用于靶向表达TROP-2的肿瘤的抗体缀合物

摘要

本发明涉及具有通式结构(2)的抗体缀合物：AB–[(L6)–{Z–(L1)n–(L2)o–(L3)p–(L4)q–D}xx]yy(2)，其中AB是能够靶向表达Trop‑2的肿瘤的抗体，并且D选自紫杉烷类、蒽环类、喜树碱、埃坡霉素、丝裂霉素、考布他汀、长春花生物碱类、美登素类化合物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多卡米星、微管溶素、毒伞肽、博来霉素、多拉司他汀和澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药。这些抗体缀合物表现出改善的治疗指数。本发明还涉及制备本发明的抗体缀合物的方法、靶向表达Trop‑2的细胞的方法、本发明的抗体缀合物的医学用途。

说明书

技术领域

本发明属于生物缀合领域。更具体而言，本发明涉及用于靶向治疗癌症(特别是表达Trop-2的肿瘤)患者的抗体-药物缀合物。

背景技术

在乳腺癌的生长、分化、侵入和/或转移中起作用的蛋白质可影响肿瘤的生物学进程，因此可提供重要的预后信息。一种这样的候选物为Trop-2(GA733-1，EGP-1)，一种45kDa单体跨膜糖蛋白，其属于TACSTD基因家族，特别是TACSTD2，其在处于分化的不同阶段的人上皮细胞中表达。已证明，Trop-2的过表达对于刺激肿瘤生长是必要和充分的，并且与总体预后不良有关。Trop-2的表达与几种人类癌症的预后不良有关，包括口腔癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和肺癌。例如，在55％的被研究的胰腺癌患者中观察到Trop-2的过表达，其与经受治疗目的的手术的患者的转移、肿瘤分级和无进展生存期短呈正相关。同样，在胃癌中，56％的患者可在其肿瘤上表现出Trop-2过表达，这同样与那些Trop-2阳性肿瘤细胞累及淋巴结的患者较短的无病存活期和较差的预后有关。

鉴于这些特征以及Trop-2与如此众多难以治疗的癌症有关的事实，Trop-2为治疗干预的有吸引力的靶标。然而，必须考虑到Trop-2在某些正常组织中也表达，尽管与瘤组织相比通常强度低得多，而且通常在血管通路受限的组织区域表达。

已经建立了若干种抗Trop-2单克隆抗体。一些抗Trop-2单克隆抗体如77220作为试剂可商购获得。正在进行将这些已建立的抗Trop-2单克隆抗体中的一些用于治疗癌症的研究。目前市场上可买到的大多数抗Trop-2单克隆抗体(例如T16)，已经使用骨髓瘤细胞系例如NS-1或SP2-1作为融合伴侣(fusion partner)系获得，该骨髓瘤细胞系保留了亲本免疫球蛋白轻链的表达。这导致这些抗体实际上是具有一条、两条直接参与Trop-2识别的轻链或两条都不直接参与Trop-2识别的轻链的抗体的异质混合物。

WO 97/14796记载了一种单克隆抗体BR110，已知其与细胞表面上的Trop-2结合并在细胞内内化。专利申请WO 2003/074566、US 2004/001825、US 2007/212350和US 2008/131363教导了RS7抗体及其在肿瘤的治疗和诊断中的用途。这些应用还涉及人源化的、人的和嵌合的RS7抗原结合蛋白(hRS7)，以及此类结合蛋白在诊断和治疗中的用途。在WO 2007/095748中公开了抗Trop-2单克隆抗体AR47A6.4.2，在WO 2007/095749中公开了AR52A301.5，这两种抗体都是特异性损伤作为靶细胞的表达Trop-2的癌细胞以表现效果的抗体。

专利申请WO 2008/144891教导了作为抗Trop-2单克隆抗体用于治疗肿瘤的人源化型AR47A6.4.2。专利申请WO 2011/155579(Sapporo)教导了一种单克隆抗体或其抗体片段，其以高亲和力结合至人Trop-2的细胞外区域并表现出高ADCC活性和高抗肿瘤活性。专利申请WO2013/077458(LivTech/Chiome)教导了具有抗肿瘤活性的抗人Trop-2抗体，特别是包括Huk5-70-2的人源化抗体，尤其是在体内具有抗肿瘤活性的人源化抗体。专利申请WO2013/068946(Rinat/Pfizer)教导了与滋养层细胞表面抗原2(Trop-2)特异性结合的抗体。本发明还涉及使用这些抗体缀合物来治疗与Trop-2表达相关的病症(例如癌症)的治疗方法，所述病症例如结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌或胰腺癌。

抗体用于肿瘤的靶向治疗的一种有前途的应用需要将多种(2至8种)高毒性有效负载(payload)与抗体缀合，从而产生抗体-药物缀合物(ADC)。ADC在本领域中为众所周知的，例如Chari等人(Angew.Chem.Int.Ed.2014，53，3796)和Beck等人(Nat Rev DrugDiscov.2017，16，315-37)所描述的。从机理上讲，设计抗体与和肿瘤相关的受体(其与健康组织相比为过表达的)高特异性结合。认为ADC在与受体结合后会内化到肿瘤细胞中，然后在抗体和/或接头在溶酶体中降解时释放有毒有效负载。

靶向Trop-2的ADC为本领域已知的，且处于临床开发的各个阶段。IMMU-132为衍生自人源化抗体hRS7的ADC，通过酸可切割的接头CL2A与喜树碱类似物SN-38缀合，如WO2015/012904中所公开的，目前处于用于治疗多种临床适应症(包括(三阴性)乳腺癌、小细胞肺癌和胰腺癌)的后期临床开发中。DS-1062a为衍生自人源化抗体hTINA的ADC，通过蛋白酶敏感的可切割接头WO 2015/098099与喜树碱类似物依沙替康(exatecan)缀合，处在用于治疗固体肿瘤的临床评估阶段。第三，PF-06664178为衍生自单克隆抗体RN926的ADC，其在微生物转谷氨酶的作用下与澳瑞他汀(auristatin)类似物PF-06380101位点特异性缀合。PF-06664178已在患有晚期或转移性实体瘤的患者的I期临床研究中进行了评估，但是ADC在高剂量水平下显示出毒性，仅具有适度的抗肿瘤活性，因此中止了研发。

当前的ADC为通过各种缀合技术制备的(总结于图1中)，主要基于与具有马来酰亚胺的半胱氨酸侧链或具有活化酯的赖氨酸侧链的缀合。半胱氨酸侧链与苯乙烯衍生物的反应也已有报道。除了与天然氨基酸侧链反应外，还可将特定非天然(非规范)氨基酸工程化至抗体的氨基酸序列中，从而为化学缀合提供独特的处理方法，例如酮、乙炔、叠氮化物、环状炔烃或环状烯烃分别用于与肟、叠氮化物、炔烃或四嗪反应。然而，后一种方法的缺点是必须重新设计抗体的天然序列，这不仅耗时且昂贵，还可能导致不稳定问题。

通过氧化-连接序列通过聚糖的缀合在本领域中为已知的，且例如已经由Hamann等人(Bioconjugate Chem.2002，13，47-58)描述。

通过聚糖的化学酶缀合在本领域为已知的，并且已经由Boons等人，Angew.Chem.Int.Ed.2014，53，7179描述了使用唾液酸转移酶，由Zhu等人，mAbs 2014，6，1以及Cook等人，Bioconjugate Chem 2016，27，1789描述了使用突变半乳糖基转移酶。

通过聚糖的化学酶缀合(包括首先对聚糖进行修整)是本领域已知的，并且已经由van Geel等人，Bioconjugate Chem.2015，26，2233进行了描述，并在图2中进行了示意性描述。简而言之，使用糖苷内切酶处理单克隆抗体以将聚糖修整到核心GlcNAc(直接连接至Asn-297)，然后在糖基转移酶的作用下转移叠氮基修饰的糖。UDP-叠氮糖的各种结构示于图3。涉及在突变型半乳糖基转移酶GalT(Y289L)的作用下转移GalNAz 11b(2-叠氮乙酰基-N-半乳糖胺)的一种特别合适的组合公开于WO 2007/095506、EP 2911699B1和van Geel等人中。如在PCT/EP2016/059194中已经公开的，可替代的有效组合需要6-叠氮基GalNAc 11d与天然GalNAc-转移酶。

用于无金属点击化学的各种环辛炔为本领域已知的(图4)。特别地，各种环辛炔，例如DIBO(I)、DBCO/DIBAC(J)和BCN(L)通常用于与叠氮化物缀合。

发明内容

在第一方面，本发明涉及抗体缀合物。与此相关，在第二方面，本发明涉及制备本发明的抗体缀合物的方法。在第三方面，本发明涉及用于靶向表达Trop-2的细胞的方法。与之相关的为本发明的抗体缀合物的第一医学用途，以及用于治疗癌症的第二医学用途。在最后一个方面，本发明涉及缀合手段用于在治疗表达Trop-2的肿瘤中提高抗体缀合物的治疗指数的用途。

本发明的抗体缀合物具有一般结构(2)：

AB–[(L

(2)

其中：

-AB为能够靶向表达Trop-2的肿瘤的抗体；

-L

-n、o、p和q各自独立地为0或1，条件是n+o+p+q＝1、2、3或4；

-Z为连接基团；

-L

-D选自紫杉烷类(taxanes)、蒽环类(anthracyclines)、喜树碱(camptothecins)、埃坡霉素(epothilones)、丝裂霉素(mytomycins)、考布他汀(combretastatins)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)、美登素类化合物(maytansinoids)、烯二炔类(如卡奇霉素(calicheamicins))、多卡米星(duocarmycins)、微管溶素(tubulysins)、毒伞肽(amatoxins)、博来霉素(bleomycins)、多拉司他汀(dolastatin)和澳瑞他汀(auristatins)、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(pyrrolobenzodiazepine dimers)、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(indolinobenzodiazepine dimers)、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药；

-xx为1或2；和

-yy为1、2、3或4。

发明人惊奇地发现，本发明的抗体缀合物在安全性和/或功效方面优于常规的靶向Trop-2的抗体缀合物，使得本发明的抗体缀合物的治疗指数相对于常规的靶向Trop-2的抗体缀合物得到了提高。

具体实施方式

在第一方面，本发明涉及抗体缀合物。与此相关，在第二方面，本发明涉及制备本发明的抗体缀合物的方法。在第三方面，本发明涉及用于靶向表达Trop-2的细胞的方法。与之相关的是本发明的抗体缀合物的第一医学用途，以及用于治疗癌症的第二医学用途。在最后一个方面，本发明涉及缀合手段用于在治疗表达Trop-2的肿瘤中提高抗体缀合物的治疗指数的用途。

在本说明书和权利要求书中使用的动词“包括(to comprise)”及其变化形式以其非限制性意义使用，意指包括该词之后的项目，但是不排除未特别提及的项目。

另外，除非上下文明确要求有且仅有一个元素，否则用不定冠词“一(a)”或“一个(an)”提及元素时不排除存在多于一个所述元素的可能性。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。

术语“糖蛋白”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指包含与该蛋白共价键合的一个或多个单糖或寡糖链(“聚糖”)的蛋白。聚糖可连接至蛋白质上的羟基(O-连接的聚糖)，例如连接至丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟基赖氨酸或羟基脯氨酸的羟基；或连接至蛋白质(例如天冬酰胺或精氨酸)上的酰胺官能团(N-糖蛋白)；或连接至蛋白质(例如色氨酸)上的碳(C-糖蛋白)。糖蛋白可包含多于一种的聚糖，可包含一种或多种单糖和一种或多种寡糖聚糖的组合，并且可包含N-连接、O-连接和C-连接的聚糖的组合。据估计，所有蛋白质中超过50％具有某种形式的糖基化，且因此称得上是糖蛋白。糖蛋白的实例包括PSMA(前列腺特异性膜抗原)、CAL(南极假丝酵母脂肪酶(candida antartica lipse))、gp41、gp120、EPO(促红细胞生成素)、抗冻蛋白和抗体。

术语“聚糖”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指与蛋白质连接的单糖或寡糖链。因此，术语聚糖是指糖蛋白的碳水化合物部分。聚糖通过一个糖的C-1碳连接至蛋白质，该糖可无进一步取代(单糖)，也可在其一个或多个羟基上被进一步取代(寡糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。然而，当更长的糖链与蛋白质连接时，所述糖链在本文中也被认为是聚糖。糖蛋白的聚糖可以是单糖。通常，糖蛋白的单糖聚糖由共价连接至该蛋白的单个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)或岩藻糖(Fuc)组成。聚糖也可为寡糖。糖蛋白的寡糖链可为直链或支链的。在寡糖中，直接连接至蛋白质的糖称为核心糖。在寡糖中，不直接与蛋白质连接并且与至少两种其他糖连接的糖被称为内部糖。在寡糖中，不直接与蛋白质连接而是与单个其他糖连接的糖，即在其一个或多个其他羟基上不带有其他糖取代基的糖，被称为末端糖。为避免疑惑，在糖蛋白的寡糖中可存在多个末端糖，但只有一个核心糖。聚糖可为O-连接的聚糖、N-连接的聚糖或C-连接的聚糖。在O-连接的聚糖中，单糖聚糖或寡糖聚糖通常通过丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基键合至蛋白质氨基酸中的O-原子上。在N-连接的聚糖中，单糖聚糖或寡糖聚糖通过蛋白质氨基酸中的N-原子(通常通过天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)的侧链中的酰胺氮)与蛋白质键合。在C-连接的聚糖中，单糖聚糖或寡糖聚糖与蛋白质的氨基酸中的C-原子(通常与色氨酸(Trp)的C-原子)键合。

术语“抗体”(AB)在本文中以其通常的科学含义使用。抗体是由免疫系统产生的能够识别并结合特定抗原的蛋白质。抗体为糖蛋白的一个实例。术语抗体在本文中以其最广泛的含义使用，并且具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、双链抗体和单链抗体。术语“抗体”在本文中还意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌症抗原的抗体。术语“抗体”意指包括完整抗体，但也包括抗体的片段，例如来自切割的抗体的抗体Fab片段、F(ab')

接头在本文中定义为连接(共价连接)化合物的两个或更多个元件的部分。接头可包含一个或多个间隔基部分。间隔基部分在本文中定义为将接头的两部分(或更多部分)间隔开(即提供它们之间的距离)并且共价键连接在一起的部分。如下文所定义，接头可为例如接头构建体、接头缀合物、接头有效负载(例如接头-药物)或抗体缀合物的一部分。

“亲水基团”或“极性接头”在本文中定义为包含一个或多个极性官能团的任何分子结构，所述极性官能团赋予其所连接的分子改善的极性，并因此赋予改善的水溶性。优选的亲水基选自羧酸基、醇基、醚基、聚乙二醇基、氨基、铵基、磺酸酯基、磷酸基、酰基磺酰胺基或氨基甲酰基磺酰胺基。除了较高的溶解度以外，亲水基团的其他作用还包括改善的点击缀合效率，以及一旦并入抗体-药物缀合物中：较少的聚集，改善的药代谢动力学，从而导致更高的功效和体内耐受性。

术语“其盐”意指当酸性质子(通常是酸的质子)被阳离子(例如金属阳离子或有机阳离子等)取代时形成的化合物。在适用的情况下，该盐是药学上可接受的盐，尽管这对于不打算给予患者的盐来说并不是必需的。例如，在化合物的盐中，化合物可通过无机酸或有机酸质子化以形成阳离子，无机酸或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分。术语“药学上可接受的”盐意指用于给药至患者(例如哺乳动物)可接受的盐(对于给定的剂量范围，具有可接受的哺乳动物安全性的具有抗衡离子的盐)。这些盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱和衍生自药学上可接受的无机酸或有机酸。“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的化合物的盐，这些盐衍生自本领域已知的各种有机抗衡离子或无机抗衡离子，且包括例如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铵离子、四烷基铵离子等，当分子包含碱性官能团时，有机或无机酸的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。

术语“烯二炔”或“烯二炔抗生素”或“含烯二炔的细胞毒素”是指本领域已知的以存在3-烯-1,5-二炔结构特征作为环状分子一部分为特征的任何细胞毒素，且包括新制癌素(neocarzinostatin)(NCS)、C-1027、克达西丁(kedarcidin)(KED)、马杜拉肽(maduropeptin)(MDP)、N1999A2、sporolides(SPO)、cyanosporasides(CYA和CYN)和fijiolides、卡奇霉素(CAL)、埃斯波霉素(esperamicins)(ESP)、达内霉素(dynemicin)(DYN)、namenamicin、shishijimicin和uncialamycin(UCM)。

如本文所用，术语“烷基氨基糖”是指通过其2-位连接至醇官能团的四氢吡喃基基团，从而形成缩醛官能团，并且在3、4或5位进一步被(至少)一个N-烷基氨基取代。“N-烷基氨基”在本文中是指具有一个甲基、乙基或2-丙基的氨基。

术语“点击探针”是指能够进行点击反应的官能部分，即两个兼容的点击探针相互经历点击反应，使得它们在产物中共价连接。用于点击反应的兼容探针为本领域已知的，并且优选包括(环状)炔烃和叠氮化物。在本发明的上下文中，本发明的化合物中的点击探针Q能够与在(修饰的)蛋白质上的点击探针F反应，使得在点击反应发生时，形成缀合物，其中蛋白质将其与本发明的化合物缀合。在此，F和Q为兼容的点击探针。

“酰基磺酰胺部分”在本文中定义为磺酰胺部分(H

在第一方面，本发明涉及通式结构(2)的抗体缀合物

AB–[(L

(2)

其中：

-AB为能够靶向表达Trop-2的肿瘤的抗体；

-L

-n、o、p和q各自独立地为0或1，条件是n+o+p+q＝1、2、3或4；

-Z为连接基团；

-L

-D选自紫杉烷类、蒽环类、喜树碱、埃坡霉素、丝裂霉素、考布他汀、长春花生物碱类、美登素类化合物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多卡米星、微管溶素、毒伞肽、博来霉素、多拉司他汀和澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药；

-xx为1或2；和

-yy是1、2、3或4。

在本发明中还涵盖结构(2)的抗体缀合物的盐，优选药学上可接受的盐。

在第二方面，本发明涉及制备本发明的抗体缀合物的方法，其包括使通式(1)的化合物与修饰的蛋白质反应，该修饰的蛋白质包含在缀合反应中能够与Q反应的反应性部分F。在此反应中，形成通式结构(2)的缀合物。

在下文中，首先定义通式结构(1)的化合物。通式结构(1)的化合物的结构特征也适用于结构(2)的抗体缀合物，除了化合物中的反应性部分Q外，其在通式结构(1)的化合物与包含反应性部分F的抗体反应时转化为连接基团Z。

该化合物具有通式结构(1)：

Q-(L

(1)

其中：

-Q为反应性部分；

-D选自紫杉烷类、蒽环类、喜树碱、埃坡霉素、丝裂霉素、考布他汀、长春花生物碱类、美登素类化合物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多卡米星、微管溶素、毒伞肽、多拉司他汀和澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药；

-如下文所进一步定义的，L

-n、o、p和q各自独立地为0或1，条件是n+o+p+q＝1、2、3或4。

反应性部分Q

通式结构(1)的化合物包含反应性部分Q。在本发明的上下文中，术语“反应性部分”可指包含官能团的化学部分，但其本身也可指官能团。例如，环辛炔基为包含官能团即C-C三键的反应性基团。类似地，N-马来酰亚胺基为包含C-C双键作为官能团的反应性基团。然而，官能团例如叠氮基官能团、硫醇官能团或炔基官能团，在本文中也可以称为反应性部分。

为了在本发明的方法中具有反应性，反应性Q应该能够与抗体上存在的官能团F反应。换而言之，反应性部分Q与抗体中存在的官能团F互补。在本文中，当所述反应性基团——任选地在其他官能团的存在下——选择性地与所述官能团反应时，反应性基团表示为与官能团“互补”。互补的反应性基团和官能团是本领域技术人员已知的，并且在下文更详细地描述。如此，通式结构(1)的化合物可方便地用于缀合反应中，其中在Q和F之间发生化学反应，从而形成包含在有效负载D和抗体之间共价连接的抗体缀合物。

在一个优选的实施方案中，反应性部分Q选自：任选地被取代的N-马来酰亚胺基、酯基、碳酸酯基、被保护的硫醇基、烯基、炔基、四嗪基、叠氮基、膦基、氧化腈基、硝酮基、腈亚胺基、重氮基、酮基、(O-烷基)羟氨基、肼基、丙二烯酰胺基、三嗪基。在一个特别优选的实施方案中，反应性部分Q为N-马来酰亚胺基、氮化物基团或炔基，最优选地，反应性部分Q为炔基。在Q是炔基的情况下，Q优选选自末端炔基、(杂)环炔基和双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团。

在一个优选的实施方案中，Q包含或为N-马来酰亚胺基，优选Q为N-马来酰亚胺基。在Q为N-马来酰亚胺基的情况下，Q优选为未取代的。因此，Q优选地根据结构(Q1)，如下文所示。

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为酯基，优选Q为酯基。在Q为酯基的情况下，优选酯基为活化的酯基。活化的酯基是本领域技术人员已知的。活化的酯基在本文中定义为包含离去基团的酯基，其中该酯的羰基与该离去基团键合。离去基团为本领域技术人员已知的。进一步优选的是，活化酯根据结构(Q2)，如下文所示，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为碳酸酯基，优选地Q为氨基甲酸酯基。在Q为碳酸酯基的情况下，优选碳酸酯基为活化的碳酸酯基。活化的碳酸酯基为本领域技术人员已知的。活化的碳酸酯基团在本文中定义为包含离去基团的碳酸酯基，其中碳酸酯羰基与该离去基团键合。进一步优选的是，碳酸酯基根据如下所示的结构(Q3)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为被保护的硫醇基，优选Q为被保护的硫醇基。硫醇基也可称为巯基。被保护的硫醇基为本领域已知的，并且优选地为如下文所示的结构(Q5)、(Q6)或(Q7)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为烯基(包括环烯基)，优选地Q为烯基。烯基可为直链或支链的，并且任选地被取代。烯基可以是末端或内部烯基。烯基可包含多于一个的C-C双键，并且优选地包含一个或两个C-C双键。当烯基为二烯基时，进一步优选两个C-C双键被一个C-C单键隔开(即，优选二烯基为共轭二烯基)。优选地，所述烯基为C

特别优选的烯基为环烯基(包括杂环烯基)，其中所述环烯基任选地被取代。优选地，所述环烯基为C

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为炔基(包括环炔基)，优选Q包含炔基。炔基可以是直链或支链的，并且任选地被取代。炔基可以是末端炔基或内部炔基。优选地，所述炔基为C

特别优选的炔基为环炔基(包括杂环炔基)，环烯基任选地被取代。优选地，(杂)环炔基为(杂)环辛炔基——即杂环辛炔基或环辛炔基，其中(杂)环辛炔基任选地被取代。优选地，Q包含下文结构(Q4)的(杂)环辛炔部分。在此，炔烃和(杂)环炔烃可任选地被取代。在另一个优选的实施方案中，(杂)环辛炔基根据结构(Q36)，并且在下文进一步定义。(杂)环辛炔基的优选实例包括结构(Q16)，也称为DIBO基团；(Q17)，也称为DIBAC基团；或(Q18)，也称为BARAC基团；(Q19)，也称为COMBO基团；和(Q20)，也称为BCN基团，全部如下文所示，其中X

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为共轭(杂)二烯基，优选Q为能够在Diels-Alder反应中反应的共轭(杂)二烯基。优选(杂)二烯基包括任选地被取代的四嗪基、任选地被取代的1,2-醌基和任选地被取代的三嗪基。更优选地，所述四嗪基根据如下所示的结构(Q21)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为叠氮基，优选Q为叠氮基。优选地，叠氮基根据如下所示的结构(Q25)。

在另一个优选的实施方案中，Q为或包含膦基，优选地Q为适合于进行Staudinger连接反应的膦基。膦基任选地被取代，优选地膦基为三芳基膦基，更优选地膦基根据如下所示的结构(Q26)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为氧化腈基，优选地Q为氧化腈基。优选地，硝酮基根据如下所示的结构(Q27)。

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为硝酮基，优选地Q为硝酮基。优选地，硝酮基根据如下所示的结构(Q28)，其中R29选自直链或支链的C

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为腈亚胺基，优选地Q为腈亚胺基。优选地，腈亚胺基根据如下所示的结构(Q29)或(Q30)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为重氮基，优选Q为重氮基。优选地，重氮基根据如下所示的结构(Q31)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为酮基，优选Q为酮基。优选地，酮基根据如下所示的结构(Q32)，其中R

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为(O-烷基)羟胺基，优选地Q为(O-烷基)羟基氨基。优选地，(O-烷基)羟胺基根据如下所示的结构(Q33)。

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为肼基，优选Q为肼基。优选地，肼基根据如下所示的结构(Q34)。

在另一个优选的实施方案中，Q包含或为丙二烯酰胺基，优选Q为丙二烯酰胺基。优选地，所述丙二烯酰胺基根据结构(Q35)。

此处，(Q16)中的芳环任选地在一个或多个位置被O-磺酰化，而(Q17)和(Q18)的环可以在一个或多个位置被卤化。

在通式结构(1)的化合物中，Q能够与存在于生物分子上的反应性基团F反应。针对反应性基团Q的互补反应性基团F为本领域技术人员已知的，且在下文更详细地描述。F和Q之间的反应及其对应产物(连接基团Z)的一些代表性实例在图1中描述。

在一个实施方案中，Q能够进行点击反应，其也可以称为环加成。在特别优选的实施方案中，Q是点击探针。点击探针在本文中定义为包含能够进行点击反应的反应性基团的部分，在本文中定义为两个官能团之间的(2+3)或(2+4)环加成，从而形成稳定的共价键，表现出高相互反应性，但同时对天然生物分子官能团(例如蛋白质、核酸、聚糖和脂质中存在的那些)表现出低反应性。此外，本文定义的点击反应可在(几乎)所有选择的溶剂中进行，包括水(及其缓冲体系)、DMSO、DMA、DMF和丙二醇。合适的反应性基团包括应变环炔基、末端炔基、叠氮基、四嗪基和应变环烯基。

优选的点击探针Q选自结构(Q1)、(Q4)、(Q8)-(Q25)、(Q27)-(Q31)和(Q35)，更优选地选自结构(Q1)、(Q4)、(Q8)-(Q21)和(Q25)，最优选选自结构(Q1)、(Q4)、(Q15)-(Q18)、(Q20)和(Q25)。

在本发明的上下文中，优选的点击反应包括Diels-Adler反应和1,3-偶极环加成，优选1,3-偶极环加成。根据该实施方案，反应性基团Q选自在环加成反应中具有反应性的基团。在此，反应性基团Q和F为互补的，即它们能够在环加成中彼此反应。

对于Diels-Adler反应，Q为二烯或亲双烯体。如技术人员所理解的，在Diels-Alder反应的上下文中，术语“二烯”是指1,3-(杂)二烯，并且包括共轭二烯(R

对于1,3-偶极环加成，Q为1,3-偶极子或亲偶极体。本领域已知的适合于1,3-偶极环加成的任何1,3-偶极子都可用作反应性基团Q。优选的1,3-偶极子包括叠氮基、硝酮基、氧化腈基、腈亚胺基和重氮基。尽管本领域已知的适合于1,3-偶极环加成的任何亲偶极体都可用作反应性基团Q，但亲偶极体优选为烯基或炔基，最优选炔基。对于通过1,3-偶极环加成进行缀合，优选Q为亲偶极体(且F为1,3-偶极子)，更优选Q为或包含炔基。

在一个优选的实施方案中，Q选自亲偶极体和亲双烯体。优选地，Q为烯基或炔基。在一个特别优选的实施方案中，Q包含炔基，优选选自如上所述的炔基、如上所述的环烯基、如上所述的(杂)环炔基和双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基]基团，更优选地Q选自式(Q15)、(Q16)、(Q17)、(Q18)、(Q20)和(Q19)，更优选地选自式(Q16)、(Q17)、(Q18)、(Q20)和(Q19)。最优选地，Q为双环[6.1.0]壬-4-炔基-9-基]，优选式(Q20)。如本文所述，已知这些基团在与叠氮基官能化的抗体的缀合中是高度有效的。

在一个特别优选的实施方案中，反应性基团Q包含炔基且根据结构(Q36)：

其中：

-R

-X

-u为0、1、2、3、4或5；

-u’为0、1、2、3、4或5；

-其中u+u’＝5；

-v＝8、9或10。

根据结构(Q36)的反应性基团的优选实施方案根据结构(Q37)、(Q16)、(Q17)、(Q18)、(Q19)和(Q20)的反应性基团。

在一个特别优选的实施方案中，反应性基团Q包含炔基且根据结构(Q37)：

其中：

-R

-R

-R

-l为0到10范围内的整数。

在结构(Q37)的反应性基团的一个优选实施方案中，R

有效负载D

D代表与抗体连接或将要与抗体连接的靶分子D，其在本领域中也称为有效负载。D选自紫杉烷类、蒽环类、喜树碱、埃坡霉素、丝裂霉素、考布他汀、长春花生物碱类、美登素类化合物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多卡米星、、微管溶素、毒伞肽、多拉司他汀和澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药。或者，D被定义为药物活性物质，例如抗癌剂，优选细胞毒素。在一个特别优选的实施方案中，D为选自澳瑞他汀、毒伞肽、烯二炔类抗生素、SN-38和博来霉素的细胞毒素。

在D为澳瑞他汀的情况下，优选D为MMAE或MMAF，更优选地D＝MMAE。在D为毒伞肽的情况下，则D优选选自α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱、γ-鹅膏蕈碱、ε-鹅膏蕈碱、鹅膏无毒环肽、鹅膏无毒环肽酸、鹅膏素酰胺、鹅膏素和原鹅膏无毒环肽(proamanullin)，更优选β-鹅膏蕈碱。在D为包含烯二炔的细胞毒素的情况下，D优选选自卡奇霉素、埃斯波霉素、shishijimicins和namenamicins，更优选卡奇霉素。

通式结构(1)的化合物可包含多于一个部分D。当存在多于一个细胞毒素D时，细胞毒素D可相同或不同，通常它们相同。在一个优选的实施方案中，通式结构(1)的化合物包含1个或2个D，最优选2个D。通常，第二次出现的D存在于L

接头

L

接头L

接头L

L

在一个优选的实施方案中，接头L

波浪线表示与化合物其余部分的连接，通常与Q和L

在结构(23)中，a＝0或1，优选a＝1，并且R

在一个优选的实施方案中，R

在一个优选的实施方案中，L

此处，a和R

更优选地，间隔基部分Sp

甚至更优选地，间隔基部分Sp

甚至更优选地，间隔基部分Sp

在这些优选的实施方案中，进一步优选亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基未被取代，并任选地被一个或多个选自O、S和NR

最优选地，间隔基部分Sp

因此，优选的间隔基部分Sp

或者，优选的接头L

-d＝0或1，优选d＝1；

-e＝在0-10范围内的整数，优选e＝0、1、2、3、4、5或6，优选在1-10范围内的整数，最优选e＝1、2、3或4；

-f＝0或1，优选f＝0；

-其中d+e+f至少为1，优选在1-5范围内；并且优选地，其中d+f至少为1，优选地d+f＝1。

-g＝0或1，优选g＝1；

-k＝0或1，优选k＝1；

-A为结构(23)的磺酰胺基；

-B为-CH

-W为-OC(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)(CH

-优选地，其中L

在本实施方案的上下文中，结构(23)中的波浪线表示与如(W)

优选的接头L

(a)k＝0；d＝1；g＝1；f＝0；B＝-CH

(b)k＝1；W＝-C(O)(CH

(c)k＝1；W＝-OC(O)NH-；d＝0；B＝-CH

(d)k＝1；W＝-C(O)(CH

(e)k＝1；W＝-OC(O)NH-；d＝0；(B)

(f)k＝1；W＝-(4-Ph)CH

(g)k＝0；d＝0；g＝1；f＝0；B＝-CH

(h)k＝1；W＝-C(O)NH-；d＝0；g＝1；f＝0；B＝-CH

在一个优选的实施方案中，接头L

优选的包含支链氮原子的接头L

(i)k＝d＝g＝e’＝1；f＝d’＝g’＝0；W＝-C(O)-；B＝B’＝-CH

(j)k＝d＝g＝e’＝g’＝1；f＝d’＝0；W＝-C(O)-；B＝B’＝-CH

接头L

接头L

在一个优选实施方案中，L

在此，R

接头L

接头L

此处，波浪线表示与Q、L

R

接头L

接头L

-结构-NR

-结构-NR

-结构-NR

接头L

或者，接头L

或者，接头L

通式(1)的化合物可以由技术人员使用标准有机合成技术来制备，并且如实施例中所示例的。

在第一方面，本发明涉及抗体缀合物，其中通式(1)的化合物与抗体缀合。在本发明的上下文中，可修饰抗体以使之能够与本发明的化合物反应。本发明的抗体缀合物为通式结构(2)：

AB-[(L

(2)

其中：

-AB为能够靶向表达Trop-2的肿瘤的抗体；

-L

-n、o、p和q各自独立地为0或1，前提是n+o+p+q＝1、2、3或4；

-Z为连接基团；

-L

-D选自紫杉烷类、蒽环类、喜树碱、埃坡霉素、丝裂霉素、考布他汀、长春花生物碱类、美登素类化合物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多卡米星、微管溶素、毒伞肽、博来霉素、多拉司他汀和澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药；

-xx为1或2；和

-yy是1、2、3或4。

本文中，L

能够靶向表达Trop-2的肿瘤的抗体是技术人员已知的。优选地，抗体选自Huk5-70-2、hRS7、hTINA、AR47A6.4.2、RN926，包括其人源化类似物或其功能类似物，更优选地，所述抗体为Huk5-70-2或hRS7，最优选地，所述抗体为hRS7。发明人已经发现具有这些抗体的抗体缀合物特别适用于靶向表达Trop-2的细胞。

L

L

S为糖或糖衍生物。术语“糖衍生物”在本文中用于表示单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。S的合适的实例包括葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcNH

xx为整数，其表示连接至糖(衍生物)S的连接基团Z的数目。因此，本发明的(修饰的)抗体包含部分S，其包含xx个反应性部分F。使这些反应性部分F的每一个与通式结构(1)的化合物的反应性部分Q反应，从而形成xx个连接基团Z，并且将通式结构(1)的xx个化合物连接至每个S。xx为1或2，优选xx＝1。

yy为整数，表示与抗体连接的、各自具有xx个反应性基团F的糖(衍生物)S的数量。yy为1、2、3或4，优选yy＝2或4，最优选yy＝2。因此，本发明的(修饰的)抗体包含yy个部分S，其中每个部分S包含xx个反应性部分F。这些反应性部分F的每一个都与通式结构(1)的化合物的反应性部分Q反应，从而形成yy+xx个连接基团Z，并且将通式结构(1)的yy+xx化合物连接至每个S上。通式结构(1)的每个化合物可包含多个有效负载，例如凭助L

连接至单个抗体上的有效负载(D)分子的量在本领域中称为DAR(药物-抗体比)。在本发明的上下文中，优选DAR为1-8范围内的整数，更优选2或4，最优选DAR＝4。换而言之，DAR优选(xx+yy)至[(xx+yy)×2]范围内的整数，最优选DAR＝[(xx+yy)×2]。xx的优选值为1，yy的优选值为2，DAR优选为4。应理解，这些为理论DAR值，实际上由于不完全缀合，DAR可能会略微偏离该值。这在本领域中是众所周知的。然而，制备本发明的抗体缀合物的方法非常有效，从而获得了接近理论的DAR值。例如，当理论DAR为4时，很容易获得大于3.6或甚至大于3.8的DAR值。

连接基团Z

Z为连接基团，其共价连接本发明的缀合物的两个部分。本文中的术语“连接基团”是指由Q和F之间的反应产生的结构单元，其将缀合物的一部分与同一缀合物的另一部分连接起来。如本领域技术人员将理解的，连接基团的性质取决于在所述化合物的各部分之间获得连接的反应类型。例如，当RC(O)-OH的羧基与H

由于在抗体中可存在或引入多于一个的反应性部分F，因此本发明的抗体缀合物在每个生物分子中可包含多于一个的有效负载D，例如1-8个有效负载D，优选地1、2、3或4个有效负载D，更优选2个或4个有效负载D。考虑到抗体的对称性，有效负载数通常为偶数。换句话说，当抗体的一侧被F官能化时，对称的对应侧也将被官能化。或者，如果将蛋白质的半胱氨酸残基的天然存在的巯基用作F，则m可为任意值，并且各个缀合物之间可以是不同的。

在结构(2)的化合物中，连接基团Z通过接头将D连接至AB，任选地通过L

例如，当F包含或为硫醇基时，互补基团Q包括N-马来酰亚胺基和烯基，并且相应的连接基团Z如图1所示。当F包含或为硫醇基时，互补基团Q还包括丙二烯酰胺基。

例如，当F包含或为氨基时，互补基团Q包括酮基和活化酯基，并且相应的连接基团Z如图1所示。

例如，当F包含或为酮基时，互补基团Q包括(O-烷基)羟氨基和肼基，并且相应的连接基团Z如图1所示。

例如，当F包含或为炔基时，互补基团Q包括叠氮基，并且相应的连接基团Z如图1所示。

例如，当F包含或为叠氮基时，互补基团Q包括炔基，并且相应的连接基团Z如图1所示。

例如，当F包含或为环丙烯基、反式-环辛烯基或环辛炔基时，互补基团Q包括四嗪基，并且相应的连接基团Z如图1所示。在这些特定的情况下Z只是一个中间结构，且会排出N

F和Q的其他合适的组合以及所得的连接基团Z

在优选的实施方案中，连接基团Z根据结构(Za)至(Zj)中的任一个，更优选根据结构(Za)、(Ze)、(Zf)、(Zi)或(Zj)，最优选根据结构(Zj)。结构(Za)至(Zh)如下：

此处，

-X

-X

-在结构(Zg)和(Zh)中，

-波浪线表示与(L

随着N

在一个特别优选的实施方案中，连接基团Z包含三唑部分并且结构为(Zi)：

此处，R

在一个特别优选的实施方案中，连接基团Z包含三唑部分并且根据结构(Zj)：

此处，R

在一个优选的实施方案中，Q包含或为炔基部分，且F为叠氮基部分，使得连接基团Z包含三唑部分。优选的包含三唑部分的连接基团为结构(Ze)或(Zi)的连接基团，其中优选地结构(Zi)的连接基团根据结构(Zj)或(Zf)。在优选的实施方案中，连接基团根据结构(Zi)，更优选地根据结构(Zj)或(Zf)。

优选的抗体缀合物

根据第一方面，优选的抗体缀合物选自化合物(I)-(III)。更优选的抗体缀合物选自(X)-(XXIX)。在一个特别优选的实施方案中，抗体缀合物选自(X)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XXII)、(XXIV)和(XXVIII)。在一个特别优选的实施方案中，抗体缀合物为(XXII)。这些抗体缀合物的结构在下文进行定义。

抗体缀合物(I)具有以下结构：

AB–[(L

(I)

其中：

-AB、L

-L

-L

-L

-L

-q＝0或1。

在抗体缀合物(I)的上下文中，对于L

抗体缀合物(II)具有以下结构：

AB–[(L

(II)

其中：

-AB、L

-L

-L

-L

在抗体缀合物(II)的上下文中，对于L

抗体缀合物(III)具有以下结构：

AB–[(L

(III)

其中：

-AB、L

-L

-L

-L

-L

在抗体缀合物(III)的上下文中，对于L

抗体缀合物(X)具有以下结构的接头-有效负载部分：

其中，波浪线表示与Z的连接；D与R

对于优选的抗体缀合物(Xa)，R

抗体缀合物(XI)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、e和R

对于优选的抗体缀合物(XIa)，e为4；并且R

抗体缀合物(XII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D和R

对于优选的抗体缀合物(XIIa)，R

抗体缀合物(XIII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XIIIa)，x＝1；并且R

抗体缀合物(XIV)具有以下结构的接头有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XIVa)，x＝1；并且R

抗体缀合物(XV)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XVa)，每个x＝1；并且每个R

抗体缀合物(XVI)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、e、x和R

对于优选的抗体缀合物(XVIa)，e＝4；x＝1；并且R

抗体缀合物(XVII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、e、x和R

对于优选的抗体缀合物(XVIIa)，e＝4；x＝1；并且R

抗体缀合物(XVIII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、e、x和R

对于优选的抗体缀合物(XVIIIa)，e＝4；x＝1；并且R

抗体缀合物(XIX)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XIXa)，x＝1；并且R

抗体缀合物(XX)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XXa)，x＝1；并且R

抗体缀合物(XXI)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D和R

对于优选的抗体缀合物(XXIa)，R

抗体缀合物(XXII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XXIIa)，每个x＝1；并且每个R

抗体缀合物(XXIII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XXIIIa)，每个x＝1；且每个R

抗体缀合物(XXIV)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x和R

对于优选的抗体缀合物(XXIVa)，每个x＝1；且每个R

抗体缀合物(XXV)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D和R

对于优选的抗体缀合物(XXVa)，R

抗体缀合物(XXVI)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D和R

对于优选的抗体缀合物(XXVIa)，R

抗体缀合物(XXVII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D和R

对于优选的抗体缀合物(XXVIIa)，R

抗体缀合物(XXVIII)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x、e和R

对于优选的抗体缀合物(XXVIIIa)，e＝1；每个x＝2；且每个R

抗体缀合物(XXIX)具有以下结构的接头-有效负载部分：

此处，波浪线表示与Z的连接；D、x、e和R

对于优选的抗体缀合物(XXIXa)，e＝1；每个x＝2；并且每个R

在优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物选自抗体缀合物(I)-(III)。在优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物选自抗体缀合物(II)和(III)。在优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物选自抗体缀合物(X)-(XXIX)。在优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物选自抗体缀合物(X)-(XX)。在优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物选自抗体缀合物(X)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XXII)、(XXIV)。和(XXVIII)。在优选的实施方案中，本发明的抗体缀合物具有结构(XXII)或(XXVIII)。

在另一方面，本发明涉及制备本发明的抗体缀合物的方法，该方法包括以下步骤：使本发明化合物的Q与抗体的官能团F反应。上文更详细地描述了通式结构(1)的化合物及其优选的实施方案。本方法在这样的条件下进行：使Q与F反应以将抗体AB共价连接至有效负载D。在本发明的方法中，Q与F反应，在本发明的抗体与化合物之间形成共价连接。互补的反应性基团Q和官能团F是技术人员已知的并且在下文更详细地描述。

本方面的方法优选涉及点击反应，更优选1,3-偶极环加成，最优选炔/叠氮化物环加成。最优选地，Q为炔基或包含炔基，并且F为叠氮基。点击反应(例如1,3-偶极环加成)在本领域中是已知的，并且技术人员知晓如何实施。

在本方面的方法中，抗体中可存在多于一个官能团F。当存在两个或更多个官能团时，所述基团可以相同或不同。例如，包含两个官能团F(即F

制备修饰的糖蛋白的方法是本领域已知的，例如WO 2014/065661、WO 2016/170186和WO 2016/053107，其通过引用的方式并入本文。从相同的文献中，修饰的糖蛋白与包含细胞毒素和点击探针的化合物之间的缀合反应是技术人员已知的。

因此，在一方面，本发明涉及一种用于制备本发明的抗体缀合物的方法，其中该方法包括：

(i)在催化剂存在下使包含yy个核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分(其中yy＝1、2、3或4)的抗体与式S(F)

其中

-AB是能够靶向表达Trop-2的肿瘤的抗体；

-Fuc是岩藻糖；

-w为0或1；和

(ii)使修饰抗体与通式结构(1)的化合物反应，以得到抗体缀合物。

步骤(i)

在步骤(i)中，在催化剂存在下将包含1个或2个核心N-乙酰葡糖胺部分的抗体与式S(F)

原材料，即包含核心-GlcNAc取代基的抗体是本领域已知的，并且可以通过技术人员已知的方法来制备。在一个实施方案中，本发明的方法还包括在内切糖苷酶存在下，将具有核心N-乙酰葡糖胺的抗体聚糖的去糖基化，以获得包含核心N-乙酰葡糖胺取代基的抗体，其中所述核心N-乙酰基葡糖胺和所述核心N-乙酰葡糖胺取代基任选地被岩藻糖基化。根据聚糖的性质，可以选择合适的内切糖苷酶。内切糖苷酶优选选自EndoS、EndoA、EndoE、EfEndo18A、EndoF、EndoM、EndoD、EndoH、EndoT和EndoSH和/或它们的组合，其选择取决于聚糖的性质。EndoSH记载于PCT/EP2017/052792中，参见实施例1-3和SEQ.ID No:1，其通过引用并入本文。

上文针对本发明的抗体缀合物定义了结构特征S、F和xx，其同样适用于本方面。式S(F)

能够将S(F)

步骤(i)优选在合适的缓冲溶液如磷酸盐、缓冲盐溶液(例如磷酸盐缓冲盐水、tris缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、tris和甘氨酸中进行。合适的缓冲剂是本领域已知的。优选缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)或tris缓冲液。步骤(i)优选在约4至约50℃的温度范围内进行，更优选在约10至约45℃范围内，甚至更优选在约20至约40℃范围内，最优选在约30至约37℃范围内。步骤(i)优选在约5至约9的pH范围内进行，优选在约5.5至约8.5的范围内，更优选在约6至约8的范围内进行。最优选步骤(i)在约7至约8的pH范围内进行。

步骤(ii)

在步骤(ii)中，使修饰抗体与通式结构(1)的化合物反应，以获得包含连接基团Z(产生于Q和F之间的反应)的抗体缀合物，所述通式结构(1)的化合物包含能够与反应性基团F反应的反应性基团Q和靶分子D。这种反应发生在这样的条件下：反应性基团Q与生物分子的官能团F反应以将抗体与通式结构(1)的化合物共价连接。

在优选的实施方案中，在步骤(ii)中，叠氮化物修饰抗体上的叠氮化物通过环加成反应与炔基反应，所述炔基优选末端炔基或通式结构(1)的化合物的(杂)环炔基。包含叠氮化物的分子与包含末端炔基或(杂)环炔基的分子的这种环加成反应是本领域中称为“点击化学”的反应之一。在包含末端炔基的接头缀合物的情况下，所述环加成反应需要在合适的催化剂(优选Cu(I)催化剂)的存在下进行。然而，在优选的实施方案中，接头缀合物包含(杂)环炔基，更优选应变(strained)(杂)环炔基。当(杂)环炔基为应变的(杂)环炔基时，不需要催化剂的存在，并且所述反应甚至可通过称为应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)的反应自发地发生。这是本领域中称为“无金属点击化学”的反应之一。

本发明进一步涉及一种用于治疗有需要的受试者的方法，该方法包括给予如上所定义的本发明的抗体缀合物。有需要的受试者通常是癌症患者。抗体缀合物(例如抗体-药物缀合物)的使用在癌症治疗领域中是众所周知的，并且根据本发明的抗体缀合物在这方面特别适合。所描述的方法通常适合于癌症的治疗。在这方面的方法中，通常以治疗有效剂量给予抗体缀合物。本发明的本方面也可以表述为本发明的抗体缀合物用于治疗需要其的受试者，优选用于癌症的治疗。换而言之，该方面涉及本发明的抗体缀合物用于制备药物或药物组合物中的用途，所述药物或药物组合物用于治疗需要其的受试者，优选用于癌症。在本文中，预期癌症的治疗包括治疗、成像、诊断、防止肿瘤的增殖、防止肿瘤的恶化并减少肿瘤。

本发明的这个方面也可以表述为靶向表达Trop-2的细胞的方法，该方法包括给予有需要的受试者本发明的抗体缀合物。对表达Trop-2的细胞的靶向优选包括治疗、成像、诊断、防止表达Trop-2的细胞(特别是表达Trop-2的肿瘤)的增殖、防止肿瘤的恶化并减少表达Trop-2的细胞(特别是表达Trop-2的肿瘤)。

在本发明的上下文中，所述受试者可患有选自以下的疾病：乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)(NSCLC)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、结肠癌、神经内分泌癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、食道癌、子宫颈癌，尤其是其中受试者患有乳腺癌或卵巢癌。

发明人已经出人意料地发现，本发明的抗体缀合物在安全性和/或功效方面优于常规的靶向Trop-2的抗体缀合物，使得本发明的抗体缀合物的治疗指数相对于常规的靶向Trop-2的抗体缀合物得到增强。

在本发明的上下文中，“缀合手段”是指用于将靶分子D缀合至抗体AB的方法，以及指所得抗体缀合物的结构特征，特别是将靶分子连接至抗体的接头，该接头为缀合过程的直接结果。因此，在一个实施方案中，缀合手段是指将靶分子缀合至抗体的过程。在另一个实施方案中，缀合手段是指接头的结构特征和/或接头与抗体的连接点，其是将靶分子缀合至抗体的过程的直接结果。

在其他方面，本发明涉及缀合手段在治疗表达Trop-2的肿瘤中用于增加抗体缀合物的治疗指数的用途，其中缀合手段用于通过接头L连接抗体AB和有效负载D。缀合手段包括：

(i)在催化剂的存在下使包含yy个核心N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分(其中yy＝1、2、3或4)的抗体AB与式S(F)

其中

-AB为能够靶向表达Trop-2的肿瘤的抗体；

-Fuc为岩藻糖；

-w为0或1；和

(ii)使修饰抗体与通式结构(1)的化合物反应，以获得抗体缀合物：

Q–(L

(1)

其中：

-Q为能够与F反应的反应性部分；

-D选自紫杉烷类、蒽环类、喜树碱、埃坡霉素、丝裂霉素、考布他汀、长春花生物碱类、美登素类化合物、烯二炔类(如卡奇霉素)、多卡米星、微管溶素、毒伞肽、多拉司他汀和澳瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、吲哚并苯并二氮杂卓二聚体、放射性同位素、治疗性蛋白质和多肽(或其片段)、激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂及其类似物或前药；

-L

-n、o、p和q各自独立地为0或1，条件是n+o+p+q＝1、

2、3或4；

优选地，提高抗体缀合物的治疗指数选自：

(a)提高抗体缀合物的治疗功效；和/或

(b)提高抗体缀合物的耐受性。

与常规的靶向Trop-2的ADC相比，本发明的抗体缀合物的治疗功效的提高可以采取减小肿瘤尺寸和/或延长消退期的形式。与给予由常规技术制成的靶向Trop-2的ADC相比，本发明的抗体缀合物的耐受性的提高可以采取毒性病征减少的形式。病征减少也可以被称为癌症治疗的症状或副作用的减少，并且可能涉及一种或多种临床病征，例如减

附图说明

图1示出了一组代表性的官能团(F)，当其存在于生物分子中时，它们在与反应性基团Q反应时产生连接基团Z。官能团F可以是天然存在的，也可以在任何选择的位置处人工引入(工程化)到生物分子中。

图2示意性地示出了如何在两步法中从任何单克隆抗体获得抗体缀合物。在第一步中，叠氮基修饰的UDP-GalNAc可以通过一锅法(one pot process)连接至单克隆抗体上，该方法包括(a)通过内切糖苷酶修整聚糖(到核心GlcNAc)和(b)叠氮基-糖在糖基转移酶(半乳糖基转移酶突变体或GalNAc-转移酶)的作用下发生连接，从而在叠氮基修饰的GalNAc和GlcNAc之间产生β-糖苷1-4键。在第二步中，叠氮基修饰抗体与适当官能化的环辛炔反应，从而产生抗体缀合物。

图3示出了半乳糖胺的UDP糖的衍生物的若干种结构，其可以在2-位处用例如3-巯基丙酰基(11a)、叠氮基乙酰基(11b)或叠氮基二氟乙酰基(11c)修饰，或在N-乙酰基半乳糖胺(11d)的6-位用叠氮基修饰。

图4示出了适用于无金属点击化学的环辛炔。

图5示出了一组毒性有效负载，其与本发明的各种靶向Trop-2的单克隆抗体缀合。(与有效负载中存在的氨基的)接头的连接点用箭头表示。

图6示出了在一系列与MMAE(BxPC-3细胞系)缀合的抗体上制备的ADC的细胞毒性。T/C％＝测试/对照百分比。

图7示出了基于被缀合至一系列毒性有效负载(BxPC-3细胞系)的抗体Huk5-70-2的ADC的细胞毒性。T/C％＝测试/对照百分比。

图8描绘了记载于实施例36中的针对抗体-药物缀合物IMMU-132(通过将CL2-SN-38缀合至hRS7制备，根据Moon等人，J.Med.Chem.2008,51,6916–6926，其通过引用的方式并入)和DS-1062a(通过将DXd缀合至hTINA1制备，根据US20160297890，其通过引用的方式并入)的功效研究的结果。

图9描绘了记载于实施例36中的对抗体-药物缀合物hRS7-卡奇霉素(II-46)的功效研究的结果。

图10描绘了记载于实施例36中的对抗体-药物缀合物hRS7-MMAE(II-41)的功效研究的结果。

图11描绘了记载于实施例36中的对抗体-药物缀合物hRS7-鹅膏蕈碱(II-43)的功效研究的结果。

图12描绘了记载于实施例36中的对抗体-药物缀合物Huk5-70-2-卡奇霉素(I-45)的功效研究的结果。

图13描绘了记载于实施例36中的对抗体-药物缀合物Huk5-70-2-鹅膏蕈碱(I-43)的功效研究的结果。

实施例

将各种IgG(Huk-5-70-2hTINA或hRS7)通过Evitria(瑞士，苏黎世)以100mL规模在CHO K1细胞中瞬时表达。使用HiTrap MabSelect sure5mL柱纯化上清液。将上清液上样到柱上，然后用至少10倍柱体积的25mM Tris pH 7.5、150mM NaCl(TBS)洗涤。用0.1M甘氨酸pH 2.7洗脱滞留蛋白。立即用1.5M Tris-HCl pH 8.8中和洗脱的产物，并用TBS透析。接下来，使用Vivaspin Turbo 15超过滤单元(Sartorius)将IgG浓缩(15-20mg/mL)。IgG的序列在下文给出：

Huk5-70-2(I)轻链：

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSIGTSIHWYQQKPGQAPRLLIKYASESISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNSWPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Huk5-70-2(I)重链：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTIYWINWVRQAPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRTSMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGlYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

hRS7(II)轻链：

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

hRS7(II)重链：

QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

hTINA(III)轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

hTINA(III)重链：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

实施例1：Huk5-70-2-(6-N

按照用于酶促重建的一般程序，将Huk5-70-2转化为Huk5-70-2-(6-N

实施例2：hRS7-(6-N

按照用于酶促重建的一般程序，将hRS7转化为hRS7-(6-N

实施例3：hTINA-(6-N

按照用于酶促重建的一般程序，将hTINA转化为hTINA-(6-N

实施例4：22的制备

通过活化化合物21(根据PCT/NL2015/050697的实施例50来制备，将该专利并入本文)来制备化合物22。向21(229mg，0.64mmol)的DCM(20mL)溶液中加入对硝基苯基氯甲酸酯(128mg，0.64mmol)和Et

根据PCT/EP2017/052790的实施例23和24由化合物22制备化合物24，将该专利并入本文。

实施例5：23的制备

向化合物22(0.39g；0.734mmol)的DCM(30mL)溶液中加入二乙醇胺(DEA,107mg；1.02mmol)的DMF(2mL)溶液和Et

实施例6：24的制备

向23(163mg，0.33mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(134mg，0.66mmol)的DCM(10mL)溶液中加入Et

实施例7：25的制备

向24(62mg,75μmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入vc-PAB-OH(60mg，0.16mmol)和Et

使化合物24或25与天然存在的或设置(install)(通过接头)在有毒的有效负载MMAE、SN-38、鹅膏蕈碱或博来霉素上的氨基基团反应(有效负载和连接点的结构参见图5)。

实施例8：接头缀合物41的制备

BCN-HS-(vc-PABC-MMAE)

实施例9：26的合成

向7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38，55mg，0.14mmol)的DMF(10mL)溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(28mg，0.14mmol)和Et

实施例10：27的合成

向26(20mg，33μmol)的DCM(0.8mL)溶液中加入TFA(0.2mL)。将混合物静置20分钟并浓缩。向残余物中加入DCM(1mL)和甲苯(1mL)。将混合物浓缩并将残余物以粗品形式用于下一步。

实施例11：接头缀合物42的合成

向25(5.4mg，3.3μmol)的DMF(50μL)溶液中添加Et

实施例12：28的合成

向β-鹅膏蕈碱(8.5mg，9.2μmol)的DMF(189μL)溶液中加入N-Boc-尸胺(5.8μL，5.6mg，27.7μmol)、Et

实施例13：29的合成

将28的TFA溶液(0.5mL)静置2分钟，并在室温下浓缩。将残余物溶于(take up)MeCN中并浓缩(2×)。残余物通过RP-HPLC(C18，5％→90％MeOH(0.05％TFA)的水溶液(0.05％TFA))纯化，得2.7mg(2.7μmol，77％)的所期望的产物。C

实施例14：接头缀合物43的合成

向29(2.7mg，2.4umol)的DMF(270μL)溶液中加入10％Et

实施例15：接头缀合物44的合成

向25(1.6mg，1μmol)的DMF(78μL)溶液中加入Et

实施例16：30的合成

向H-Val-Ala-OH(98mg，0.52mmol)在DMF(2mL)中的悬浮液中加入22(137mg，0.261mmol)的DMF(2mL)溶液和Et

实施例17：31的合成

向30(70mg，0.12mmol)的DMF(1mL)溶液中加入EEDQ(36mg，0.15mmol)和4-氨基苄醇(18mg，0.15mmol)。将该混合物搅拌22小时用DCM(5mL)稀释并浓缩。残余物用硅胶色谱法(0至20％MeOH的DCM溶液)纯化。浓缩合并的柱级分，并将残余物与EtOAc(2×6mL)共蒸发。获得为白色固体的产物，醇31(32mg，0.047mmol，39％)。1H NMR(400MHz,CDCl

实施例18：32的合成

向醇31(32mg，0.047mmol)的DMF(0.5mL)溶液中加入双-(4-硝基苯基)碳酸酯(14mg，0.047mmol)和Et

实施例19：34的合成

向9-芴基甲氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-4-氨基苄醇(33，291mg，564μmol，1.0当量)的DMF(2.0mL)溶液中加入N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(292mg，1.14mmol，2.02当量)。向所得的黄色悬浮液中加入DiPEA(198μL，1.20mmol，2.12当量)，得到白色悬浮液，其在几分钟后变成溶液。将反应混合物在室温下搅拌50分钟，然后分批加入到搅拌的DCM(50mL)和H

实施例20：37的合成

向4-巯基-4-甲基戊酸36(103mg，692μmol)的干燥DCM(3.0mL)溶液中加入EDC.HCl(143mg，744μmol)，然后加入DiPEA(0.228mL，1.38mmol)，将反应混合物搅拌10分钟，然后加入氨基醇35(76.3μL，761μmol)。将反应混合物搅拌19小时，并直接通过硅胶柱色谱法(0→8％MeOH的DCM溶液)纯化，以得到为无色油状物的37(65.4mg)。

实施例21：38的合成

向装有34(～76％纯度，69.3mg，80.2μmol)的小瓶中加入卡奇霉素γ

实施例22：39的合成

向38(23.6mg，11.6μmol)在THF：H

实施例23：40的合成

通过使用盐水/冰浴将39(10.6mg，6.28μmol)的MeCN(2.0mL)溶液冷却至-15℃。向冷却的溶液中加入37的MeCN(147.8μL，14.8mg，62.8μmol)溶液，然后加入纯Et

实施例24：接头缀合物45的合成

向39(7.29mg，4.31μmol，1.0当量)的DMF(185μL)溶液中加入22(3.75mg，7.13μmol，1.65当量)的DMF(16.4μL)溶液和Et

实施例25：接头缀合物46的合成

向40(9.0mg，4.88μmol)的DMF(445μL)溶液中加入22(12.8mg，24.4μmol)的DMF(45.8μL)溶液和50％v/v Et

实施例26：Huk5-70-2-(6-N

向Huk5-70-2-(6-N

实施例27：hRS7-(6-N

向hRS7-(6-N

实施例28：hTINA-(6-N

向hTINA-(6-N

实施例29：Huk5-70-2-(6-N

向Huk5-70-2-(6-N

实施例30：Huk5-70-2-(6-N

向Huk5-70-2-(6-N

实施例31：Huk5-70-2-(6N

向Huk5-70-2-(6-N

实施例32：Huk5-70-2-(6N

向Huk5-70-2-(6-N

实施例33：Huk5-70-2-(6-N

向Huk5-70-2-(6-N

实施例34：hRS7-(6-N

向hRS7-(6-N

实施例35：细胞毒性测定

在图6和图7中示意性地描绘了各种细胞毒性测定的读出值，显示了通过保持有效负载恒定，细胞毒性对抗体性质的明显依赖性(图6)；以及通过保持抗体恒定，细胞毒性对有效负载性质的明显依赖性(图7)。

实施例36：体内功效研究(在Altogen Lab，Austin，TX进行)

使用补充有10％FBS(ATCC)的ATCC配制的RPMI-1640培养基在37℃标准的5％CO

遵循Altogen Labs IACUC协议，对10-12周大的裸鼠(NU(NCr)-Foxn1nu裸鼠，雌性)进行了100万个细胞的皮下注射(根据Altogen Labs SOP 6.012的50％基质胶方案)。当肿瘤达到100-150mm

每周进行两次电子卡尺的测量。每天观察临床体征、食物和水的消耗、行为变化，动物每周称重两次。实验的终点为2,000mm

表1.体内研究中包含的测试项目和剂量水平的概述

图9描绘了使用hRS7-卡奇霉素(II-46)进行功效研究的数据，图10描绘了使用hRS7-鹅膏蕈碱(II-43)进行功效研究的数据，图11描绘了使用hRS7-MMAE(II-41)进行功效研究的数据，图12描绘了使用Huk5-70-2-卡奇霉素(I-46)进行功效研究的数据，图13描绘了使用Huk5-70-2-鹅膏蕈碱(I-43)进行功效研究的数据，图8描绘了使用hRS7-SN-38和hTINA-DXd进行功效研究的数据。