一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法

摘要

本发明公开了一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法，包括以下操作步骤：步骤S1、取唾液盛放器皿；步骤S2、取唾液；步骤S3、取试剂盛放器皿；本发明的有益效果是，本发明应用肝素琼脂糖凝胶结合蛋白质，尤其是肝素结合RNA水解酶和DNA水解酶的能力，快速沉淀去除唾液中的PCR抑制剂，从而使唾液在无需核酸抽提的情况直接混入反应液，快速简便地检测唾液中存在的各种病毒，避免了现行的酚/氯仿抽提法、磁珠吸附法和琼脂糖凝胶吸附法复杂和烦琐的步骤，程序简单，操作方便，缩短了操作时间，避免在分离纯化过程中丢失核酸，同时也降低了样品在核酸抽提过程中发生交叉污染的风险，减少了对环境的化学污染。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别是一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法。

背景技术

呼吸道感染是临床上常见的疾病，明确呼吸道感染的病原体，对临床治疗药物的选择意义重大。呼吸道病原体包括各种细菌、病毒、寄生虫、真菌、支原体、衣原体、螺旋体等。 呼吸道病毒感染与支原体感染出现的症状和体征有一定的类似性，而治疗药物的选择却有很大的不同。临床上依靠症状和体征进行鉴别诊断的难度较大，而实验室病原体检测可帮助明确诊断，有助于流行病学研究，治疗药物的选择，病毒疫苗接种的选择和预防效果预判。

病原体的感染检测分传统的检测方式和新的分子生物学检测方式两大类。传统的检验方式就是细菌或病毒培养,筛查,分离,生化检测和鉴定。现在新型的分子生物学的技术发展得非常快。新型技术包括病原体的抗原和IgM抗体检测、基因芯片、荧光定量PCR，还有现在已经用到临床的高通量基因测序的方法。这种方法筛查的效果非常好，能够在迅速、短期的而且特异性、敏感度都非常好的情况下，能为临床提供有效的指标，能够给临床的医生用药提供有效的指导。

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是指2019新型冠状病毒感染导致的肺炎, 正在全球大流行, 导致数千万人感染甚至死亡。流行性感冒(甲型流感病毒FluA和乙型流感病毒FluB) 和呼吸道合胞病毒病 (HrsvA和 HrsvB)是最常见的呼吸道疾病。流行性感冒由流行性感冒病毒引起。合胞病毒是引起婴幼儿下呼吸道疾病最常见的病毒，大约有60%急性婴儿喘息性支气管炎和肺炎是由该病毒引起，在大龄儿童和成人主要引起上呼吸道感染。COVID-19病毒, 流行性感冒病毒和合胞病毒是RNA病毒。

新型冠状病毒,流行性感冒病毒和合胞病毒实验室检测法包括病原学检测法和血清学检测法。实时荧光RT-PCR检测和病毒基因测序是目前临床常用的新型冠状病毒,流行性感冒病毒和合胞病毒的病原学检测法。血清学检测测定新型冠状病毒, 流行性感冒病毒和合胞病毒特异性IgM抗体和IgG抗体。由于实时荧光RT-PCR检测比病毒基因测序快速、灵敏、准确和便宜，实时荧光RT-PCR检测为目前临床常规应用的检测新型冠状病毒, 流行性感冒病毒和合胞病毒病原学检测法。

目前临床常规应用的检测新型冠状病毒、流行性感冒病毒和合胞病毒的实时荧光RT-PCR检测法，必需从临床标本中提取核酸。常规的核酸提取法包括酚/氯仿抽提法、磁珠吸附法和琼脂糖凝胶吸附法。

无论是酚/氯仿抽提法、磁珠吸附法，还是琼脂糖凝胶吸附法，核酸提取都基于相同的原理，核酸在两个物相之间具有不同的分配率，从而将核酸富集到高分配率的物相中，起到分离和纯化的作用。酚/氯仿抽提法，运用核酸在无机的水溶液和有机的酚/氯仿中的溶解度差异，达到分离的目的。其纯化程序包括匀浆裂解，离心分相，核酸沉析，离心沉淀，乙醇清洗，干燥，溶解，分装和保存。磁珠法运用核酸与磁珠表面包有的物质的特异性结合能力，加上磁场将磁珠从悬浮液体中吸出的能力，将核酸分离和纯化。其纯化过程包括裂解，与磁珠结合，磁珠在磁场中分离，洗條和洗脱。琼脂糖凝胶柱法，运用核酸与凝胶的亲和力，在核酸溶液流经柱子时结合到凝胶上，再用一定离子浓度和pH的缓冲液将核酸洗脱出来，其程序包括制柱，样品裂解，柱子平衡，上柱，清洗和洗脱。

然而现有的核酸抽提方法都步骤复杂和烦琐，时间长，在分离纯化过程中，不可避免地会丢失部分核酸，同时也存在样品在核酸抽提过程中交叉污染的危险，所用的原材料也较昂贵，具有化学污染环境的危险，鉴于此，针对上述问题深入研究，遂有本案产生。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法，解决了现有的核酸抽提方法都步骤复杂和烦琐，时间长，在分离纯化过程中，不可避免地会丢失部分核酸，同时也存在样品在核酸抽提过程中交叉污染的危险，所用的原材料也较昂贵，具有化学污染环境的危险的问题。

实现上述目的本发明的技术方案为：一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法，包括以下操作步骤：步骤S1、取唾液盛放器皿；步骤S2、取唾液；步骤S3、取试剂盛放器皿；步骤S4、添加主要试剂；步骤S5、添加辅助试剂；步骤S6、试剂均匀混合；步骤S7、混合试剂与唾液均匀混合；步骤S8、混合离心；步骤S9、取上清液盛放器皿；步骤S10、取上清液；步骤S11、添加反应液；

步骤S1：取一个用于盛放待检测人员的唾液的唾液盛放器皿；

步骤S2：将待检测人员的唾液收集在唾液盛放器皿中；

步骤S3：取一个用于盛放肝素琼脂糖凝胶的试剂盛放器皿；

步骤S4：定量量取肝素琼脂糖凝胶的量，将量取的肝素琼脂糖凝胶添加在试剂盛放器皿中；

步骤S5：定量量取核酸释放剂以及稳定剂，将量取的核酸释放剂以及稳定剂添加在量取完成的肝素琼脂糖凝胶中；

步骤S6：将肝素琼脂糖凝胶与核酸释放剂以及稳定剂混合均匀成混合试剂；

步骤S7：将混合试剂添加在收集有唾液的唾液盛放器皿中；

步骤S8：将混合试剂添加在唾液盛放器皿中，将混合试剂与收集的唾液均匀混合成混合液，随后通过离心机对混合液进行离心沉降；

步骤S9：取一个用于盛放上清液的上清液盛放器皿；

步骤S10：将离心沉降后的上清液分离出来，盛装在上清液盛放器皿中；

步骤S11：定量量取PCR 反应液，将PCR 反应液添加在上清液盛放器皿中，使PCR反应液与上清液发生反应，进行扩增，对唾液病毒核酸进行检测。

所述步骤S7中唾液为未作任何处理的新鲜唾液，所述步骤S7中唾液还可为经95摄氏度加热处理后的唾液。

所述步骤S1中唾液盛放器皿在使用前应进行清洗消毒工作。

所述步骤S3中试剂盛放器皿在使用前应进行清洗消毒工作。

所述步骤S9中上的清液盛放器皿在使用前应进行清洗消毒工作。

所述步骤S11中对唾液病毒核酸进行检测后，样品应密封保存至处理区域。

所述步骤S2中收集有唾液的唾液盛放器皿应密封放置。

所述步骤S8中离心机在使用前应进行设备调试检测。

利用本发明的技术方案制作的应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法，本发明应用肝素琼脂糖凝胶结合蛋白质，尤其是肝素结合RNA水解酶和DNA水解酶的能力，快速沉淀去除唾液中的PCR抑制剂，从而使唾液在无需核酸抽提的情况直接混入反应液，快速简便地检测唾液中存在的各种病毒，避免了现行的酚/氯仿抽提法、磁珠吸附法和琼脂糖凝胶吸附法复杂和烦琐的步骤，程序简单，操作方便，缩短了操作时间，避免在分离纯化过程中丢失核酸，同时也降低了样品在核酸抽提过程中发生交叉污染的风险，减少了对环境的化学污染。

附图说明

图1为本发明所述一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法的操作流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1所示，一种应用于唾液病毒核酸检测的唾液样本快速处理新方法，包括以下操作步骤：步骤S1、取唾液盛放器皿；步骤S2、取唾液；步骤S3、取试剂盛放器皿；步骤S4、添加主要试剂；步骤S5、添加辅助试剂；步骤S6、试剂均匀混合；步骤S7、混合试剂与唾液均匀混合；步骤S8、混合离心；步骤S9、取上清液盛放器皿；步骤S10、取上清液；步骤S11、添加反应液；步骤S1：取一个用于盛放待检测人员的唾液的唾液盛放器皿；步骤S2：将待检测人员的唾液收集在唾液盛放器皿中；步骤S3：取一个用于盛放肝素琼脂糖凝胶的试剂盛放器皿；步骤S4：定量量取肝素琼脂糖凝胶的量，将量取的肝素琼脂糖凝胶添加在试剂盛放器皿中；步骤S5：定量量取核酸释放剂以及稳定剂，将量取的核酸释放剂以及稳定剂添加在量取完成的肝素琼脂糖凝胶中；步骤S6：将肝素琼脂糖凝胶与核酸释放剂以及稳定剂混合均匀成混合试剂；步骤S7：将混合试剂添加在收集有唾液的唾液盛放器皿中；步骤S8：将混合试剂添加在唾液盛放器皿中，将混合试剂与收集的唾液均匀混合成混合液，随后通过离心机对混合液进行离心沉降；步骤S9：取一个用于盛放上清液的上清液盛放器皿；步骤S10：将离心沉降后的上清液分离出来，盛装在上清液盛放器皿中；步骤S11：定量量取PCR 反应液，将PCR 反应液添加在上清液盛放器皿中，使PCR 反应液与上清液发生反应，进行扩增，对唾液病毒核酸进行检测；所述步骤S7中唾液为未作任何处理的新鲜唾液，所述步骤S7中唾液还可为经95摄氏度加热处理后的唾液；所述步骤S1中唾液盛放器皿在使用前应进行清洗消毒工作；所述步骤S3中试剂盛放器皿在使用前应进行清洗消毒工作；所述步骤S9中上的清液盛放器皿在使用前应进行清洗消毒工作；所述步骤S11中对唾液病毒核酸进行检测后，样品应密封保存至处理区域；所述步骤S2中收集有唾液的唾液盛放器皿应密封放置；所述步骤S8中离心机在使用前应进行设备调试检测。

运用特定成份核酸释放剂和稳定剂处理新鲜唾液或者热处理过的唾液，使唾液中存在的病毒裂解并释放出病毒的核酸，且被稳定剂保护下来;

肝素琼脂糖凝胶吸附唾液中的蛋白质，尤其是吸附RNA水解酶和DNA水解酶，不吸附核酸，使上清液可以被直接用作PCR核酸检测的模板的来源。用本发明的核酸释放剂和稳定剂处理唾液、血液、血清、血浆、尿液、精液、以及其它动物和人的体液，用于核酸检测的样品处理方法都受本专利的保护。任何运用肝素琼脂糖凝胶处理唾液、血清和其它动物和人的体液样本，用作核酸检测的样品处理的方法，同样受本专利的保护。

已有的研发实验结果表明，运用本发明的方法处理人的唾液，获取上清，结合特定设计的针对人类新冠肺炎病毒的qRT-PCR引物和探针，加上相应的酶促反应体系，可以检测唾液中存在的新冠肺炎病毒;结合特定设计的人类流感病毒A的引物和探针，酶促反应体系，可以检测唾液中存在的流感病毒A。实验证明，本发明的方法可以用于通过唾液快速诊断呼吸道感染的病毒性疾病。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。