套式RT-PCR检测狂犬病毒方法的建立及其在上海地区犬、猫唾液样本的应用

摘要

建立了狂犬病毒的套式RT-PCR检测方法，可以特异地检测出狂犬病毒ERA毒株的RNA，而对犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCV)均呈阴性。该法能检出0.18fg的RNA，敏感性是普通RT-PCR的10000倍。并且检测了分别用PBS液和人唾液稀释的阳性脑组织病料，结果表明PBs液稀释的阳性病料和唾液稀释的阳性病料的检测结果是一致的，凝胶电泳观察均可以观察到特异的460bp的条带。研究表明应用套式RT-PCR法是可以检测出唾液中的狂犬病毒的。 对广西送检的疑似狂犬病的20份犬的脑组织进行RT-PCR检测，比较了套式RT-PCR和普通RT-PCR两种方法的阳性检出率。套式RT-PCR检出15份阳性，阳性率达到75％，测序结果表明15份阳性条带的序列为狂犬病毒的核酸序列，其中4个代表株与狂犬病毒ERA毒株的同源性在85.1％～85.5％之间；与狂犬病毒CVS株的同源性在85.9％～87％之间；相互间同源性在98％～99.6％之间，而普通RT-PCR检测没有出现任何条带。表明套式RT-PCR法在临床应用中可极大提高狂犬病毒的检出率，是实用的检测方法。 摸索了犬唾液样本的保存条件。通过对缓冲液的初步筛选，选定人唾液、PBS液+2％FCS(犊牛血清)和Hanks液+2％FCS作为样品保存的候选缓冲液，分别以这三种缓冲液为基础，不同保存时间，及不同温度保存，比较套式RT-PCR可以检测到病毒的最大稀释滴度。结果表明，PBS液+2％FXS最有利于狂犬病毒ERA毒株的保存；唾液其次；Hanks液+2％FCS虽然理论上缓冲能力最强，但是最不利于狂犬病毒ERA毒株的保存。在2日内可以检测的样本，应当4℃保存，避免冻融对病毒产生的损害；一周以内可以检测的样本应当加入抗生素，保存在-20℃；超过一周再检测的样本应当保存在-70℃，保存在-20℃虽然对套式RT-PCR检测影响不大，但是病毒量还是有所下降的。 2005年9月至2006年3月，对上海地区外观健康的犬、猫进行了唾液样本狂犬病毒的检测，共检测了1251份样本，其中流浪犬和咬人的犬355份；家养宠物犬694份；犬场宠物犬135份；家养宠物猫65份；流浪猫2份，结果未检出一例阳性，表明上海地区流浪犬、宠物犬和宠物猫唾液中不带狂犬病毒，目前对人群不存在传播狂犬病毒的潜在危险。

目录

文摘

英文文摘

原创性声明及学位论文版权使用授权书

文献综述：第1章狂犬病健康带毒及其检测方法的研究进展

试验部分：第2章套式RT-PCR检测狂犬病毒方法的建立

试验部分：第3章套式RT-PCR方法检测临床样品中狂犬病毒

试验部分：第4章唾液样本保存的缓冲液、时间及温度

试验部分：第5章上海地区犬、猫唾液样本狂犬病毒的检测

全文总结

致谢