食管鳞癌淋巴结转移标志物、其检测试剂、检测系统及应用

摘要

本发明涉及食管鳞癌诊断、治疗领域，具体涉及食管鳞癌淋巴结转移标志物、其检测试剂、检测系统及应用。所述标志物为胱硫醚β‑合成酶，本发明通过检测受试者组织中胱硫醚β‑合成酶的含量可以判断受试者食管鳞癌淋巴是否转移，另外，本发明通过细胞实验及动物实验证明，下调胱硫醚β‑合成酶可以抑制食管鳞癌淋巴转移，该结果为治疗食管鳞癌淋巴结转移提供新思路。

说明书

技术领域

本发明涉及食管鳞癌诊断、治疗领域，具体涉及食管鳞癌淋巴结转移的标志物、其检测试剂、检测系统及应用。

背景技术

食管癌淋巴结转移是影响食管癌患者预后的最重要因素之一，近年来淋巴结转移数对肿瘤预后影响越来越受到人们重视。手术是治疗食管癌主要方法之一，但单纯手术效果较差，术后失败主要原因是复发和转移。

胱硫醚β-合成酶(Cystathionineβ-sunthase，CBS)是一种吡哆醛磷酸依赖性酶，以63kDa的同源四聚体形式存在，以半胱氨酸为底物催化内源性H

发明内容

有鉴于上述技术问题，本发明提供了诊断食管鳞癌淋巴结转移标志物，及抑制食管鳞癌淋巴结转移的药物作用靶点，为食管鳞癌的诊断和治疗提供有价值的帮助。

本发明的目的之一是提供食管鳞癌淋巴结转移标志物，所述标志物为胱硫醚β-合成酶。

本发明的目的之二是提供检测所述食管鳞癌淋巴结转移标志物的试剂在制备食管鳞癌淋巴结转移诊断工具中的应用。

本发明的目的之三是提供一种检测所述食管鳞癌淋巴结转移标志物的检测系统，其包括接收部分，以接收来自食管鳞癌患者的样品，并且所述样品中包含胱硫醚β-合成酶；检测部分，其包括能检测胱硫醚β-合成酶的物质。

进一步的，所述检测部分包括能够与胱硫醚β-合成酶结合的物质。

进一步的，所述物质是选自由抗体或其抗原结合片段、相互作用融合蛋白、适体和亲和体组成的生物特异性捕获剂。

进一步的，所述系统是生物芯片或测试条或微量滴定板。

本发明的目的之四是提供所述食管鳞癌淋巴结转移标志物的抑制剂在制备抑制食管鳞癌淋巴结转移的药物中的应用。

进一步的，所述抑制剂包括能够下调胱硫醚β-合成酶或涉及其上游或下游途径的物质的表达或活性的抑制剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现了胱硫醚β-合成酶(以下或简称为CBS)与食管鳞癌淋巴结转移相关，通过检测受试者CBS的表达，可以判断受试者食管鳞癌淋巴结是否转移以及是否存在转移风险，从而指导提供预防和治疗方案。

本发明通过实验证明，下调CBS的表达可抑制淋巴结转移，可以为治疗食管鳞癌淋巴结转移提供新思路。

附图说明

图1为免疫组织化学法检测CBS在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达，A为组织拍照图，B为CBS表达阳性率(％)，C为CBS评分。

图2为免疫组织化学法检测CBS在无淋巴结转移和有淋巴结转移食管鳞癌组织中的表达，A为组织拍照图，B为CBS表达阳性率(％)，C为CBS评分。

图3为免疫蛋白印迹法检测CBS在食管鳞癌组织和癌旁组织中的表达(A)和CBS蛋白表达水平的统计图(B)。

图4为免疫蛋白印迹法检测CBS在有淋巴结转移食管鳞癌组织和无淋巴结转移食管鳞癌组织中的表达(A)和CBS蛋白表达水平的统计图(B)。

图5为CBS在转染CBS siRNA和scrambled siRNA的KYSE450细胞中的表达，图A为免疫蛋白印迹法检测结果，图B为CBS蛋白表达水平的统计图。

图6为CBS在转染CBS过表达质粒和空载质粒的Eca109细胞中的表达，图A为免疫蛋白印迹法检测结果，图B为CBS蛋白表达水平的统计图。

图7为CBS表达下调对KYSE450细胞生长(A)、增殖(B)、迁移(C)和侵袭(D)的影响。

图8为CBS过表达对Eca109细胞生长(A)、增殖(B)、迁移(C)和侵袭(D)的影响。。

图9为CBS不同表达水平对食管鳞癌细胞诱导脐静脉内皮细胞成管能力的影响，A为CBS表达下调后脐静脉内皮细胞生成血管的图像，B为CBS表达下调后脐静脉内皮细胞生成血管的数量统计，C为过表达CBS脐静脉内皮细胞生成血管图像，D为过表达CBS脐静脉内皮细胞生成血管的数量统计。

图10为CBS不同表达水平对食管鳞癌细胞诱导淋巴内皮细胞成管能力的影响，A为CBS表达下调后淋巴内皮细胞生成淋巴管的图像，B为CBS表达下调后淋巴内皮细胞生成淋巴管的数量统计，C为过表达CBS淋巴内皮细胞生成淋巴管的图像，D为过表达CBS淋巴内皮细胞生成淋巴管的数量统计。

图11为CBS表达下调对爪垫同侧腘窝淋巴结转移的影响，A为淋巴结大小，B为HE染色结果。

图12为CBS表达下调对腋下同侧腋窝淋巴结转移的影响，A为淋巴结大小，B为HE染色结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CBS差异表达

1、检测组织芯片中食管鳞癌及癌旁组织中CBS蛋白的表达，淋巴结转移癌组织和非淋巴结转移癌组织中CBS蛋白的表达

(1)样本收集

食管鳞癌患者组织(含癌和癌旁)68例。

淋巴结转移性食管鳞癌组织48例。

淋巴结非转移性食管鳞癌组织25例。

(2)实验方法

免疫组织化学法。包埋切片后烤片，温度设置80℃，时间1-2h；脱蜡2次，每次15min，复水按照酒精浓度100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％每次5min；在3％H

(3)实验结果

CBS在食管鳞癌患者癌组织中的表达率明显高于癌旁组织。在75例食管鳞癌患者组织中，除去7例患者癌旁组织未检测到食管粘膜外，其余68例患者癌组织与癌旁组织相比，有53例癌组织阳性表达率高于癌旁，占78％(见图1)。所有患者中除去两例患者没有N分期资料外，有48例患者伴有淋巴结转移，在有淋巴结转移的患者中根据淋巴结转移程度将患者分为N1期、N2期和N3期。其中无淋巴结转移的N0期有25例，有淋巴结转移的N1期有19例，N2期有13例，N3期有16例。将所有患者分为N0、N1、N2、N3四组，分析比较CBS的表达与患者淋巴结转移N分期的关系。CBS在有淋巴结转移食管鳞癌患者组织中的表达水平明显高于无淋巴结转移食管鳞癌患者且与转移强度成正相关(见图2)。

2、检测10例食管鳞癌患者的癌和癌旁组织中CBS的表达，淋巴结转移和非淋巴结转移癌组织中CBS的表达

实验方法：免疫蛋白印迹法。先提取组织蛋白并按照BCA试剂盒定量，按照电泳-转膜-封闭-孵育一抗-孵育二抗-显影的顺序进行实验。

实验结果：在所有病例中，有6例癌组织中的CBS表达明显多于癌旁组织，占60％(见图3)。在伴随淋巴结转移的癌组织中CBS蛋白表达明显多于非淋巴结转移的癌组织，表明CBS的高表达能够促进食管鳞癌的淋巴结转移(见图4)。

实施例2

CBS不同表达水平对食管鳞癌细胞生物学活性的影响

(1)实验材料

KYSE450、Eca109细胞：获赠于新乡医学院。

CBS过表达质粒：购自Genechem公司(中国上海)。

CBS siRNA：合成于上海吉玛制药技术公司(见表1)。

表1 siRNA序列

(2)实验方法：

①siRNA和质粒转染：细胞传代离心后，取10μL细胞悬液用PBS稀释20倍在计数板下计数，根据每种细胞的生长状态不同计算合适的细胞量。将一定量细胞接种于6孔板中，接种后用十字法摇晃6孔板使细胞分散均匀，将6孔板放置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。第2天当细胞密度达到60％后开始进行转染。转染过程使用无血清无双抗的培养基。根据转染的孔数取出EP管，先将CBS siRNA或CBS过表达质粒在单独的EP管中与培养基轻混，将Lipofectamine 2000在单独EP管中与培养基轻混，两者混匀后静置5min。5min后将两个EP管中的液体轻轻混合，静置20min。从培养箱中取出6孔板弃去原有的培养基,用PBS清洗两遍，将EP管中的液体滴加到6孔板中，将6孔板放回培养箱继续培养，6孔板中的最终培养基体积为2mL。对照组与实验组保持一致。CBS siRNA、CBS过表达质粒和Lipofectamine2000的使用量按照说明书计算。根据每种细胞的生长状态可适量加量或减量。转染6h后，在六孔板中更换新鲜的完全培养基，转染48h后可通过GFP荧光强弱或蛋白表达多少来检测转染效率。转染成功后即可进行后续实验，其中，转染CBS siRNA的KYSE450细胞模型记作CBSsiRNA，对照组转染scrambled siRNA，记作Sc siRNA，转染CBS过表达质粒的Eca109细胞模型记作CBS Oe，对照组转染空载质粒，记作Vector。

②MTS法：取转染后24h的KYSE450细胞和Eca109细胞接种于96孔板中。24h后取出96孔板，在各孔中加入10μL的MTT(5mg/mL)，3～4h后，弃去孔中原培养上清，每孔中加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，放入摇床，设置转速为100rpm，10min后待板底的紫色结晶溶解，在570nm波长下，使用多功能酶标仪测定96孔板各孔溶液吸光度值(OD值)，记录实验结果。

③EdU试剂盒检测法：收集KYSE450细胞和Eca109细胞，用培养基调整细胞密度为4～5×10

④划痕实验：在6孔板背面比照直尺平行于6孔板长边，用油墨笔画5～6条直线穿过每个孔。取细胞接种于6孔板中。待细胞完全的铺满6孔板的底部时，取100μL无菌枪头比照无菌直尺，垂直于板的水平画线，竖直相同的力度划痕。此后，弃去原培养基，使用PBS清洗2～3次，除去划痕伤害的细胞，加入相应的无血清无双抗培养基2mL/孔，每组设置三个复孔。各个孔拍摄相同坐标在0h，24h拍摄取样，保持划痕区域在图片中央。使用AdobePhotoshop软件测距，得到0h、24h细胞划痕距离，求均值，计算出细胞迁移速率。

⑤Transwell小室实验：做细胞迁移实验时，收集细胞用无血清无双抗培养基将细胞密度调整为1～2×10

⑥细胞成管实验：在实验的前一天，将Matrigel胶放于4℃融化。同时将灭菌的100μl枪头和24孔板冷藏备用；开始实验时，将冷藏的枪头和24孔板从冰箱中取出，在24孔板每个孔中加入100μL Matrigel胶。加胶完毕后后，将整个24孔板放入细胞培养箱中，放置30分钟使胶凝固；在等待Matrigel胶凝固的过程中，取出对数生长期的人脐静脉内皮细胞HUVEC或人淋巴管内皮细胞HLEC，胰酶消化后用无血清的相应培养基制成细胞悬液，细胞计数后将浓度调整至2×10

(3)实验结果：构建不同CBS表达水平的细胞模型，结果表明CBS siRNA成功下调食管鳞癌细胞KYSE450中CBS蛋白水平(图5)，CBS表达下调后KYSE450细胞的生长能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均受到明显抑制(图7)，采用CBS过表达质粒转染Eca109细胞成功上调CBS的表达(见图6)，CBS表达上调后，Eca109细胞的生长能力、增殖能力、迁移和侵袭能力均明显增强(见图8)。细胞成管实验结果显示，CBS siRNA明显抑制了KYSE450细胞诱导的内皮细胞的成管能力。CBS过表达质粒明显促进了Eca109细胞诱导的内皮细胞的成管能力(见图9、图10)。表明CBS不同表达水平可明显影响食管鳞癌细胞的生物学活性。

实施例3、动物水平验证CBS不同表达水平对食管鳞癌淋巴结的影响

(1)实验材料

LV-CBS-RNAI慢病毒：购自上海吉凯基因科技有限公司；

KYSE450细胞：获赠于新乡医学院；

BALB/c Nude雄性裸鼠：购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006,No.110011200109490675。

(2)实验方法

①慢病毒构建稳转细胞：按照预实验确定的条件，取适量生长状态良好的KYSE450细胞接种于六孔板中。待第二天细胞贴壁后，按表2进行细胞感染。在6孔板中更换1mL含病毒的新鲜培养基。感染10～12h后换回常规培养基，72h后，加入预先筛好浓度的嘌呤霉素杀死没有感染的细胞。待细胞长起来后通过GFP荧光和Western Blot实验最终确定得到稳定表达蛋白的稳定细胞系。稳转细胞的日常培养也需要加入一定量的抗生素维持，以便后期实验的进行。

表2 1*10

②稳转细胞构建裸鼠体内移植瘤模型：取对数生长期细胞，用无血清无双抗培养基将细胞密度调整为1×10

③HE染色：裸鼠处死后获取接瘤侧腘窝和腋窝下淋巴结按照切片-脱蜡-染色-洗脱-封片的步骤进行HE染色，在显微镜下观察并拍照记录结果。

(3)实验结果：采用LV-CBS-RNAI慢病毒包装的CBS shRNA感染食管鳞癌KYSE450细胞构建CBS下调的稳转细胞构建成功。用构建好的稳转细胞成功建立裸鼠移植瘤模型。一批裸鼠接瘤于右侧爪垫，4周后结束实验。另一批裸鼠接瘤于右侧腋下，6周后结束实验。裸鼠解剖后剥离同侧腘窝和腋窝的淋巴结。结果表明，CBS下调后裸鼠同侧腘窝和腋窝下淋巴结明显变小(见图11、12)。两组HE染色结果相比，对照组裸鼠淋巴结髓质内可见大量的粒细胞浸润，而实验组裸鼠淋巴结髓质内的粒细胞浸润数量明显减少(见图11、图12)，结果说明下调CBS的表达可抑制淋巴结转移。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南大学

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<120> 食管鳞癌淋巴结转移标志物、其检测试剂、检测系统及应用

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<160> 2

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<210> 1

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

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<400> 1

ggaacuacau gaccaaguud tdt 23<>

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<210> 2

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

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<400> 2

aacuugguca ugaguuccdt dt 22<>

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