对其进行HPAI攻击(14079毒株)的对照组。每组含有12只SPF鸡，并且实验进行两次。在组1中，经由皮下途径用一个剂量(0.3ml)的包含H5Con5Mut的免疫原性组合物，给1日龄的鸡接种疫苗。在组2中，经由皮下途径用一个剂量(0.3ml)的包含H5Con5Mut的免疫原性组合物，给10日龄的鸡接种疫苗。在21dpi后，组1-3中的鸡分别用14079毒株进行鼻内攻击。攻击剂量为6Log

表9.H5Con5Mut对不同日龄的鸡的保护

表9显示了H5Con5Mut对1日龄的鸡提供了针对HPAI攻击的100％保护。数据证实了，H5Con5Mut甚至从新生儿起对鸡提供了极佳保护。

在该实施例中进一步测试了H5Con5Mut经由不同施用途径对鸡的保护。

组1-2被设定为H5Con5Mut施用于其的免疫组，并且组3被设定为仅对其进行HPAI攻击(14079毒株)的对照组。每组含有12只10日龄的SPF鸡，并且实验进行两次。在测试当天(D0)时，经由皮下(S.C.)或肌内(I.M.)施用，用一个剂量(0.3ml)的包含H5Con5Mut的免疫原性组合物，给组1-2中的鸡接种疫苗。在21dpi后，组1-3中的鸡分别用14079毒株进行鼻内攻击。攻击剂量为6Log

表10.H5Con5Mut经由不同施用途径对鸡的保护

表10显示了H5Con5Mut经由S.C.和I.M.施用两者对鸡提供了极佳保护，并且H5Con5Mut的保护功效并不限于某种施用途径。灵活的施用方式允许H5Con5Mut适合于处于不同生长状态的鸡，例如仅具有少量肌肉的新生鸡。

根据本公开内容，无需过度实验可以制备且实施本文公开且请求保护的所有组合物和方法。虽然已根据例示实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文所述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序应用变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体而言，显而易见的是，化学和生理学两者相关的某些试剂可以取代本文所述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改被视为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

序列表

<110> 勃林格殷格翰动物保健有限公司

<120> 针对禽流感病毒H5亚型的免疫原性组合物

<130> P19-0002-WO-2

<160> 11

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 毒株duck/China/E319-2/03的HA蛋白的氨基酸序列，但缺少氨基末端的信号肽。

<400> 1

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

1 5 10 15

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

35 40 45

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

100 105 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

115 120 125

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser Ser Phe Phe

130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile

145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

165 170 175

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln

180 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

195 200 205

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

210 215 220

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

245 250 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

260 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

275 280 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

305 310 315 320

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

325 330 335

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

340 345 350

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

355 360 365

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

370 375 380

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

385 390 395 400

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

405 410 415

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu

420 425 430

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr

435 440 445

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn

450 455 460

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser

465 470 475 480

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

485 490 495

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr

500 505 510

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu

515 520 525

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

530 535 540

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

545 550

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con1的氨基酸序列（不含信号肽）

<400> 2

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

1 5 10 15

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

35 40 45

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

100 105 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

115 120 125

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile

145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

165 170 175

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

180 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

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Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

210 215 220

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

245 250 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

260 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

275 280 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

305 310 315 320

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

325 330 335

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

340 345 350

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

355 360 365

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

370 375 380

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

385 390 395 400

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

405 410 415

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

420 425 430

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

435 440 445

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

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Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

465 470 475 480

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

485 490 495

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

500 505 510

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

515 520 525

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

530 535 540

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

545 550

<210> 3

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con3的氨基酸序列

<400> 3

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Asn Pro Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

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210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

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Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

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530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 4

<211> 567

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con5的氨基酸序列

<400> 4

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

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65 70 75 80

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Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

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Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

370 375 380

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

385 390 395 400

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

405 410 415

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435 440 445

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515 520 525

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530 535 540

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

545 550 555 560

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 5

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Con5Mut的氨基酸序列

<400> 5

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

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65 70 75 80

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85 90 95

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145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

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180 185 190

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Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 6

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con5Mut的位置60至300的氨基酸序列

<400> 6

Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly

1 5 10 15

Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu

20 25 30

Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr

35 40 45

Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg

50 55 60

Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser

65 70 75 80

Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly

85 90 95

Thr Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn

100 105 110

Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp

115 120 125

Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln

130 135 140

Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser

145 150 155 160

Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val

165 170 175

Asn Gly Gln Asn Gly Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro

180 185 190

Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu

195 200 205

Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser

210 215 220

Glu Val Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly

225 230 235 240

Ala

<210> 7

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con1的优化核酸序列

<400> 7

atggaaaaaa tcgtgctgct cttggctatt gtcagtttgg ttaagtcgga ccagatctgc 60

attggatacc acgccaacaa ctctaccgaa caagtcgaca ctatcatgga gaagaacgtt 120

acagtgacgc acgctcagga tatcctggag aagacccata acggaaaact gtgtgacctc 180

gatggtgtga agcctttgat cctgcgtgac tgctctgtgg ctggttggct gctgggaaac 240

cctatgtgtg atgagttcat caacgtcccc gaatggtctt acattgttga gaaggctaac 300

ccagccaacg acctctgcta cccgggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg 360

ctgagtagga tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagtccag ctggtccgac 420

cacgaggctt cttcaggagt gagttcggcc tgtccgtacc agggcaagtc cagcttcttc 480

cgtaacgtgg tctggctgat taagaaaaac aacgcctacc caacaatcaa gaggtcatac 540

aacaacacga accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc aaacgatgct 600

gccgagcaga ctcgtctcta ccaaaacccg accacttaca tctccgtcgg caccagcact 660

ttgaaccaga gactggttcc gaagatcgca acacgctcca aagtgaacgg tcaaagcggc 720

aggatggact tcttctggac gatcctgaag cctaacgatg ctattaactt cgaatccaac 780

ggaaacttca tcgcacccga gtacgcgtac aagattgtca agaaaggtga ctctgcaatc 840

atgaaatcag agctggaata cggtaactgc aacacaaagt gtcaaacgcc catgggcgcg 900

atcaactctt caatgccttt ccacaacatc catcccctca caattggcga gtgccctaag 960

tacgttaaaa gtaacagact cgtgttggct accggattgc gtaactcgcc ccagagggaa 1020

cgccgtagga agaaacgcgg actgttcggt gctatcgccg gtttcattga gggtggctgg 1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccatagta acgaacaggg atcgggttac 1140

gcagcggaca aggagtctac ccaaaaagct atcgatggtg tgactaacaa ggtcaactca 1200

atcattgaca aaatgaacac tcagttcgag gccgtcggca gagaattcaa caacctcgag 1260

agacgcatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac 1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgcactc tcgacttcca cgattccaac 1380

gtgaagaacc tctacgacaa agtcagactg caactccgcg ataacgctaa ggaattgggc 1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaatc cgtccgcaac 1500

ggcacatacg attacccaca gtacagcgag gaagctcgtc tcaagaggga ggaaatttct 1560

ggcgttaaat tggagtcaat cggaacatac caaatcctgt ccatttacag cacggttgca 1620

agttcgttgg cactggcgat catggtggcg ggcctcagct tgtggatgtg ctctaacgga 1680

tcactgcagt gccgcatctg tatttaa 1707

<210> 8

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con3的优化核酸序列

<400> 8

atggaaaaga tcgtgctgct cttggcaatt gtctccttgg ttaagagcga ccagatctgc 60

attggatacc acgcgaacaa cagcacagaa caagtcgaca cgatcatgga gaagaacgtt 120

acagtgacgc acgcacagga tatcctggag aaaacccata acggaaagct gtgtgacctc 180

gatggtgtga agcctttgat cctgcgcgac tgctctgtcg ctggttggct gctcggcaac 240

ccaatgtgtg atgagttcat caacgtcccg gaatggtcat acattgttga gaaggcaaac 300

cctgcgaacg acctctgcta ccccggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg 360

ctgtctcgta tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagtccag ctggagtgac 420

cacgaggcat cgctgggagt gtcttcagcg tgtccttacc aaggtaaccc cagtttcttc 480

aggaacgtgg tctggctcat taagaaaaac aacacatacc cgacgatcaa gaaatcctac 540

aacaacacta accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc taacgatgag 600

gctgaacaga caaagctcta ccaaaacccc accacttaca tctctgtcgg cacctcaact 660

ttgaaccaga gactggttcc caaaatcgct acacgcagta aggtgaacgg tcaatcgggc 720

cgtatggact tcttctggac gatcctgaag ccaaacgatg ccattaactt cgaatccaac 780

ggaaacttca tcgctccgga gtacgcctac aaaattgtca agaaaggtga ctccgctatc 840

atgaagagcg aggttgaata cggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatcggcgcc 900

attaacagtt cgatgccatt ccacaacatc catccgctga caattggcga gtgccctaag 960

tacgttaaat ctaacaagct cgtgttggct accggattgc gtaactcacc ccagagggaa 1020

cgccgtagga agaaacgcgg actgttcggt gcaatcgcgg gtttcattga gggtggctgg 1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccattcta acgaacaggg atcaggttac 1140

gctgccgaca aagagtccac ccaaaaggca atcgatggtg tgactaacaa agtcaacagc 1200

atcattgaca agatgaacac ccagttcgag gcggtcggca gagaattcaa caacctcgag 1260

agacgcatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac 1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgcactc tcgacttcca cgattcaaac 1380

gtgaaaaacc tctacgacaa ggtcagactg caactccgcg ataacgccaa ggaattgggc 1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaaag tgtgcgtaac 1500

ggcacttacg attaccccca gtactcggag gaagcccgtc tcaaaaggga ggaaatttcc 1560

ggcgtcaagt tggagagcat cggaacatac caaatcctgt ctatttactc aacggttgct 1620

tccagcttgg ctctggccat catggtggcc ggcctctcct tgtggatgtg cagtaacgga 1680

tcgctgcagt gcaggatctg tatttaa 1707

<210> 9

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H5Con5的优化核酸序列

<400> 9

atggaaaaga tcgtgctgct cttggctatt gtctctctgg ttaaatcaga ccagatctgc 60

attggatacc acgccaacaa ctccacagaa caagtcgaca cgatcatgga gaagaacgtt 120

acagtgacgc acgctcagga tatcctcgag aaaacccata acggaaagct gtgtgacctc 180

gatggtgtga agcctttgat cctgagggac tgcagtgtcg ccggttggct gctcggcaac 240

ccaatgtgtg atgagttcat caacgtcccg gaatggtcct acattgttga gaaggctaac 300

cctgccaacg acctctgcta ccccggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg 360

ctgtctagaa tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagtccag ctggtcagac 420

cacgaggctt cttcaggagt gagttcggcc tgtccttacc aaggtactcc cagcttcttc 480

aggaacgtgg tctggctgat taagaaaaac aacacatacc cgacgatcaa gagatcttac 540

aacaacacta accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc taacgatgct 600

gccgagcaga caaagctcta ccaaaacccc accacttaca tcagtgtcgg cacctcgact 660

ttgaaccagc gcctggttcc caaaatcgca acacgtagta aggtgaacgg tcaatcgggc 720

aggatggact tcttctggac gatcctcaag ccaaacgatg ctattaactt cgaaagcaac 780

ggaaacttca tcgcaccgga gtacgcgtac aaaattgtca agaaaggtga ctccgcaatc 840

atgaagagcg aggttgaata cggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatcggcgcg 900

attaactcca gcatgccatt ccacaacatc catccgctga caattggcga gtgccctaag 960

tacgttaaat ctaacaagct cgtgttggcc accggattga ggaactcacc ccagagagaa 1020

cgccgtagga gaaagcgcgg actgttcggt gctatcgccg gtttcattga gggtggctgg 1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccattcta acgaacaggg atcaggttac 1140

gcagcggaca aagagtccac ccaaaaggct atcgatggtg tgactaacaa agtcaacagc 1200

atcattgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtcggcc gcgaattcaa caacctcgag 1260

cgccgtatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac 1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgtactc tcgacttcca cgattcaaac 1380

gtgaaaaacc tctacgacaa ggtccgcctg caactccgtg ataacgctaa ggaattgggc 1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaaag tgtgcgcaac 1500

ggcacttacg attaccccca gtactcggag gaagctaggt tgaaaagaga ggaaatttcc 1560

ggcgtcaagt tggagagcat cggaacatac caaatcctga gtatttactc gacggttgca 1620

tcttcattgg cactggcgat catggtggcg ggcctctcct tgtggatgtg ctccaacgga 1680

agcctgcagt gccgtatctg tatttaa 1707

<210> 10

<211> 1704

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H5ConMut的优化核酸序列

<400> 10

atggaaaaga tcgtgctgct cttggctatt gtctctctgg ttaaatcaga ccagatctgc 60

attggatacc acgccaacaa ctccacagaa caagtcgaca cgatcatgga gaagaacgtt 120

acagtgacgc acgctcagga tatcctcgag aaaacccata acggaaagct gtgtgacctc 180

gatggtgtga agcctttgat cctgagggac tgcagtgtcg ccggttggct gctcggcaac 240

ccaatgtgtg atgagttcat caacgtcccg gaatggtcct acattgttga gaaggctaac 300

cctgccaacg acctctgcta ccccggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg 360

ctgtctagaa tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagaatag ctggtcagac 420

cacgaggctt cttcaggagt gagttcggcc tgtccttacc aaggtactcc cagcttcttc 480

aggaacgtgg tctggctgat taagaaaaac aacacatacc cgacgatcaa gagatcttac 540

aacaacacta accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc taacgatgct 600

gccgagcaga caaagctcta ccaaaacccc accacttaca tcagtgtcgg cacctcgact 660

ttgaaccagc gcctggttcc caaaatcgca acacgtagta aggtgaacgg tcaaaatggc 720

aggatggact tcttctggac gatcctcaag ccaaacgatg ctattaactt cgaaagcaac 780

ggaaacttca tcgcaccgga gtacgcgtac aaaattgtca agaaaggtga ctccgcaatc 840

atgaagagcg aggttgaata cggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatcggcgcg 900

attaactcca gcatgccatt ccacaacatc catccgctga caattggcga gtgccctaag 960

tacgttaaat ctaacaagct cgtgttggcc accggattga ggaactcacc ccagagagaa 1020

cgccgtagga gaaagcgcgg actgttcggt gctatcgccg gtttcattga gggtggctgg 1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccattcta acgaacaggg atcaggttac 1140

gcagcggaca aagagtccac ccaaaaggct atcgatggtg tgactaacaa agtcaacagc 1200

atcattgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtcggcc gcgaattcaa caacctcgag 1260

cgccgtatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac 1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgtactc tcgacttcca cgattcaaac 1380

gtgaaaaacc tctacgacaa ggtccgcctg caactccgtg ataacgctaa ggaattgggc 1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaaag tgtgcgcaac 1500

ggcacttacg attaccccca gtactcggag gaagctaggt tgaaaagaga ggaaatttcc 1560

ggcgtcaagt tggagagcat cggaacatac caaatcctga gtatttactc gacggttgca 1620

tcttcattgg cactggcgat catggtggcg ggcctctcct tgtggatgtg ctccaacgga 1680

agcctgcagt gccgtatctg tatt 1704

<210> 11

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码H5Con5Mut的位置60至300的氨基酸序列的优化核酸序列

<400> 11

ctcgatggtg tgaagccttt gatcctgagg gactgcagtg tcgccggttg gctgctcggc 60

aacccaatgt gtgatgagtt catcaacgtc ccggaatggt cctacattgt tgagaaggct 120

aaccctgcca acgacctctg ctaccccggt aacttcaacg attacgagga attgaagcac 180

ttgctgtcta gaatcaacca tttcgaaaag atccagatca tcccaaagaa tagctggtca 240

gaccacgagg cttcttcagg agtgagttcg gcctgtcctt accaaggtac tcccagcttc 300

ttcaggaacg tggtctggct gattaagaaa aacaacacat acccgacgat caagagatct 360

tacaacaaca ctaaccagga agacctcttg gtgctgtggg gtatccacca tcctaacgat 420

gctgccgagc agacaaagct ctaccaaaac cccaccactt acatcagtgt cggcacctcg 480

actttgaacc agcgcctggt tcccaaaatc gcaacacgta gtaaggtgaa cggtcaaaat 540

ggcaggatgg acttcttctg gacgatcctc aagccaaacg atgctattaa cttcgaaagc 600

aacggaaact tcatcgcacc ggagtacgcg tacaaaattg tcaagaaagg tgactccgca 660

atcatgaaga gcgaggttga atacggtaac tgcaacacca aatgtcaaac tccaatcggc 720

gcg 723