大豆苷元在制备减轻铂类药物毒性的药物中的应用

摘要

本发明提供了大豆苷元在制备减轻铂类药物毒性的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种。本发明通过实验验证了大豆苷元可以减轻铂类药物对骨骼肌分化的抑制作用，并且可以下调骨骼肌降解相关蛋白，减轻铂类药物对肾脏的损伤，为制备减轻铂类药物毒性的药物提供了策略；此外，大豆苷元来源广泛，成本低廉，可被大量使用于制备减轻铂类药物毒性的药物中。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及大豆苷元在制备减轻铂类药物毒性的药物中的应用。

背景技术

铂类药物是当前在肿瘤治疗中应用非常广泛的一类化疗药物，适用于肺癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、多种消化道肿瘤等。铂类药物主要通过作用于肿瘤细胞DNA，与DNA形成加合物影响肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期，并诱导肿瘤细胞凋亡或坏死从而发挥抗癌作用。但是，铂类药物也存在很多毒副作用，如肾毒性、骨骼肌毒性等。这些毒副作用严重限制了铂类药物的临床应用，降低肿瘤病人对铂类药物的耐受，大大削弱了铂类药物的临床疗效。当前仅有采取水化的方法预防铂类药物导致的机体损伤，尚无特效干预手段。寻求减轻铂类药物毒性的方法或者治疗药物对于提高基于铂类药物的化疗方案的疗效具有重要意义。

中医药的临床应用历史悠久，在针对肿瘤及相关并发症的治疗中以中药汤药的应用更为广泛。然而中药汤药存在质控困难、变换频繁的缺点，致使难以实现大规模的推广。中药天然产物是一个待开发的药物资源库，紫杉醇、小檗碱等化学药物都源自植物药。养正消积胶囊、参附注射液、参苓白术散等中药复方在治疗癌症及减轻化疗药物毒副作用中已出现了很多正向的报道。从中药中筛查出减轻铂类药物毒性的小分子化合物，并且将其转化为化学药物对于开发减轻铂类药物毒性的治疗方案具有重要意义。

当前已存在很多铂类药物毒性的体内外模型可用于开发减轻铂类药物毒性的药物。奥沙利铂作用于C26荷瘤小鼠确实可以抑制肿瘤生长，但也导致肌肉萎缩。这一过程与自噬的启动、线粒体损伤和蛋白质合成被抑制有关。顺铂(DDP)在多种癌症模型中可以引起厌食、骨骼肌萎缩等症状，并且显著上调血浆皮质酮水平，顺铂相关的肌肉萎缩与激活NF-kappa B信号通路诱导炎症有关。DDP作用于大鼠和小鼠可以导致肾脏出现肾小球、肾小管的炎性改变，提升血尿素氮、血肌酐的水平。顺铂与小鼠C2C12肌管细胞共培养会使得C2C12肌管细胞发生萎缩，这一过程与泛素-蛋白酶体通路的激活有关。将中药相关小分子化合物作用于以上体内外模型可以对该小分子化合物的减轻铂类药物毒性的药理作用进行初步评价。

大豆苷元(daidzein，DAI，分子式：C

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了大豆苷元在制备减轻铂类药物毒性的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供大豆苷元在制备减轻铂类药物毒性的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种。

进一步地，上述铂类药物包括顺铂。

本发明的第二方面是提供大豆苷元在制备减轻铂类药物诱导的肌管细胞萎缩的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种。

本发明的第三方面是提供大豆苷元在制备调控铂类药物对肌管细胞中MyHC、Atrogin1、MuRF1、MyoG蛋白表达的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种。

进一步，MyHC、MyoG蛋白表达水平被上调，而Atrogin1、MuRF1蛋白的表达水平被显著下调。

本发明的第四方面是提供大豆苷元在制备缓解铂类药物导致的肾小球、肾小管损伤的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种。

本发明的第五方面是提供大豆苷元在制备缓解铂类药物干预导致的血尿素氮、血肌酐的水平上升的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种。

进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。

进一步地，药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

本发明的第六方面是提供一种药物组合物，包括铂类药物和大豆苷元。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明通过实验验证了大豆苷元可以减轻铂类药物对骨骼肌分化的抑制作用，并且可以下调骨骼肌降解相关蛋白，减轻铂类药物对肾脏的损伤，为制备减轻铂类药物毒性的药物提供了策略；此外，大豆苷元来源广泛，成本低廉，可被大量使用于制备减轻铂类药物毒性的药物中。

附图说明

图1为本发明一实施例中大豆苷元对经顺铂刺激的小鼠C2C12肌管细胞分化的影响结果图；其中，图A为不同处理组的肌管细胞的荧光显微镜结果，图B为对图A荧光区域MyHC荧光阳性面积进行统计的结果，图C为对图A肌管内外细胞核数量进行统计的结果；

图2为本发明一实施例中大豆苷元对经顺铂刺激的小鼠C2C12肌管细胞MyHC、Atrogin1、MuRF1、MyoG蛋白表达的影响结果图；其中，图A为大豆苷元对MyHC、Atrogin1、MuRF1、MyoG蛋白表达的影响的WB结果图；图B为不同处理组中，MyHC蛋白相对表达的柱状统计图；图C为不同处理组中，Atrogin1蛋白相对表达的柱状统计图；图D为不同处理组中，MuRF1蛋白相对表达的柱状统计图；图E为不同处理组中，MyoG蛋白相对表达的柱状统计图；

图3为本发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的体重(图A)、瘤块体积(图B)、摄食量(图C)的影响结果图；

图4为本发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的肿瘤重量(图A)、摄食量(图B)、腓肠肌重量(图C)、胫骨前肌重量(图D)、肾脏重量(图E)、附睾脂肪重量(图F)的影响结果图；

图5为本发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的腓肠肌肌纤维横截面积的影响结果图，图A为大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的腓肠肌肌纤维横截面HE染色结果，图B为腓肠肌肌纤维横截面面积分布结果，图C为腓肠肌肌纤维横截面面积的柱状统计图；

图6为发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的腓肠肌肌纤维类型的影响结果图，图A为大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的腓肠肌肌纤维横截面SDH染色结果，图B为腓肠肌肌纤维类型分布结果，图C为腓肠肌肌纤维类型基因Myh2、Myh4、Myh7的mRNA表达水平柱状统计图；

图7为本发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的腓肠肌中MyHC、Atrogin1、MuRF1蛋白表达的影响结果图；其中，图A为腓肠肌中MyHC、Atrogin1、MuRF1蛋白表达的影响westernblot结果，图B为MyHC蛋白相对表达的柱状统计图，图C为Atrogin1蛋白相对表达的柱状统计图，图D为MuRF1蛋白相对表达的柱状统计图；

图8为本发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的肾脏损伤的影响结果图；

图9为本发明一实施例中大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠血尿素氮(图A)和血肌酐(图B)表达的影响柱状统计图。

具体实施方式

本发明提供了大豆苷元在制备减轻铂类药物毒性的药物中的应用，该药物的有效成分为大豆苷元、大豆苷元的水合物、大豆苷元药学上可接受的盐、大豆苷元的互变异构体、大豆苷元的立体异构体、大豆苷元的前体化合物中的一种或几种；该药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。其中：

术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体，例如：烯醇与相应的酮。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。

术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。

术语“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。“载体或赋形剂”包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。

在本发明一优选的实施方式中，填充剂为纤维素、甘露糖醇、乳糖中的一种或几种；崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉衍生物中的一种或几种；润滑剂为硬脂酸镁；润湿剂为十二烷基硫酸钠。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例验证大豆苷元对经顺铂刺激的小鼠C2C12肌管细胞分化的抑制作用，具体的实验内容和结果如下：

小鼠C2C12成肌细胞经2％马血清诱导分化为肌管细胞，用25μM大豆苷元及40μM顺铂(DDP)单用或同时使用与C2C12肌管细胞共培育24h，经固定、透膜、封闭后，孵育MyHC一抗4℃过夜，一抗孵育后经清洗孵育同型荧光二抗2小时，二抗孵育完成并清洗后孵育DAPI进行细胞核染色，孵育10min，清洗后加入抗荧光淬灭剂覆盖，最后荧光显微镜拍照，结果如图1A所示，对图1A荧光区域MyHC荧光阳性面积进行统计结果如图1B所示(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，下同)，对图1A肌管内外细胞核数量进行统计，计算融合指数(肌管内细胞核数量与总细胞核数量的比值)，统计结果如图1C所示。由图1可知，C2C12肌管细胞经DDP处理24h后，肌管面积明显减小，发生萎缩，融合指数也出现下降。随大豆苷元浓度增大，MyHC标记的肌管细胞面积逐渐增大，融合指数上升，反映了大豆苷元可以减轻DDP诱导的C2C12肌管细胞萎缩。

实施例2

本实施例验证大豆苷元对经顺铂刺激的小鼠C2C12肌管细胞MyHC、Atrogin1、MuRF1、MyoG蛋白表达的调控作用，具体的实验内容和结果如下：

小鼠C2C12成肌细胞经2％马血清诱导分化为肌管细胞，用25μM大豆苷元及40μM顺铂(DDP)单用或同时使用与C2C12肌管细胞共培育24h，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后调平各样本蛋白浓度，western blot法检测肌分化与降解相关蛋白MyHC、Atrogin1、MuRF1、MyoG的表达，结果如图2所示。

由图2可知，C2C12肌管细胞经DDP处理24h后，MyHC、MyoG蛋白表达水平明显下降，肌蛋白降解相关的Atrogin1、MuRF1蛋白表达水平显著上升，在大豆苷元的干预下，MyHC、MyoG的蛋白表达水平被上调，而Atrogin1、MuRF1蛋白的表达水平被显著下调。

实施例3

本实施例验证大豆苷元对顺铂治疗下的LLC荷瘤小鼠的肌肉与肾脏毒性相关症状体征的减轻作用，具体的实验内容和结果如下：

第一天，将LLC细胞(2×10

第18天所有小鼠处死取材，检测瘤重、腓肠肌重量、胫骨前肌重量、肾脏重量、附睾脂肪重量以及前肢抓力，结果如图4A-F所示。经大豆苷元干预后，小鼠腓肠肌重量、胫骨前肌重量、肾脏重量、附睾脂肪重量以及前肢抓力显著提升。经大豆苷元干预后小鼠腓肠肌肌纤维横截面面积显著提升，如图5所示。SDH染色结果显示，DDP的干预使得小鼠骨骼肌中II型肌纤维比重下降，而大豆苷元的干预使得II型肌纤维比重上调，如图6A、B所示。腓肠肌中与II型肌纤维相关的Myh2和Myh4 mRNA的表达水平也被DDP显著下调，大豆苷元的干预也部分恢复了Myh2和Myh4 mRNA的表达水平，如图6C所示。取腓肠肌提取总蛋白，western blot法检测MyHC、Atrogin1、MuRF1蛋白的表达，DDP的干预使得MyHC的表达下调，Atrogin1、MuRF1的表达上调，而大豆苷元上调了MyHC的表达，下调了Atrogin1、MuRF1的表达，如图7所示。DDP的干预使得小鼠肾脏肾小球部分血管扩张充血，上皮细胞边界模糊，肾小管组织水肿，且出现蛋白管型，而大豆苷元的干预缓解了肾小球和肾小管的病变，如图8所示。取小鼠血清，检测血尿素氮、血肌酐的水平，大豆苷元的干预缓解了顺铂干预导致的血尿素氮、血肌酐的水平上升，如图9所示。

由上述实施例可知，大豆苷元可以减轻铂类药物对骨骼肌分化的抑制作用，并且可以下调骨骼肌降解相关蛋白的表达，对顺铂导致的肾小球、肾小管损伤也有缓解作用，这为制备减轻铂类药物毒性的药物提供了策略。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。