具有中心通透且辐射状孔径的单分散介孔硅纳米色谱填料的制备及其在色谱分离中的应用

摘要

本发明公开了一种具有中心通透且辐射状孔径结构的单分散介孔硅纳米颗粒色谱填料的制备及在色谱分离中的应用。该方法是在非均相油‑水两相分层反应体系中，通过反应物在油‑水界面中发生自组装和聚合，实现一锅法连续的界面生长，从而得到具有纳米级粒径和一定中心对称辐射状介孔的介孔纳米硅纳米颗粒，通过化学改性后，将其用做液相色谱的分离介质，可实现超高效的分离。本发明的优点：所采用的单分散介孔硅纳米球，尺寸均一，具有中心通透且辐射状孔径结构，这些特征不仅有助于提高色谱柱的渗透率，而且还有助于减少样品区带的涡流扩散，从而获得朝高的分离柱效。由于这些独特的结构特点，该纳米材料有望成为实用的超高效纳米级液相色谱填料。

说明书

技术领域

本发明属于色谱填料和色谱柱技术领域，具体地说，是一种具有中心通透且辐射状孔径结构的单分散介孔硅纳米颗粒的制备及色谱柱填充方法及其应用。

背景技术

高效液相色谱(HPLC)是一种重要的分离工具，在许多领域都得到了广泛的应用。对于高效液相色谱来说，色谱填料必不可少的，且其粒径大小和结构对分离效果有着根本的影响。当所使用的填料粒度减小时，HPLC系统将获得两个方面的益处，即更快的分离速度和更高的柱效。柱率的提高能进一步改善分辨率，获得更高的峰容量和更高的检测灵敏度。为了追求更快和更高效的分离，近几十年来通过减小色谱填料的粒径产生了几代经典色谱填料：10微米，5微米，3.5 微米，全多孔亚2微米和表面多孔核壳结构的亚3微米色谱填料。后两者是目前的液相色谱分离中的行业标准。然而，由于流动相通过填充柱所需的压力与颗粒尺寸的平方成反比，更小的填料粒径意味着需要提供更高的压力，这不仅为色谱泵的输压能力而且为柱系统、连接管线和检测器等的耐压能力提出了挑战，因而使得纳米尺度上的填料颗粒在液相色谱分离中使用极具挑战。

早在1975年,Halász等预测了HPLC中填料的最低粒径不会低于1微米 [Halasz,I.；Endele,R.；Asshauer,J.Journal of Chromatography 1975,112,37-60]。直到2002年该预言才被打破,Cintrón和Colón实现了670nm的无孔有机硅在HPLC 中的使用[Cintron,J.M.；Colon,L.A.Analyst 2002,127,701-704]。该工作使用了能提供50,000psi压力的超高压输液泵，分离小分子化合物获得了～500,000塔板/米的高柱效。之后，Wirth等报道了330nm和470nm无孔硅胶填充柱上的液相色谱分离[Malkin,D.S.；Wei,B.C.；Fogiel,A.J.；Staats,S.L.；Wirth,M.J.Anal. Chem.2010,82,2175-2177；Wei,B.C.；Malkin,D.S.；Wirth,M.J.Anal.Chem. 2010,82,10216-10221；Wu,Z.；Wei,B.C.；Zhang,X.M.；Wirth,M.J.Anal.Chem. 2014,86,1592-1598]。然而，由于反压太高只能制得1-4厘米长的色谱柱，因而未能展现出高的实用价值。介孔材料是一类具有高比表面，规则孔道的特殊材料，已在吸附、催化和分离等领域中受到广泛的关注。MCM-41、MCM-48和SBA-15 等有序介孔材料已经在HPLC分离中展现出一定的潜力[Thoelen,C.；Van de Walle,K.；Vankelecom,I.F.J.；Jacobs,P.A.Chem.Commun.,1999,1841–1842；高峰, 赵建伟,张松,周峰,金婉,张祥民,杨芃原,赵东元.高等学校化学学报， 2002,23,1494-1497；Zhao,J.W.；Gao,F.；Fu,Y.L.；Jin,W.；Yang,P.Y.；Zhao,D.Y. Chem.Commun.2002,752-753]。但是，有序介孔材料填充为色谱柱时，并不能保证所有孔道朝一个方向排布，由于多路径效应而存在明显的涡流扩散，从而难以获得高柱效。更为重要的是，通过改进介孔材料的结构和形貌以实现纳米尺度色谱填料的使用的工作目前未见报道。

发明内容

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种具有中心通透且辐射状孔径结构的单分散介孔硅纳米颗粒色谱填料及其制备方法，及在色谱分离中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种单分散介孔硅纳米颗粒色谱填料，其特征在于，所述填料具有中心通透且辐射状孔径的球形结构，孔径为2-10nm，粒径为100-300nm，可在常规液相色谱输液泵的压力下制备成填充柱，并能获得超高的柱效，实现高分辨色谱分离。

其中，所述填料具有辐射状中心对称孔道，孔径尺寸为2-10nm；优选孔径尺寸约为5.6nm，但不排除其他孔径的使用。由此带来的独特益处：填料具有极高的通透性，使纳米尺度粒填料在液相色谱中的应用成为可能。此外，由该填料制备得到的填充柱具有非常高的均一程度，从而具有非常低的涡流扩散和径向扩散。

其中，填料的粒径通常为100-300nm，超低粒径的使用为液相色谱分离带来独特的益处：具有非常低的涡流扩散和传质阻力。该益处与上段的益处协同，为液相色谱分离带来超高的柱效。

进一步地，所述填料的形貌为球形，但不排除其他形貌的使用。

上述单分散介孔硅纳米颗粒色谱填料的制备方法，该方法在非均相油-水两相分层反应体系中，在表面活性剂或致孔剂存在的情况下，通过催化剂使反应物在油-水界面中发生自组装和聚合，实现一锅法连续的界面生长，从而得到具有纳米级粒径和一定尺寸的中心对称辐射状介孔的介孔硅纳米颗粒，通过化学改性后，得到所述单分散介孔硅纳米颗粒色谱填料。并将其用于色谱分离。

进一步地，所述油相包括但不限于1-十八烯烃、十氢萘和环己烷等。

进一步地，所述反应物，其特征在于，利用可自聚合的化合物(如原硅酸四乙酯)在溶液中自聚合形成介孔材料，制备介孔材料所用表面活性剂或致孔剂包括但不限于十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)等，其催化剂的选择包括但不限于三乙醇胺等。

进一步地，所述材料的基质为二氧化硅。但不排除其他基础如碳、二氧化钛等的使用。

进一步地，所述的填料改性方法，所述改性方法步骤为：将单分散介孔纳米颗粒加入到无水甲苯中，再加入功能化材料进行表面功能化基团改性。所述表面功能化基团，根据色谱分离的需求，可以使用辛基、十八烷基等疏水基团进行功能化，也可以使用其他基团如氨基、氰基等进行相应功能化。

一种单分散介孔硅纳米颗粒色谱填料在各种分离模式中的应用。色谱包括反相色谱、离子交换色谱和亲水相互作用色谱等。

色谱填料在色谱分离中的应用，其特征在于，根据需求将色谱填料填至相应色谱柱中，所述色谱柱的选择包括但不限于毛细管柱和钢柱等。本发明所述的利用具有中心通透且辐射状孔径结构的单分散介孔硅纳米颗粒制备的色谱填充柱在反相色谱等分离模式下展现出良好的应用前景。

上述具有中心通透且辐射状孔径结构的单分散介孔硅纳米颗粒制备的色谱填充柱在各种样品分离中展现出良好的应用前景。

根据色谱动力学原理(即H＝A+B/v+Cv，H为理论塔板高度,v为流动相速度，A、B、C分别为涡流扩散项、纵向扩散项和传质阻力项，为与粒径和填充均匀度有关的参数)可知，色谱填料的粒径越小、形貌和孔径越均一，则塔板高度越低，柱系统的分离效率就越高。对于相同流动相粘度、流速和色谱柱长度的色谱柱系统，其柱压降不仅与色谱填料的粒径大小的平方成反比，而且与色谱柱床的渗透性成反比。因此，发明人预期，具有中心辐射状介孔径结构(树枝状介孔)的单分纳米材料因为具有高的通透性可以使纳米尺度粒填料在液相色谱中的应用成为可能；同时，由于其介孔通道的取向是对称的，可以获得填充均匀程度高的色谱柱，涡流扩散项和纵向扩散项均极低，从而与因粒径降低的效应一起显著降低柱系统的塔板高度，从而能提供超高的分离柱效。基于该认知，发明人制备合成出粒径约为170nm，介孔孔径约为5.6nm的树枝状介孔有机二氧化硅纳米球，实验证明了其可操作性、超高柱效和超高分离性能。

有益效果：与现有技术相比，本发明首次采用具有中心通透且辐射状孔径结构的单分散介孔硅单分散纳米颗粒作为柱填料，成功制备了纳米级色谱柱填料，实现真正的纳米级的色谱分离操作。所用填料粒径是目前已知的最小粒径，尚未有类似文献和专利报道。与其他纳米级球形填料相比，该技术制备的色谱柱具有更高的渗透率。并且所得色谱柱具有极高的柱效，最高可达3,500,000塔板数/ 米，且无需特殊的仪器设备，即可实现高效快速分离。上述制备的色谱填充柱在各种实际样品分离中展现出良好的应用前景。

附图说明

图1为纳米材料的表征图，其中A为介孔材料的扫描电镜(SEM)表征，B 为氮气吸附曲线，C为孔径分布图，D为辛基功能化的介孔材料的X射线衍射 (XRD)图谱。

图2为不同孔径的色谱填料透射电镜(TEM)表征。

图3为填充好后的色谱柱的表征，其中A为大视野扫描电镜(SEM)表征， B为局部放大的扫描电镜(SEM)表征，C为高分辨扫描电镜(SEM)表征，D 为侧面显微镜照片。

图4为用C8功能化的介孔材料填充毛细管有效地分离芳香族化合物。洗脱顺序：硫脲，甲苯，丙苯和丁苯。

图5为不同细胞系5-氨基荧光素标记的聚糖的毛细管电色谱(CEC)色谱图绿色：荧光标记染料，浅灰条：仅在正常细胞上表达的N糖，暗条：在癌细胞和正常细胞上表达的N糖，浅蓝色条：仅在癌细胞上表达的N糖。

图6为本发明具有中心通透且辐射状孔径的功能化介孔纳米球的结构示意图。

具体实施方式

实施例1：功能化介孔材料的合成

硅基介孔材料的合成：对于反应体系来说，水相/油相＝3：1(体积/体积)。首先取10wt％的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和0.3wt％的三乙醇胺(TEA) 加入到水中，在60℃下搅拌1h，随后加入20v/v％原硅酸四乙酯(TEOS)的十氢萘溶液，在150rpm的搅拌速度及60℃下继续反应12h。随后弃去上层溶液，所的产物自然冷却，抽滤，依次用去离子水和乙醇洗涤，40℃下真空干燥 12h，得到硅基介孔材料。

通过将20v/v％原硅酸四乙酯(TEOS)的十氢萘溶液更换为20v/v％原硅酸四乙酯(TEOS)的1-十八烯、20v/v％原硅酸四乙酯(TEOS)的环己烷以及10 v/v％原硅酸四乙酯(TEOS)的环己烷溶液，制备介孔材料的孔径可以在2-10nm 的范围内可调。

为了除去所得硅基介孔材料中的模板分子CTAC，采用0.6wt％的硝酸铵回流12h。所得产物自然冷却，抽滤，依次用去离子水和乙醇洗涤，40℃下真空干燥12h。

我们采用后修饰的方法对硅基介孔材料表面进行修饰，具体步骤为：0.2g 材料超声分散于80mL新制备的无水甲苯中，随后加入1mL正辛基三乙氧基硅烷(OCTES)并在130℃下搅拌回流20h。所得的材料依次用去离子水和乙醇洗涤后在40℃下真空干燥12h，可得到最终使用的色谱填料，即C8功能化的介孔材料。

对于其他基团的修饰，0.2g材料超声分散于80mL新制备的无水甲苯中，随后分别加入1mL的十八烷基三乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷即可得到十八烷基(C18)或氨基功能化的介孔材料。本发明所得到的色谱填料结构如图 1纳米材料的表征图所示。得到的填料为球形单分散介孔硅纳米颗粒，具有中心通透且辐射状孔径结构，粒径170nm，比表面积为630cm

图2显示了不同孔径的色谱填料透射电镜(TEM)表征。

实施例2：色谱柱的填充

毛细管色谱柱的填充分为三个步骤:(1)临时柱塞的烧制；(2)填料填充； (3)永久柱塞的烧制。具体为：

(1)临时柱塞的烧制：取粒径为5μm的润湿硅胶，利用毛细管的虹吸作用吸入长约0.3cm的硅胶。自然晾干后，用火焰小心烧制5s。

(2)填料填充：将实施例1制得的色谱填料充分分散在乙腈中，制成50 mg/mL的匀浆后，用压力将其填入烧制了临时柱塞的毛细管中。(填至10cm左右时停止)

(3)永久柱塞的烧制：将填充了填料的毛细管的反向接至HPLC仪器上，在乙腈为流动相，0.1mL/min的流速下，用φ0.32mm镍镉电阻丝，在距压力入口10cm出烧制永久柱塞(25V,5s)。

如图3所示，制得的色谱填料均匀且紧密的填充在毛细管柱中，且其形貌和结构没有发生变化。

实施例3：C8功能化的介孔材料填充毛细管用于芳香族化合物毛细管电色谱分离

将实施例2制备好的毛细管柱(填充长度10cm，总长度30cm)安装到毛细管卡盒中，并将填充端放置在盒的出口端。在一定的时间内和适当的压力下，通过水动力注射将样品注入卡盒出口端的毛细管，毛细管点色谱分离采用反向电压进行，流动相为125mM Tris-HCl/ACN(20/80,v/v),pH 8.5。考察性能所用样品浓度为1mg/mL。

如图4所示，四种物质在9min内可以达到基线分离，且峰型优异。根据反相色谱理论，这4种物质在电色谱中的出峰顺序依次为硫脲，甲苯，丙苯，正丁基苯。其最高柱效可以达到3,500,000/m，塔板高度0.29μm。

实施例4：不同细胞系5-氨基荧光素标记的聚糖的毛细管电色谱分离

(1)细胞表面聚糖的酶切和分离：用肽-N-糖苷酶F(PNGaseF)对细胞表面的N-聚糖进行酶切。用10％胎牛血清在DMEM培养基中培养HepG-2、L-02、 HK-2、A-431和HaCat细胞2至3天(37℃，5％CO2)；用10％胎牛血清在 RPMI-1640培养基中培养OS-RC-2细胞3至4天(37℃，5％CO2)。当细胞密度达到80％～90％时，去除细胞培养基，用1×PBS洗涤细胞三次。然后用肠酶细胞消化液(含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA)对细胞进行适当的消化(HepG-2、L-02、HK-2和OS-RC-2细胞3-5min，A-431和HaCat细胞15-20min)。获得的细胞在1000rpm离心3min。去除上清液后，用1×PBS洗涤细胞两次，然后再分散到10mL含有2％BSA的1×PBS中，得到细胞悬液。随后，将PNGaseF 酶加入到10mL的细胞悬液中，然后在37℃水浴中孵育24小时，在200转/分钟下缓慢摇动，然后1000rpm离心3min，收集上清液后，加入100mg硼酸功能化磁性纳米材料，孵育30min。孵育完成后，糖基结合的磁性纳米材料被磁分离，用1×PBS洗涤两次。在此之后，将糖基结合的磁性纳米材料与1mL的冰乙酸孵育30min，然后去除磁性纳米材料，将溶液冻干，并收集得到的冻干粉末。

(2)聚糖的荧光标记：在酸性条件下，通过5-氨基荧光素氨基与半缩醛氨基之间的反应，实现了聚糖的荧光标记。将体积为5mL的甘氨酸水溶液 (200μg/mL)与5-氨基荧光素甲醇溶液(1×10

(3)毛细管电色谱分离：将制备好的毛细管柱(填充长度10cm，总长度 30cm)安装到毛细管卡盒中，并将填充端放置在盒的出口端。在一定的时间内和适当的压力下，通过水动力注射将样品注入卡盒出口端的毛细管，毛细管点色谱分离采用反向电压进行，流动相为125mM Tris-HCl/ACN(60/40,v/v),pH 8.5。

图5显示了两个癌细胞系和两个正常细胞系的N-糖聚糖分布。可以看出，一些N-聚糖在来自同一来源的癌性细胞和正常细胞上都有表达，尽管它们的表达水平几乎相同或略有不同。此外，一些N-糖聚糖仅在正常细胞上表达，但表达水平较低。更明显的是，与来自同一来源的正常细胞相比，大量的N-糖在癌细胞上过度表达。在这些N-聚糖中，相当多的是高度表达的。从这些结果可以清楚地看出，癌细胞上的N-糖基化与来自同一来源的正常细胞明显不同。因此，癌细胞上过度表达的N-糖聚糖可以被认为是癌症诊断和靶向治疗的潜在生物标志物。