GAPDH和HPRT1在qRT-PCR检测进入高原前后血液基因表达的应用

摘要

本发明提供了GAPDH和HPRT1在qRT‑PCR检测进入高原前后血液基因表达的应用，涉及分子生物学技术领域。本发明提供了GAPDH基因和HPRT1基因作为人血液中内参基因的应用，首次对进入高原前和持续低氧环境暴露后血液中的内参基因表达稳定性进行检测，得到持续低氧暴露条件下稳定表达的组合内参基因GAPDH和HPRT1，并在实际工作得到运用。本发明GAPDH和HPRT1的组合内参基因在持续低氧刺激后仍可表达稳定，而且能够反应功能基因在不同时间低氧环境刺激下细胞基因表达的变化，可作为定量高原低氧暴露前后血液中目的基因检测的内参基因。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及GAPDH和HPRT1在qRT-PCR检测进入高原前后血液基因表达的应用。

背景技术

低氧是高原环境的特征之一。在低氧条件下，机体可通过低氧相关通路诱导多种基因的表达，包括EPAS1、EGLN1、EPO等。越来越多的研究表明缺氧诱导因子通路在低氧适应中起到重要作用，其中编码缺氧诱导因子HIF-2α的EPAS1可通过进一步调控多种基因的表达而使机体适应高原低氧环境。高原低氧暴露14天内，基因表达变化多样，这些表达变化与后期高原低氧适应显著相关，决定着进入高原的个体是否能够快速适应低氧环境。

为了检测高原低氧适应过程中的分子机制，对其所涉及的基因表达定量检测在所难免。实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)就是一种在转录水平对mRNA进行定量的方法，具有快速、重复性好和高灵敏等优点。因此，qRT-PCR在基因表达的定量研究中获得广泛应用。然而，为了获得qRT-PCR分析检测的最佳结果，依据实时荧光定量PCR国际化标准(MIQE)要求，提出了完成qRT-PCR实验的最少条件需求，其中包括合适的内参基因。为了降低实验中的差异，通常在研究中会选择管家基因作为内参基因对目的基因进行校正和标准化，以校正转录效率和cDNA用量，弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别，从而避免mRNA转录效率、样品操作及下游处理步骤造成的误差。然而，研究表明，机体在不同的环境条件下，多种可作为内参基因的管家基因表达同样会随所处环境或实验干预条件不同而变化。在分析中选用一种合适的稳定表达的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供GAPDH和HPRT1在qRT-PCR检测进入高原前后血液基因表达的应用，首次对进入高原前和持续低氧环境暴露后血液中的内参基因表达稳定性进行检测，得到持续低氧暴露条件下稳定表达的组合内参基因GAPDH和HPRT1，并在实际工作得到运用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了Glyceraldehyde(简称GAPDH)基因和/或HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1(简称HPRT1)基因作为人血液中内参基因的应用，所述Glyceraldehyde基因的GenID为NM_002046.5，所述HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的GenID为NM_000194.3。

本发明提供了Glyceraldehyde基因/或和HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因在人血液中基因定性检测中的应用，所述Glyceraldehyde基因的GenID为NM_002046.5，所述HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的GenID为NM_000194.3。

本发明提供了Glyceraldehyde基因和/或HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因在人血液中基因定量检测中的应用，所述Glyceraldehyde基因的GenID为NM_002046.5，所述HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的GenID为NM_000194.3。

本发明还提供了上述应用中Glyceraldehyde基因和HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的实时荧光定量PCR引物，所述PCR引物包括GAPDH-F、GAPDH-R、HPRT1-F和HPRT1-R；

所述GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GAPDH-R的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述HPRT1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HPRT1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种检测在低氧环境持续暴露人群的血液中基因表达变化的试剂盒，所述试剂盒上述PCR引物。

本发明还提供了一种检测进入高原前后血液中基因表达变化的方法，包括以下步骤：以人血液中提取RNA经反转录后合成的cDNA为模板，以Glyceraldehyde基因和/或Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1基因为内参基因，与目标基因的特异性引物和2×SYBR Green Premix混合构建实时荧光定量PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR检测。

优选的，所述实时荧光定量PCR反应体系以20μL计，包括2×SYBR Green Premix10μL，目标基因的特异性引物和上述PCR引物共2μL，cDNA模板2μL和余量的ddH

优选的，所述实时荧光定量PCR检测的程序包括：95℃预变性2min；95℃变性5sec，57℃退火20sec，72℃延伸20sec，40个循环。

本发明还提供了一种检测在低氧环境持续暴露人群的血液中基因表达变化的方法，包括以下步骤：以人血液中提取RNA经反转录后合成的cDNA为模板，以Glyceraldehyde基因和/或Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1基因为内参基因，与目标基因的特异性引物和2×SYBR Green Premix混合构建实时荧光定量PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR检测。

本发明提供了Glyceraldehyde(简称GAPDH)基因和/或HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1(简称HPRT1)基因作为人血液中内参基因的应用，首次对进入高原前和持续低氧环境暴露后血液中的内参基因表达稳定性进行检测，得到持续低氧暴露条件下稳定表达的组合内参基因GAPDH和/或HPRT1，并在实际工作得到运用。

本发明实施例中，在持续低氧刺激下，利用该组合内参基因对两个目的基因的表达量进行校准后，在低氧刺激后，EPAS1表达升高。与常氧相比，随着时间的推移EPAS1分别上调了3倍、2.2倍和1.6倍。因此GAPDH和HPRT1的组合内参基因在持续低氧刺激后仍可表达稳定，而且能够反应功能基因在不同时间低氧环境刺激下细胞基因表达的变化，可作为定量高原低氧暴露前后血液中目的基因检测的内参基因。

附图说明

图1为8个候选内参基因的实时荧光定量PCR扩增熔解曲线，其中图1A：GAPDH；图1B：β-actin；图1C：PPIA；图1D：TBP；图1E：18SRNA；图1F：β2-MG；图1G：RPL13A；图1H：HPRT1；

图2为内参基因引物扩增标准曲线，其中图2A：GAPDH；图2B：β-actin；图2C：18SRNA；图2D：β2-MG；图2E：PPIA；图2F：RPL13A；图2G：TBP；图2H：HPRT1；

图3为geNorm软件推荐内参基因组合的稳定度；

图4为以GAPDH和HPRT1的组合为内参基因时，EPAS1表达含量变化。

具体实施方式

本发明提供了Glyceraldehyde基因和/或HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因作为人血液中内参基因的应用，所述Glyceraldehyde基因的GenID为NM_002046.5，所述Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1基因的GenID为NM_000194.3。

在本发明中，所述Glyceraldehyde基因简称为GAPDH基因，HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因简称为HPRT1基因。本发明利用所述基因检测人血液中基因表达时，以所述GAPDH基因和HPRT1基因共同作为内参基因。本发明首次将GAPDH和HPRT1混合作为内参基因，在进入高原前和持续低氧环境暴露后人血液中基因的表达量，可作为定性检测用，还可作为定量检测用。

本发明提供了Glyceraldehyde基因和/或HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因在人血液中基因定性检测中的应用，所述Glyceraldehyde基因的GenID为NM_002046.5，所述HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的GenID为NM_000194.3。本发明所述应用优选与上述应用相同，在此不再赘述。

本发明提供了Glyceraldehyde基因和/或HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因在人血液中基因定量检测中的应用，所述Glyceraldehyde基因的GenID为NM_002046.5，所述HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的GenID为NM_000194.3。本发明所述应用优选与上述应用相同，在此不再赘述。

本发明还提供了上述应用中Glyceraldehyde基因和HypoxanthinePhosphoribosyltransferase 1基因的实时荧光定量PCR引物，所述PCR引物包括GAPDH-F、GAPDH-R、HPRT1-F和HPRT1-R；所述GAPDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述GAPDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HPRT1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HPRT1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明将设计得到的qRT-PCR引物列于表1中。在本发明中，同时还对本领域中常见的6个候选内参基因β-actin(ACTB，NM_001101.3)、18SRNA(M_10098.1)、β2-MG(β2-microglobulin，NM_004048.2)、PPIA(PeptidylprolylisomeraseA，NM_021130.3)、RPL13A(Ribosomalprotein L13，NM_012423.3)和TBP(TATA-Box bindingprotein，NM_003194.4)进行比较，验证本发明GAPDH和HPRT1在qRT-PCR扩增的稳定性，结果显示在各时间段GAPDH和HPRT1组合作为内参基因更加稳定。

表1实时荧光定量PCR引物

本发明设计的qRT-PCR引物具有较强的特异性，并具有100％±10％的扩增效率，能够为准确定量提供坚实基础。本发明利用qRT-PCR技术首次验证并筛选除了进入高原前和持续高原低氧暴露后人血液中稳定表达的内参基因组合。本发明筛选出的内参基因组合GAPDH和HPRT1为进入高原前和持续低氧环境暴露后人血液中基因表达水平的数据可靠性提供保障。

本发明还提供了一种检测进入高原前后血液中基因表达变化的试剂盒，所述试剂盒包括上述PCR引物。

本发明所述试剂盒中优选还包括进行qRT-PCR的其他试剂，如2×SYBR GreenPremix和ddH

本发明还提供了一种检测在低氧环境持续暴露人群的血液中基因表达变化的试剂盒，所述试剂盒上述PCR引物。本发明所述试剂盒优选与上述试剂盒相同，在此不再赘述。

本发明还提供了一种检测进入高原前后血液中基因表达变化的方法，包括以下步骤：以人血液中提取RNA经反转录后合成的cDNA为模板，以Glyceraldehyde基因和Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1基因为内参基因，与目标基因的特异性引物和2×SYBR Green Premix混合构建实时荧光定量PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR检测。

本发明所述实时荧光定量PCR反应体系以20μL计，优选包括2×SYBR GreenPremix 10μL，目标基因的特异性引物和上述PCR引物共2μL，cDNA模板2μL和余量的ddH

本发明还提供了一种检测在低氧环境持续暴露人群的血液中基因表达变化的方法，包括以下步骤：以人血液中提取RNA经反转录后合成的cDNA为模板，以Glyceraldehyde基因和Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1基因为内参基因，与目标基因的特异性引物和2×SYBR Green Premix混合构建实时荧光定量PCR反应体系，进行实时荧光定量PCR检测。

本发明对RNA的提取方法和反转录方法并没有特殊限定，优选根据试剂盒的说明上进行即可。本发明所述实时荧光定量PCR反应体系和实时荧光定量PCR检测优选与上述相同，在此不再赘述。

下面结合实施例对本发明提供的GAPDH和HPRT1在qRT-PCR检测进入高原前后血液基因表达的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、样品的准备

8名健康汉族男性志愿者分别在平原和进入高原(海拔3700米)3天、7天、14天后收集EDTA-Na

2、样品RNA提取

取出制备好的裂解样品，室温放置5min，使其充分裂解。将裂解液收集到1.5ml无RNase离心管中，离心12000g，5min，取上清，弃沉淀(此时可以放入-80℃长期保存)。按200μL氯仿/(ml TRIzol)，加入氯仿，轻柔振荡15s，混匀后室温放置3min。4℃，12000g，离心15min。取上层无色水相于另一干净无RNase离心管中。按0.5ml异丙醇/(ml TRIzol)加入异丙醇轻柔充分混匀，室温放置10min，4℃，12000g，离心10min。按1ml75％无水乙醇/(mlTRIzol)加入配置好的无水乙醇，洗涤沉淀，4℃，7500g，离心5min。室温晾干10min后，用无RNase水50μL溶解RNA，55℃，10min水浴。测定浓度后分装，-80℃保存。

3、反转录

采用ReverTra

4、合成表1所示的引物

5、内参基因实时荧光定量PCR扩增熔解曲线及其引物扩增效率的测定

测定扩增效率cDNA样品的制备：取平原人-20℃冰箱中的血液cDNA样本10μL，置于无RNA酶的离心管中。

取上述制备的cDNA混合样品10μL进行10倍的倍比稀释，得到浓度为10

实时荧光定量PCR的体系为：SYBR Green Premix(2×)10μL，上游引物(10μM)1.0μL，下游引物(10μM)1.0μL，cDNA模板2μL，ddH

荧光定量PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5sec，57℃退火20sec，72℃延伸20sec，40个循环。

实时荧光定量PCR扩增循环结束后分析、绘制熔解曲线，并进行熔解曲线分析以确定扩增产物的特异性。温度从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。所述实时荧光定量PCR扩增采用的人血液中内参基因为GAPDH、β-actin、18SRNA、β2-MG、PPIA、RPL13A、TBP和HPRT1。

本发明8个候选内参基因的实时荧光定量PCR扩增熔解曲线如图1所示，熔解曲线均为单峰，因此上述8个候选内参基因的扩增引物均具有特异性。

绘制标准曲线：通过Bio-Rad CFX96系统软件的分析，分别计算以浓度为10

本发明8个候选内参基因的扩增效率如表2所示，引物的扩增效率是通过斜率计算出的，而扩增效率E表示所有扩增试剂(包括模板cDNA)转变成扩增子的效率，理论上一个循环的扩增子的最大增量为2倍，即扩增效率为100％，一般认为扩增效率为90％～110％。R

表2RT-qPCR扩增效率检测

注意：E：扩增效率R

6、候选内参基因的实时荧光定量PCR反应

以反转录后所得的血液cDNA样品为模板对上述8个候选内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，各设置二组平行试验。

所述实时荧光定量PCR的反应体系：SYBR Green Premix(2×)10μL，上游引物(10μM)1.0μL，下游引物(10μM)1.0μL，cDNA模板2μL，ddH

经荧光定量PCR的数据分析结果以及geNorm软件和NormFinder软件同时分析处理；geNorm软件结果显示，进入高原前和持续低氧环境暴露后人血液中的GAPDH、β-actin、18SRNA、β2-MG、PPIA、RPL13A、TBP和HPRT1表达稳定度的值依次为0.052、0.082、0.072、0.089、0.068、0.108、0.057和0.053；表达稳定度由高到低排序依次为GAPDH＞HPRT1＞TBP>PPIA>18SRNA>β-actin>β2-MG>RPL13A。

NormFinder软件结果显示，GAPDH、β-actin、18SRNA、β2-MG、PPIA、RPL13A、TBP和HPRT1表达稳定度的值依次为0.008、0.041、0.037、0.049、0.035、0.052、0.020和0.014；表达稳定度由高到低排序依次为GAPDH＞HPRT1＞TBP>PPIA>18SRNA>β-actin>β2-MG>RPL13A，两种软件计算结果一致。同时，结合geNorm软件推荐内参基因组合，选择GAPDH和HPRT1组合具有更低的稳定度M值(图3)，表明其在各时间段该组合作为内参基因更加稳定，且NormFinder软件也显示相同的结果，故最终采用GAPDH和HPRT1组合。

7、组合内参基因GAPDH和HPRT1的应用

GAPDH和HPRT1作为检测进入高原前和持续低氧环境暴露后血液中低氧诱导相关基因EPAS1表达的内参基因。

其引物序列为：

EPAS1(NM_001430.5)：

上游引物(SEQ ID NO.17)：ACGCCACCCAGTACCAGGA；

下游引物(SEQ ID NO.18)：AATGAGGGCCCGAGCAGC。

实时荧光定量PCR的体系为：SYBR Green Premix(2×)10μL，上游引物(10μM)1.0μL，下游引物(10μM)1.0μL，cDNA模板2μL，ddH

荧光定量PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5sec，57℃退火20sec，72℃延伸20sec，40个循环。

实时荧光定量PCR扩增循环结束后分析、绘制熔解曲线，并进行熔解曲线分析以确定扩增产物的特异性。温度以1℃/分钟从60℃缓慢递增到95℃，连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。利用公式2

结果如图4所示，在持续低氧刺激下，利用该组合内参基因对两个目的基因的表达量进行校准后，在低氧刺激后，EPAS1表达升高。与常氧相比，随着时间的推移EPAS1分别上调了3倍、2.2倍和1.6倍。因此可以看出，GAPDH和HPRT1的组合内参基因在持续低氧刺激后仍可表达稳定，而且能够反应功能基因在不同时间低氧环境刺激下细胞基因表达的变化，可作为定量高原低氧暴露前后血液中目的基因检测的内参基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军空军特色医学中心

<120> GAPDH和HPRT1在qRT-PCR检测进入高原前后血液基因表达的应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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tccaaaatca agtggggcga 20

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