载甲氨蝶呤脂质微泡、制备方法及其应用

摘要

本发明公开载甲氨蝶呤脂质微泡、制备方法及其应用；载甲氨蝶呤脂质微泡包括惰性气体/药液及壳层；壳层由化学键连甲氨喋呤的脂质衍生物和天然磷脂组成；化学键为酯键，在酸性环境和酯酶存在下可发生断裂，以爆破壳层。效果：本发明提供的载甲氨蝶呤脂质微泡是以共价键连甲氨喋呤药物的脂质衍生物作为成膜材料，当静脉注射后，血液中循环的载甲氨蝶呤脂质微泡可作为超声成像造影剂，以实现实时监测药物分布，当微泡到达治疗区域后可通过超声靶向爆破技术使微泡转化为载药纳米粒子，超声结合微泡产生的空化效应能有效促进细胞对纳米粒子药物的摄取，当这些纳米粒子药物进入细胞后能在病变部位酸性微环境和酯酶作用下释放，从而极大增强药物疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及医用药物技术领域，具体地讲，涉及一种载甲氨蝶呤脂质微泡、制备方法及其应用。

背景技术

类风湿性关节炎RA是一种病因及发病机制尚未完全明确，且以关节滑膜炎症为主要特征的慢性自身免疫性疾病，其发病率、致残和致死率高。目前临床可用于RA的药物较多，但缺乏选择性，长期高剂量使用易导致股骨头坏死、高血压、体重增加等副作用。关节腔内注射可使药物主要集中于受损关节部位，以提高疗效，降低全身毒副作用，但需多处关节反复给药，并受关节部位和关节腔大小等限制。因此，探索研究更安全有效的靶向给药系统成为了RA治疗的热点。

RA的一个关键特征在于慢性炎症细胞侵袭关节滑膜并增殖，导致新生血管的形成，并为增生的滑膜组织生长提供必要的营养和氧气。但这些病变的新生血管结构扭曲，使得通透性增强，具有类似肿瘤血管的通透增强与滞留效应，药物-大分子聚合物及胶粒给药系统可通过吞噬作用和EPR效应浓集于病变关节部位，缓慢释放药物而发挥靶向和长效治疗作用。

上述方法虽然有效改善了药物的递送效率，但其改善效果仍然有限，且缺乏响应的实时诊断功能。

而超声已被广泛用作临床癌症诊断的影像学方法。近年来，超声成像引起了人们的极大兴趣。与其他分子影像相比，超声受到的关注程度虽然低，但其确具有一些潜在的优势，它便宜，可被广泛利用，而且是一种非侵入性的诊断手段。此外，在微泡载体存在的情况下，应用超声可以利用超声空化作用，使载体内药物和基因更加容易进入组织和细胞。且微泡通常为直径是1毫米-8毫米的气体填充微球，它们通常被用作临床超声成像中的造影剂。经批准的成像剂(如C3F8或SF6微泡)可检测和表征心血管异常和实体器官病变。且微泡可以作为一个传递系统来加载各种疗法。通过使用超声靶向微泡破坏技术(ultrasoundtargeted microbubble destruction，UTMD)可以显著提高病灶对药物的积累。

然而，微泡的药物负载能力有限，使得仍是癌症理论学的一大难题。为了取得更好的治疗效果，在现阶段科研技术中，在微泡表面对药物或药物负载的纳米颗粒已经进行了多种改造，但仍存在制造复杂性和微泡稳定性的问题。

将微泡与药物结合，微泡会在超声刺激下导致局部剪应力增加，所以将声敏剂和微泡以稳定的状态结合，不仅可以提高治疗效果，还可以将超声成像诊断和治疗结合，实现诊疗一体化。且诊治一体化是当前纳米药物研究的热点之一，其具有很大的现实意义。传统意义上，诊断试剂和治疗试剂相互独立，两者先后给药，次数较多，且增加了病人的痛苦。而将诊断功能和治疗功能同时融合于同一载体，就可以减少给药次数，且使得流程简单。

因此，基于超声天然具有成像效果和靶向破坏微泡的能力，将成像和治疗统一于同一载体来研发一可用于超声成像诊断及类风湿关节炎的诊断、治疗的载甲氨蝶呤脂质微泡，以使更好确定肿瘤位置，并实现实时监测药物在肿瘤部位的富集情况，然后进行治疗，以达到最理想诊断治疗效果，则是可以研究的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术之不足而提供的一种载甲氨蝶呤脂质微泡、制备方法及其应用。

本发明解决现有技术问题所采用的其中一技术方案是：一种载甲氨蝶呤脂质微泡，包括惰性气体/药液及包载所述惰性气体/药液的壳层；

所述壳层由化学键连甲氨喋呤的脂质衍生物和天然磷脂组成；所述化学键为酯键，所述化学键在酸性环境和酯酶存在下可发生断裂，以爆破所述壳层。

下面对以上技术方案作进一步阐述：

优选地，所述惰性气体为全氟丙烷气体。

优选地，该微泡可在超声作用下转变为纳米粒子，所述纳米粒子的粒径为D1，所述D1＝20nm-700nm。

优选地，所述壳层由甲氨喋呤基团共价连接到脂质上，以构成甲氨喋呤脂质衍生物，其结构如下：

其中，所述n为正整数，所述n＝1-7。

优选地，连接有所述甲氨喋呤基团的脂质在甲醇与乙醇混合的溶液中可与其他磷脂混合后发生组装形成脂质体。

本发明解决现有技术问题所采用的又一技术方案是：一种载甲氨蝶呤脂质微泡，包括惰性气体/药液及包载所述惰性气体/药液的壳层；

所述壳层为成膜材料，所述壳层的粒径范围为D2；所述D2＝300nm-10um。

本发明解决现有技术问题所采用的另一技术方案是：一种载甲氨蝶呤脂质微泡的制备方法，包括以下步骤：

S1、通过化学合成的方法将含有羟基的磷脂和甲氨喋呤结构中的羧基基团反应形成酯键，由甲氨喋呤结构中的羧基基团共价连接到脂质上所构成的甲氨喋呤脂质衍生物结构如下：

其中，所述n为正整数，所述n＝1-7；连接有所述甲氨喋呤结构中的羧基基团的脂质在甲醇与乙醇混合的溶液中可与其他磷脂混合后发生组装形成脂质体；

S2、将一定比例的磷脂、胆固醇、甲氨喋呤脂质和荧光染料(Cy 7.5)置于甲醇和乙醇的混合液中进行溶解，以混合均匀而形成含有60％甲氨喋呤脂质的混合液；

S3、采用乙醇注入法，将步骤S2中得到的混合液滴加到生理盐水中，在40℃-60℃水浴中超声15分钟-30分钟；

S4、使用8000KD～14000KD的透析袋将得到的步骤S3中超声过的混合液放入生理盐水中并在室温下透析2h～4h；

S5、将步骤S4中透析过的混合液转移至西林瓶中，并加入丙二醇、甘油作为稳定剂，混匀。

S6、往西林瓶中填充惰性内包物质，并进行封口，封口后使用银汞调和器剧烈震荡45s，以进行分离提纯。

下面对以上技术方案作进一步阐述：

优选地，所述惰性内包物质为氟碳烃气体或C5-C12氟碳烃液体。

优选地，在本发明解决现有技术问题时，本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡应用在超声成像诊断上。

优选地，在本发明解决现有技术问题时，本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡应用在在超声波辐照激发下对类风湿关节炎的诊断及治疗上。

本发明的有益效果是：

其一、本发明所提供的一种载甲氨蝶呤脂质微泡，其特点是以共价键连甲氨喋呤药物的脂质衍生物作为成膜材料，在提高微泡载药量的同时可避免循环过程中的泄漏。当静脉注射后，血液中循环的载甲氨蝶呤脂质微泡可以作为超声成像造影剂，以实现实时监测药物分布，当微泡到达治疗区域后可通过超声靶向爆破技术使微泡原位转化为载药纳米粒子，超声结合微泡产生的空化效应还能有效促进细胞对纳米粒子药物的摄取，当这些纳米粒子药物进入细胞后即可在病变部位酸性微环境和酯酶作用下进行释放，从而能极大的增强药物疗效。

附图说明

图1是实施例一中，甲氨蝶呤碳链衍生物的合成路线图；

图2是实施例一中，甲氨蝶呤超声微泡的结构示意图；

图3是实施例二中，从左至右依次展现有甲氨蝶呤超声微泡电镜图像、甲氨蝶呤超声微泡超声荧光显微镜图像及甲氨蝶呤超声微泡超声击碎后的纳米粒子形态图像的展示图。

图4是实施例三中，甲氨蝶呤超声微泡在类风湿性关节炎新西兰大白兔模型增生的膝关节滑膜中的超声造影成像效果图；

图5是实施例四中，经过超声定点击破的MTX-MBS+US组膝关节病变部位的辐射荧光ROI值为5.423e

图6是实施例四中，没经过超声定点击破的MTX-MBS组膝关节病变部位的辐射荧光ROI值为2.866e

图7是实施例五中，比较M1组、M2组、M3组及M4组组间滑膜厚度变化率的展示图像；

图8是实施例五中，比较M1组、M2组、M3组及M4组组间积液深度变化率的展示图像；

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

以下将结合附图及具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便更清楚、直观地理解本发明的发明实质。

结合图1-图8所示；

本发明所提供的一种载甲氨蝶呤脂质微泡，包括惰性气体/药液及包载所述惰性气体/药液的壳层；

其中，所述壳层由化学键连甲氨喋呤的脂质衍生物和天然磷脂组成；所述化学键为酯键，所述化学键在酸性环境和酯酶存在下可发生断裂，以爆破所述壳层。

优选地，所述惰性气体为全氟丙烷气体。

且优选的，在本技术方案中，本发明所提供的一种载甲氨蝶呤脂质微泡可在超声作用下转变为纳米粒子，所述纳米粒子的粒径为D1，所述D1＝20nm-700nm。

且优选地，在本技术方案中，所述壳层由甲氨喋呤基团共价连接到脂质上，以构成甲氨喋呤脂质衍生物，其结构如下：

其中，所述n为正整数，所述n＝1-7。

再者，在本技术方案中，连接有所述甲氨喋呤基团的脂质在甲醇与乙醇混合的溶液中可与其他磷脂混合后发生组装形成脂质体。

同时，在又一实施例中，本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡，包括惰性气体/药液及包载所述惰性气体/药液的壳层；

其中，所述壳层为成膜材料，所述壳层的粒径范围为D2；所述D2＝300nm-10um。

本发明的目的之一是提供一种新型的甲氨喋呤-微泡递送系统，其区别于传统的包载、吸附，共价键连结合更加稳定，增加了载药量，且可以通过改变投料量来调节载药量。

本发明的目的之二是提供一种可以超声成像，以及超声定点控释的诊断治疗一体化的微泡药物载体，解决临床上传统小分子化疗药物靶向性差，副作用大，非特异性分布以及诊断治疗分开给药等问题。

而且本发明可以成功结合微米级载体以及纳米载体的优点：微泡由于其尺寸在微米范围内，循环过程中主要是在血管中，不会滞留在正常组织，当这些微泡通过病变区域时通过超声定点爆破，使微泡原位转化为载药的纳米粒子，超声结合微泡产生的空化效应同时会促进纳米药物进入病变区域，并有效释放药物进行治疗。

且本发明具有明显的优势：

(1)超声成像实时检测药物载体在体内的分布情况，可以对病变组织进行诊断；

(2)通过微泡的定点爆破实现药物的局部高浓度富集，极大增强疗效的同时降低了传统全身给药带来的毒副作用；

(3)将超声诊断和药物治疗结合到一起，可以减少诊断和治疗带来的多次给药以及诊断剂和治疗药物分布不一致的问题。

为达到上述目的，本发明构建了一种以对酸性微环境和酯酶响应的共价键酯键将治疗药物甲氨喋呤与微泡进行连接。该甲氨喋呤脂质衍生物具有单个疏水脂肪碳链和一个甲氨喋呤分子，该结构使其可以与其他两亲性磷脂发生组装，从而作为超声微泡的膜层材料。

因此，基于上述方案，本发明则还提供上述所述载甲氨蝶呤脂质微泡的制备方法，其包括以下步骤：

S1、通过化学合成的方法将含有羟基的磷脂和甲氨喋呤结构中的羧基基团反应形成酯键，由甲氨喋呤结构中的羧基基团共价连接到脂质上所构成的甲氨喋呤脂质衍生物结构如下：

其中，所述n为正整数，所述n＝1-7；连接有所述甲氨喋呤结构中的羧基基团的脂质在甲醇与乙醇混合的溶液中可与其他磷脂混合后发生组装形成脂质体；

S2、将一定比例的磷脂、胆固醇、甲氨喋呤脂质和荧光染料(Cy 7.5)置于甲醇和乙醇的混合液中进行溶解，以混合均匀而形成含有60％甲氨喋呤脂质的混合液；即该混合液中则要求含有甲氨喋呤脂质的比例为60％；

S3、采用乙醇注入法，将步骤S2中得到的混合液滴加到生理盐水中，在40℃-60℃水浴中超声15分钟-30分钟；

S4、使用8000KD～14000KD的透析袋将得到的步骤S3中超声过的混合液放入生理盐水中并在室温下透析2h～4h；

S5、将步骤S4中透析过的混合液转移至西林瓶中，并加入丙二醇、甘油作为稳定剂，混匀。

S6、往西林瓶中填充惰性内包物质，并进行封口，封口后使用银汞调和器剧烈震荡45s，以进行分离提纯。

如此，经上述步骤S6后，即可得到共价键连甲氨喋呤的诊疗一体化微泡，即得到本申请所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡。

优选地，在上述步骤S6中，所述惰性内包物质为氟碳烃气体或C5-C12氟碳烃液体。

且优选地，在本发明解决现有技术问题时，本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡应用在超声成像诊断上。

同时，在本发明解决现有技术问题时，本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡应用在在超声波辐照激发下对类风湿关节炎的诊断及治疗上。

在上述制备方法中，本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡，将甲氨喋呤脂质和传统磷脂共成膜，化疗药物的比例可根据需要进行调控，载药量大大提高；

同时，其能够通过超声精准定位病变组织，并且在超声作用下实现载药微泡定点爆破，能增加药物在病变组织中的富集，有效减少药物在正常组织中的停留，降低毒副作用，显著改善疗效。

本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡的实体直径在2微米-5微米之间，超声击破后尺寸在50纳米-500纳米。

本发明具有以下优点：

本发明的优点之一是：利用稳定的酯键将脂质碳和甲氨蝶呤连接，然后通过自组装形成的微泡更加稳定，载药量更高，在药物到达靶向区域之前可有效避免药物的泄漏。

本发明的优点之二是：微泡在具有超声成像能力的同时，还可实现诊疗一体，在临床上更加具有实践意义。

本发明的优点之三是：将纳米粒子系统和微米载体系统的优点结合在一起，既减少了非病灶区域的药物摄取，降低了药物的副作用，又增加了病灶区域的甲氨蝶呤分布，增强了治疗效果。

综上所述，本发明作为甲氨蝶呤超声造影剂使用时，可实时监测药物在体内的分布，当其到达病变区域后，联合超声辐照利用超声定点靶向爆破技术(UTMD)，可使本发明爆破，本发明释放出的药物在肿瘤位置的积累会显著增加，治疗效果能得到较好改善，从而实现类风湿关节炎的定点精确治疗。

而为验证本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡的功能及效果，以下将结合一些实施例做进一步阐述。

实施例一

本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡的制备方式如说明书附图1及说明书附图2所示；图1是本发明中甲氨蝶呤碳链衍生物的合成路线图；图2是本发明中甲氨蝶呤超声微泡的结构示意图；

将1mol的甲氨蝶呤溶于5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入2mol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.4mol的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌30min后，再加入1mol的十六醇，50℃反应过夜，减压真空旋干二甲基甲酰胺(DMF)后，硅胶柱层析分离提纯。利用质谱及核磁确定产物相对分子质量以及结构正确。

1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：0.96(m，CH3，3H)，1.29-1.33(m，CH

其中，甲氨蝶呤碳链衍生物的合成反应式为：

实施例二

(1)对已经制备好的甲氨蝶呤微泡进行荧光显微镜下观察，得到白光下的图像。

(2)然后取1mL甲氨蝶呤微泡进行超声破碎，进行动态光散射和zeta电位评价，之后对纳米粒子进行透射电镜下观察，得到图像结果。

最后结果对照说明书图3所示，在说明书附图3中，从左至右依次展现有甲氨蝶呤超声微泡电镜图像、甲氨蝶呤超声微泡超声荧光显微镜图像及甲氨蝶呤超声微泡超声击碎后的纳米粒子形态图像；

本发明所提供的载甲氨蝶呤脂质微泡的实体直径在2微米-5微米之间，超声击破后尺寸在50纳米-500纳米。

实施例三

本发明的活体成像效果评价主要包括如下步骤：

(1)选取一只2-2.5kg雌性新西兰白兔，将腹部毛发剔除。经耳缘静脉注射乌拉坦用于麻醉。在腹部涂上超声耦合剂，用超声仪器进行携甲氨蝶呤微泡的类风湿关节炎膝关节滑膜超声造影成像。

(2)将1mL甲氨蝶呤微泡稀释于5ml的生理盐水中，经耳缘静脉团注后，注射5mL生理盐水冲管，进行新西兰大白兔类风湿关节炎膝关节超声造影(频率为4.7MHz，机械指数为0.072)。储存动态图像。

结果对照说明书图4所示，其为甲氨蝶呤超声微泡在类风湿性关节炎新西兰大白兔模型增生的膝关节滑膜中的超声造影成像效果图，在注射甲氨蝶呤微泡之后，在新西兰大白兔的膝关节增生滑膜能看到明显的超声造影成像效果，验证了本发明的造影功能，证明了本发明能很好地作为造影剂使用。

实施例四

本发明的生物分布评价步骤如下所述：

(1)动物模型的建立：健康新西兰兔26只被置于20-26℃、50％湿度、标准食物和水的温控室内。采用卵蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的关节炎模型。分为基础致敏和局部致敏。基础致敏即将OVA用0.9％NaCl稀释，与完全弗氏佐剂1∶1混合，反复搅拌均匀充分乳化，乳化程度为滴于冰水完全不扩散，配置为浓度4mg/ml的乳化液。于兔肩胛间区的5个部位进行皮内注射上述乳化液，每只1ml，共注射2次，间隔14天。局部致敏即OVA用0.9％NaCl溶液稀释，配置为5mg/ml的OVA溶液。于第2次基础致敏注射5天后，对兔胫骨结节最高点与髌骨下缘连线之中点的髌韧带两侧关节腔内分别注射1ml，每周1次，连续4周；

(2)参考相关指南推荐治疗类风湿性关节炎0.2mg/kg/周的药物用量，于第4次局部致敏结束2天后，经耳缘静脉缓慢注射给药，每周注射1次，共治疗4周。需爆破组注射后爆破条件机械指数为1.2MHz，爆破时间2分钟。

实验结果对照说明书附图5及说明书附图6所示，图5是经过超声定点击破的MTX-MBS+US组膝关节病变部位的辐射荧光ROI值为5.423e

为研究MTX脂质体在兔RA模型膝关节病变部位的摄取能力。将兔RA模型麻醉后，以788nm激光激发，并接收808nm发射波长，用小动物活体成像仪对各组模型膝关节病变部位进行分析，得到对应时间的平均荧光强度。

结果表明，经过超声定点击破的MTX-MBS+US组中，可观察到病变部位的甲氨蝶呤富集，MTX-MBS+US组病变部位的药物摄取能力显著高于经过超声定点击破的MTX-MBS组。

由此，则表明携甲氨蝶呤脂质微泡在兔RA模型膝关节内的分布由于超声靶向微泡破坏的技术而达到一个比较理想的程度，提高了病变部位的摄取。

实施例五

本发明的治疗效果评价步骤如下所述：

(1)兔类风湿性关节炎模型的建立：采用卵蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的关节炎模型，将结直肠癌细胞HT-29细胞以每只裸鼠2X106个细胞的数量接种于裸鼠的大腿右后侧，并将新西兰兔置于20-26℃、50％湿度、标准食物和水的温控室内饲养。

(2)根据是否建立模型，随机将实验动物分为对照组(4例)与模型组(48例)。建模成功后，根据治疗方式，将模型组分为4组，分别为：携甲氨蝶呤脂质微泡联合超声辐照组(M1组)，治疗期静脉注射携甲氨蝶呤脂质微泡，并使用超声辐照爆破微泡；携甲氨蝶呤脂质微泡组(M2组)，治疗期静脉注射携甲氨蝶呤脂质微泡，不使用超声辐照爆破微泡；甲氨蝶呤组(M3组)，治疗期静脉注射甲氨蝶呤药物；未治疗组(M4组)，全程不予以治疗。

多普勒超声测量滑膜厚度、积液深度，分别于2次局部致敏后、4次局部致敏后，2次治疗后，4次治疗后，共行4次多普勒超声测量，每项指标测量3次取平均值。

实验结果对照说明书附图7及说明书附图7所示；

图7是比较M1组、M2组、M3组及M4组组间滑膜厚度变化率的展示图像；图8是比较M1组、M2组、M3组及M4组组间积液深度变化率的展示图像；

经过全程治疗后，治疗组中滑膜与积液未见继续增加。未治疗组中约半模型滑膜与积液继续增加。其中治疗后M1组、M2组分别与M4组滑膜厚度变化率(T治疗后/T治疗前-1)组间差异有统计学意义(P＜0.05)。M1与M4的积液深度变化率(T治疗后/T治疗前-1)组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

由此，则表明超声辐照携甲氨蝶呤脂质微泡可增加MTX释放的总量，表现出更好的治疗效果。

因此，参照本申请所提供的技术方案，并结合上述五个实施例的阐述，可以总结：本发明所提供的一种载甲氨蝶呤脂质微泡，其特点是以共价键连甲氨喋呤药物的脂质衍生物作为成膜材料，在提高微泡载药量的同时可避免循环过程中的泄漏。当静脉注射后，血液中循环的载甲氨蝶呤脂质微泡可以作为超声成像造影剂，以实现实时监测药物分布。当微泡到达治疗区域后可通过超声靶向爆破技术使微泡原位转化为载药纳米粒子，超声结合微泡产生的空化效应还能有效促进细胞对纳米粒子药物的摄取，当这些纳米粒子药物进入细胞后即可在病变部位酸性微环境和酯酶作用下进行释放，从而能极大的增强药物疗效。。

因此，本发明实用性强，市场前景巨大，使得本发明必然具有很好的市场推广价值，本发明会非常的受欢迎，能得到有效普及及全面推广使用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非而因此限制了本发明的专利保护范围，凡是利用本发明的说明书及附图内容所作出的等效结构或等效流程的变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。