用来自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶制备GOS制剂的方法、由此获得的GOS制剂及其用途

摘要

本发明涉及营养成分领域，特别地涉及生产低变应原性的低聚半乳糖(HA‑GOS)的经济上有吸引力的方法及其在食品和饲料物品中的用途。提供了用于生产HA‑GOS制剂的方法，该方法包括将乳糖饲料与β‑半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)接触，该β‑半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列或与其至少80％相同的氨基酸序列，其中该乳糖饲料为干酪乳清渗透物(CWP)或富含唾液乳糖的CWP(SL‑CWP)。

说明书

本发明涉及营养成分领域。更特别地，它涉及生产低变应原性的低聚半乳糖的经济上有吸引力的方法及其在食品和饲料物品中的用途。本发明特别地涉及在生产低变应原性的GOS制剂中干酪乳清渗透物作为乳糖饲料在由衍生自土生隐球菌(Cryptococcusterrestris)的β-半乳糖苷酶催化的转半乳糖基化反应中的用途。

术语“GOS”代表低聚半乳糖(GOS)，其通常包含通过β-半乳糖苷酶催化的连续转半乳糖基化反应(反糖基化反应)产生的半乳糖单元和末端葡萄糖单元链。某些GOS组分在人母乳和牛初乳中天然存在。典型的GOS制剂主要包含二糖至六糖。

已经报道了GOS的各种生理功能，包括刺激肠道中双歧杆菌生长、支持正常肠道转运、促进自然防御和增强矿物质吸收的能力。GOS因其促进双歧杆菌、乳杆菌和其他肠道细菌生长的益生元效应而受到了特别关注。因此，GOS通常用于婴儿配方食品、乳杆菌发酵饮料和酸奶中。某些含GOS的食品经日本消费者事务管理局认证为“特定健康用途食品”，而GOS被美国食品和药物管理局认证为公认安全(GRAS)物质(GRAS公告：GRN 233、236、285、286、334、484、489、495、518和569)。

通常，通过与β-半乳糖苷酶(酶类EC.3.2.1.23)产生的转糖苷反应产生GOS。在许多微生物中产生β-半乳糖苷酶，诸如环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、掷孢酵母(Sporobolomyces singularis)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。β-半乳糖苷酶的三维结构不同，导致形成的糖苷键具有立体选择性和区域选择性。例如，通常衍生自曲霉的真菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-6键(因此得到主要包含β1-6键的GOS制剂，可称为“6’-GOS”)，而衍生自芽孢杆菌的细菌β-半乳糖苷酶主要产生β1-4键(得到主要包含β1-4键的GOS制剂，也可称为“4’-GOS”)。此外，由环状芽孢杆菌产生的β-半乳糖苷酶具有特别强的转半乳糖基化活性，并且因此，通过环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶制备的GOS在世界范围内销往。

自从投放市场(1999年)以来，约超过1亿婴儿食用了包含通过来自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶制备的GOS的婴儿配方食品。它已被证明是安全成分，具有FDA承认的GRAS状态。然而，在过去的几年中，东南亚报告了少量的非常罕见的GOS相关过敏病例。研究表明，在GOS中存在的某些寡糖结构可以在非常敏感的受试者中产生过敏反应。

Jyo等人(Occup.Environ.Allergy[职业性环境过敏]3,12-20(1992))食用了含有真菌β-半乳糖苷酶产生的6’-GOS的乳酸菌饮料后确定过敏症状。用细菌β-半乳糖苷酶产生的4’-GOS也观察到过敏症状。在2014,Kaneko等人(Biosc.Biotechnol.Biochem.[生物科学、生物技术和生物化学],78,100-108)观察到通过用衍生自环状芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶处理乳糖产生的GOS可引起过敏反应，并且揭露过敏由两种四糖[Galβ1-4(Galβ1-4Galβ1-6)Glc、Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-3Glc]引起。这些GOS过敏病例发生在已经有特应性历史的受试者中。

天野公司(Amano)在WO 2017/115826中披露了从耐热性、pH稳定性等观点来看，用于对工业应用具有所需性质的新型β-半乳糖苷酶的各种微生物的筛选。这导致鉴定隐球菌(Cryptococcu)属特别是土生隐球菌(Cryptococcus terrestris，最近更名为Papiliotrema terrestris)的微生物(野生型菌株)的酶。

纯化乳糖的高成本使得GOS生产的常规工艺对大规模工业应用的吸引力降低，特别地使GOS成为广泛的食品和饲料应用中的一种经济有效成分，例如，成长乳(GUM)市场。

因此，本发明人旨在开发一种制造GOS制剂的方法，其具有更高经济可行性，同时至少保留了GOS产物的所需特性，诸如双歧性质。

令人惊讶地观察到，当干酪乳清渗透物(CWP)(干酪制作过程的副产物)被用作使用土生隐球菌β-半乳糖苷酶或其变体制备GOS的方法中的乳糖源，获得了具有意想不到的低变应原性的GOS制剂。此类低变应原性的GOS制剂在此称为“HA-GOS”。此外，发现乳糖贫化的乳清渗透物(缩写为DLP或OPL)具有高唾液乳糖(SL)含量，因此非常适合制备低成本富含SL的HA-GOS制剂。此类富含SL的CWP在此也称为SL-CWP。SL是人乳低聚糖的一种组分，已知因为在支持抵抗病原体、肠道成熟、免疫功能和认知发育方面发挥作用而具有显著健康益处。

由于CWP和OPL代表了最丰富的乳品废物流，因此这里的发明不仅提供了与常规GOS制剂相比产生具有更高SL水平的HA-GOS的经济上有吸引力的程序，但它还允许将工业废物流再利用为HA-GOS。

因此，本发明涉及一种用于生产低聚半乳糖(HA-GOS)制剂的方法，其包括将乳糖饲料与β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)接触，该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列或与其至少80％相同的氨基酸序列(意指：与SEQ ID NO:1至少80％相同、与SEQ ID NO:2至少80％相同、与SEQ ID NO:3至少80％相同、和/或与SEQ ID NO:4至少80％相同)，其中该乳糖饲料包含干酪乳清渗透物(CWP)或富含唾液乳糖的CWP(SL-CWP)。

本发明还涉及一种GOS制剂，其可通过根据本发明所述的方法获得。

本发明还进一步涉及GOS制剂在至少部分地预防受试者中的(IgE介导)过敏反应的方法中的用途。

本发明还提供了一种用于至少部分地预防受试者中的GOS制剂的超敏反应的方法，该方法包括施用(低变应原性的)营养组合物，该营养组合物包含根据本发明所述的GOS制剂。

本发明进一步涉及一种用于提供低变应原性的营养组合物的方法，该方法包括(i)根据本发明的方法提供该GOS制剂，以及(ii)将所述GOS制剂与至少一种另外的低变应原性的或非变应原性的成分一起配制在低变应原性的营养组合物中。还提供了一种低变应原性的营养组合物，其可通过此类方法获得。

本发明还涉及一种营养组合物，其包含根据本发明所述的HA-GOS制剂。

乳糖饲料

本发明的方法的其他特征在于衍生自牛乳的原料作为乳糖饲料的用途。该原料包括干酪乳清渗透物(CWP)或经进一步加工以去除不需要的组分和/或富集所需组分的CWP。CWP是从形成乳的干酪乳清提取蛋白质后保留的富含乳糖的流出物，是一种丰富的乳品废物。在所有生产乳的国家，乳主要用于制造干酪。然而，只有大约一半的乳中存在的固体凝固并作为干酪回收；剩下的一半作为乳清回收，乳清是干酪制造过程的副产物。乳清主要含有蛋白质、乳糖、矿物质和维生素。乳清的处理和处置经常造成显著的环境问题。乳清有时被干燥后用作牛饲料或其他加工食品(诸如糖果条)中的填充剂。然而，由于乳清的高灰分含量，其在食品应用中的用途是受限的。使用更高级的超滤技术，可以从乳清中回收商业上有价值的蛋白质。乳清蛋白质已长期被用作食品成分和用于药物应用中。在超滤中，对溶液施加压力，迫使乳清通过半透膜。该膜的开口大小可以通过该乳清的所有部分，但蛋白质会变得浓缩。通过该膜的材料称为(干酪)乳清渗透物，也称为液体渗透物。乳清渗透物主要含有乳糖、矿物质和维生素。

在本发明的一个实施例中，使用该乳清渗透物，即，无需进一步处理，作为转半乳糖基化反应中的诸如乳糖饲料。然而，优选在与该β-半乳糖苷酶接触之前，将该渗透物去矿化。在一个实施例中，该乳糖饲料是经去矿化至灰分含量高达约4wt.％或导电率高达约4mS的CWP。可替代地，该去矿化步骤可以在转化为GOS之后进行。可通过本领域已知的方法(包括电渗析(ED)、反渗透(RO)、纳滤(NF)或离子交换技术)进行去矿化。在一个优选的方面，该乳糖饲料是已经受电渗析(CWP-ED)的CWP。在另外优选的实施例中，该乳糖饲料是已经受电渗析至灰分含量高达4wt.％和/或导电率高达4mS的CWP。

用CWP作为乳糖饲料制备HA-GOS的示例性方法包括以下步骤：

1.将CWP浓缩至干物质含量>25％，优选至干物质含量为约28wt.％或更高；

2.去矿化，例如通过ED，优选至灰分含量小于或等于4wt.％和/或导电率高达4mS；

3.将该去矿化的CWP浓缩，优选至干物质含量为50wt.％或更高，55wt.％或更高；

4.加入酶(衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶)以将乳糖转化为HA-GOS；

5.使该酶失活(例如，通过本领域技术人员已知的热处理)；

6.将该HA-GOS溶液浓缩，优选至干物质含量为70％或更高，以获得HA-GOS糖浆。

可替代地，该去矿化步骤也可以在将乳糖转化为HA-GOS之后而不是之前进行。

在步骤5中获得的HA-GOS溶液也可以经历额外的纯化步骤，例如，以去除单糖和/或剩余的乳糖。可以进一步干燥该HA-GOS溶液，优选在至少去除单糖后，以便以粉末形式获得HA-GOS。

在另一个优选的方面，该乳糖饲料是已经受处理以富含唾液乳糖(SL)的CWP，本文也称为SL-CWP。例如，SL-CWP可通过乳品工业中常用的工艺获得，以通过蒸发和结晶从乳清渗透物中获得乳糖。可替代地，该乳糖去除步骤可包括喷雾干燥该浓缩材料，然后加入水以溶解该低聚糖，而将该乳糖以结晶的形式留下。

从乳清渗透物中回收乳糖导致副产物去乳糖的乳清渗透物(DLP或OPL)，其在这以前被认为含有不可回收的乳糖和蛋白质，以及最初存在于该乳清渗透物中的矿物质和维生素。然而，随着乳糖去除，含唾液酸化合物的水平增加，包括唾液乳糖的含量。该副产物难以处理，且典型地是土地扩散(这会导致径流，在一些国家导致严重的湖泊和河流污染问题)、填埋或出售为牛饲料，工厂损失惨重。

然而，有趣的是，OPL不仅含有超过50％的乳糖，而且也含有0.3％-0.4％的唾液乳糖(2,3-唾液乳糖和2,6-唾液乳糖)以及可能地其他有价值的牛乳低聚糖(bMO)。此外，已经表明bMO所含的低聚糖与人低聚糖(hMO)中发现的低聚糖一样多。因此，bMO与GOS的组合可以提供独特的GOS产物，其可能具有GOS的全部特征，但具有hMO或bMO的部分特征(详情见表1)。

表1：比较牛乳低聚糖(bMO)、人乳低聚糖(hMO)和常规GOS制剂(Vivinal GOS)中存在的不同低聚糖。表改编自Aldredge等人(2013Glycobiology[糖生物学].23:664-676)。

如图2所示，OPL中的乳糖可转化为正常GOS，而唾液乳糖(诸如2,3-唾液乳糖和2,6-唾液乳糖)将保持完整。

目前去乳糖乳清渗透物有利于转化为有价值的食品或饲料成分的发现为乳品工业大量副产物的再利用开辟了一条新的途径。

在一个实施例中，该乳糖饲料为具有基于干固体的至少0.25wt.％、优选至少0.3wt.％的唾液乳糖含量的SL-CWP。

该SL-CWP的乳糖含量可以变化，但通常在约52wt.％-60wt.％的范围内。

众所周知，OPL还含有约24％的单价盐和8％的二价盐、8％的NPN和少量的蛋白质。例如，典型的OPL流包含约24％的灰分、7％的NPN、7.8％的蛋白质、57％的乳糖和0.3％-0.4％的SL(见表2)。尤其该高盐浓度可能会干扰酶促反应。因此，本发明的方法有利地包括由已经受去矿化步骤(特别是用于去除阴离子的处理)的(工业生产的)OPL溶液产生的SL-CWP的使用。

表2：OPL的典型组成。

值得注意的是，OPL含有相对少量的钙。因此，为了去除多价阴离子，诸如PO

该乳糖饲料可以完全由(去矿化的)CWP或SL-CWP组成。然而，还可以用乳糖替换部分(去矿化的)CWP或SL-CWP，乳糖不必非常纯净，诸如食用乳糖或乳糖浆。如果通过乳糖替换部分该(去矿化的)CWP或SL-CWP，则该乳糖饲料优选由至少20wt％、更优选至少30wt％(去矿化的)CWP或SL-CWP组成。

这里的发明还提供了一种用于生产HA-GOS的方法，该方法包括将乳糖饲料与β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)接触，该β-半乳糖苷酶包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列或与其至少80％相同的氨基酸序列(意指：与SEQ ID NO:1至少80％相同、与SEQID NO:2至少80％相同、与SEQ ID NO:3至少80％相同、和/或与SEQ ID NO:4至少80％相同)，其中该乳糖饲料包含已经受乳糖去除步骤、优选地随后经受去除多价阴离子的步骤的CWP。

例如，图3描绘了包括以下主要步骤的示例性方法的过程图：

1.向OPL浓缩溶液(约37％干物质)添加石灰(CaOH)以形成不溶性钙盐，诸如磷酸钙和柠檬酸钙；

2.离心以去除该不溶性盐；

3.加入酶(衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶)以将乳糖转化为HA-GOS；

4.使该酶失活(例如，通过本领域技术人员已知的热处理)；

5.电渗析(ED)以去除单价盐；

6.纳滤(NF)旨在去除单糖，导致具有超过70％纯度的HA-GOS组合物；

7.任选地浓缩该HA-GOS糖浆，例如，通过NF，优选地至干物质含量为70％或更高，更优选地至干物质含量为75％或更高。

可以干燥在步骤6中获得的HA-GOS溶液，以便获得粉末形式HA-GOS。

浓缩OPL流的典型干物质含量为约37％，因此含有低总乳糖浓度。因此，该浓缩OPL流的直接酶促转化可能导致乳糖至GOS的低效率转化。

通过首先将OPL转化为OPL-GOS，随后通过ED和NF连续去除该盐和/或单糖，可以克服与OPL再利用相关的这一缺点。当需要高纯度HA-GOS制剂时，优选进行这些分离步骤。然而，在ED和NF步骤之前仍可去除多价阴离子。

通过β-半乳糖苷酶进行的转半乳糖基化反应

通常，β-半乳糖苷酶显示乳糖水解活性(通过β-1,4键上的作用水解乳糖的活性)和转半乳糖基化活性(转移半乳糖的活性)。因此，本文所用的表述“β-半乳糖苷酶活性”旨在包括这两种活性。

根据本发明使用的酶先前已在WO 2017/115826中描述。它是衍生自酵母土生隐球菌的β-半乳糖苷酶。在此，“衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶”意指通过分类为土生隐球菌的微生物(野生型菌株或突变型菌株)产生的β-半乳糖苷酶或使用来自分类为土生隐球菌的微生物(野生型菌株或突变型菌株)的β-半乳糖苷酶通过基因工程程序获得的β-半乳糖苷酶。因此，术语“衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶”还包括由宿主微生物产生的重组酶，其中已经引入了从土生隐球菌获得的β-半乳糖苷酶基因(或其修饰基因)。土生隐球菌(Cryptococcus Terrestris)最近更名为Papiliotrema terrestris。

WO 2017/115826描述了通过衍生自隐球菌微生物的突变型菌株产生的三种β-半乳糖苷酶(分别为突变型菌株酶1、2和3)，并披露了它们的氨基酸序列。发现这三种β-半乳糖苷酶具有野生型菌株酶(该野生型菌株酶为SEQ ID NO:1)的从其基因序列推导出的全长氨基酸序列的部分序列。具体地，这些突变型酶是具有其中该野生型菌株酶的全长氨基酸序列的N-末端130个氨基酸残基缺失的氨基酸序列的酶，为了描述的目的被称为“突变型菌株酶1”(SEQ ID NO:2)；具有其中野生型菌株酶的全长氨基酸序列的N-末端136个氨基酸残基缺失的氨基酸序列的酶(SEQ ID NO:3)，为了描述的目的被称为“突变型菌株酶2”；以及具有其中野生型菌株酶的全长氨基酸序列的N-末端141个氨基酸残基缺失的氨基酸序列的酶(SEQ ID NO:4)，被称为“突变型菌株酶3”。

因此，用于本发明的方法中的β-半乳糖苷酶包含SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列或显示与其至少80％序列同一性的等效氨基酸序列。这些酶在本文中也称为“Tetris酶”。此外，可以使用两种或更多种β-半乳糖苷酶的组合，其中每种酶包含SEQ IDNO:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列或等效于所述氨基酸序列中任一项的氨基酸序列。在一个实施例中，使用至少一种突变型酶(SEQ ID NO 2、3或4或其等效物)。优选地使用两种或更多种突变型酶，任选地与野生型酶组合。例如，使用两种或更多种酶的组合，每种酶包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列或等效于所述氨基酸序列的氨基酸序列。在一个具体的方面，该酶组合包含三种不同突变型酶和野生型酶的混合物。

在这种情况下，术语“等效氨基酸序列”意指部分与参考氨基酸序列(即SEQ IDNO:1至4中任一项的氨基酸序列)不同的氨基酸序列，但该差异基本上不影响该蛋白质(β-半乳糖苷酶活性)的功能。因此，具有该等效氨基酸序列的多肽链的酶显示β-半乳糖苷酶活性。

只要可以展示β-半乳糖苷酶的功能，该活性的程度就不受特别限制，但优选等于或高于具有该参考序列的多肽链的酶的活性的程度。优选地，该等效氨基酸序列的长度不超过SEQ ID NO:1的序列的长度。

术语“氨基酸序列中的部分差异”通常意指由构成该氨基酸序列的一个至多个(例如，最多3、5、7或10个)氨基酸的缺失或取代，或一个至多个(例如，最多3、5、7或10个)氨基酸的添加、插入或其组合引起的氨基酸序列中的突变(改变)。只要维持该β-半乳糖苷酶活性(该活性可以在一定程度上变化)，该氨基酸序列的差异是可接受的。只要满足条件，该氨基酸序列的差异的位置就不受特别限制，并且该差异可能出现在多个位置中。术语“多个”例如意指对应于总氨基酸的小于约20％、优选小于约15％、更优选小于约10％、甚至更优选小于约5％、且最优选小于约1％的数量。更具体地，该等效蛋白质与该参考氨基酸序列具有约80％或更多、优选约85％或更多、更优选约90％或更多、更优选约95％或更多、甚至更优选约97％或更多、且最优选约99％或更多同一性。

该氨基酸序列的差异可能出现在多个位置中。优选地，通过在对于β-半乳糖苷酶活性不是必需的氨基酸残基中引起保守的氨基酸取代来获得该等效蛋白质。术语“保守的氨基酸取代”意指氨基酸残基被具有侧链的具有相似特性的另一个氨基酸残基取代。

氨基酸残基根据其侧链分为几个家族，如碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。保守的氨基酸取代优选地是在一个家族中氨基酸残基之间的取代。

两个氨基酸序列或两个核酸序列(下文中，术语“两个序列”用于表示两个序列中的任一个)之间的同一性(％)可以通过以下程序来确定。首先，对准两个序列以对两个序列进行最佳比较(例如，可以在第一序列中引入空位以优化相对于第二序列的对准)。当该第一序列中具体位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)和该第二序列中相应位置的分子彼此相同时，这些位置的分子被定义为相同。两个序列之间的同一性是该两个序列共享的相同位置的数量的函数(即，同一性(％)＝相同位置的数量/位置的总数量％100)。优选地，考虑优化该两个序列的对准所需的空位的数量和大小。

两个序列之间的同一性的比较和确定可以通过使用数学算法来进行。可用于比较该序列的数学算法的具体实例包括Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]87:2264-68中描述并由Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90:5873-77修改的算法。然而，该算法不必限于此。此算法被合并到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10中描述的NBLAST程序和XBLAST程序(版本2.0)中。为了获得等效核酸序列，例如，可以通过NBLAST程序进行评分＝100且字长＝12的BLAST核苷酸搜索。为了获得等效氨基酸序列，例如，可以通过XBLAST程序进行评分＝50且字长＝3的BLAST多肽搜索。为了获得用于比较的空位对准，可以利用Altschul等人,(1997)Amino Acids Research[氨基酸研究]25(17):3389-3402中描述的空位BLAST。在使用BLAST和空位BLAST时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。详见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可用于比较序列的该数学算法的另一个实例包括Meyers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]4:11-17中描述的算法。这些程序被合并到ALIGN程序中，该ALIGN程序可用于例如GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器。例如，当使用该ALIGN程序比较该氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，其中空位长度罚分为12，且空位罚分为4。

通过使用GCG软件包中的GAP程序，使用空位权重为12、10、8、6或4以及空位长度权重为2、3或4的Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，可以确定两个氨基酸序列之间的同一性。通过使用空位权重为50以及空位长度权重为3的GCG软件包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com上得到)，可以确定两个核酸序列之间的同一性。该酶可以是较大蛋白质(例如，融合蛋白)的一部分。添加到融合蛋白中的序列的实例包括用于纯化多个组氨酸残基的序列/标签，以及确保重组生产中稳定性的添加序列。

如WO 2017/115826的实例部分所示，从土生隐球菌菌株MM13-F2171及其突变型菌株M2和M6中分离并纯化β-半乳糖苷酶。采用UV处理诱变的方式，从土生隐球菌菌株MM13-F2171中获得突变型菌株(M2和M6)。如下所述，土生隐球菌菌株MM13-F2171和M2已经保藏在一个保藏机构处，并且随时可用。

<土生隐球菌菌株MM13-F2171>

保藏机构：Patent Microorganisms Depositary,National Institute ofTechnology and Evaluation[国立技术与评估研究院专利微生物保藏所](日本千叶市292-0818加津佐镰足2-5-8，122室(Room 122,2-5-8Kazusa Kamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,JAPAN))。鉴别参考号：土生隐球菌MM13-F2171。保藏日期：2015年12月10日。登录号：NITE BP-02177；

<土生隐球菌菌株M2>

保藏机构：Patent Microorganisms Depositary,National Institute ofTechnology and Evaluation[国立技术与评估研究院专利微生物保藏所](日本千叶市292-0818加津佐镰足2-5-8，122室(Room 122,2-5-8Kazusa Kamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818,JAPAN))。鉴别参考号：土生隐球菌APC-6431。保藏日期：2015年12月10日。登录号：NITE BP-02178因此，在一个实施例中，本发明中使用的酶是从土生隐球菌菌株MM13-F2171(登录号：NITE BP-02177)或APC-6431(登录号：NITE BP-02178)分离的酶。

转半乳糖基化的反应条件可以由本领域技术人员确定。相关标准包括反应温度、反应时间、乳糖饲料的初始乳糖含量、pH、酶用量等。如下文所示，发现当该乳糖饲料在45wt.％-58wt.％乳糖、优选47wt.％-55wt.％乳糖的范围内的乳糖含量和/或0.60-1.1LU/克、优选0.65-1.0LU/克的酶用量下，在约60℃-75℃、优选约63℃-73℃、更优选约65℃-70℃的温度下与β-半乳糖苷酶接触时，使用CWP或去矿化的CWP作为乳糖饲料获得良好的结果。在一个具体的方面，该反应时间为10-30小时，优选20-26小时，该酶用量为至少0.60LU/克乳糖，该乳糖浓度>50％，且该温度为约60℃-70℃。在一个具体的方面，该反应时间为10-30小时，优选20-26小时，该酶用量为至少0.60LU/克乳糖，该乳糖浓度>50％，且该温度为约65℃-70℃的范围内。在另一个具体的方面，该反应时间为10-30小时，优选20-26小时，该酶用量为至少0.65LU/克乳糖，该乳糖浓度>50％，且该温度为约70℃。

在另一个具体的方面，该反应时间为至少36小时，如40-48小时，该酶用量为0.65-0.75LU/克，该反应温度为约60℃-75℃的范围内，优选63℃-73℃的范围内，更优选65℃-70℃的范围内，且该乳糖浓度为约50％。

在另一个具体的方面，该反应时间为至少36小时，如40-48小时，该酶用量为0.75LU/克，该反应温度为约65℃且该乳糖浓度为约50％。

使用SL-CWP乳糖饲料进行的实验表明，SL-CWP在约55℃-75℃、优选约60℃-70℃、更优选约65℃-70℃的温度下，在pH 6.0-7.0下，和/或在0.60-2.5LU/克、优选0.65-2.0LU/克的酶用量下有利地与β-半乳糖苷酶接触。

在一个实施例中，本发明提供了一种用于生产HA-GOS制剂的方法，该方法包括在0.60-1.0LU/克、优选0.75-1.0LU/克的酶用量下将包含根据SEQ ID NO:1、2、3或4中任一项的氨基酸序列或与其至少80％相同的氨基酸序列(意指：与SEQ ID NO:1至少80％相同、与SEQ ID NO:2至少80％相同、与SEQ ID NO:3至少80％相同、和/或与SEQ ID NO:4至少80％相同)的β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)与CWP接触，该CWP已在至少60wt.％的初始乳糖含量下经受乳糖去除步骤，随后经受去除多价阴离子的步骤。例如，在65℃下，使用65％(w/w)OPL，在2LU/克乳糖的酶用量下进行该反应。在24小时反应后，可通过离心获得形成的GOS，并可例如通过在100℃下加热15分钟使该酶变性。

在根据本发明的方法中，可使由此获得的HA-GOS经受至少一个另外的纯化步骤，优选地其中所述纯化步骤包括以下中的一个或多个：去矿化、去蛋白化、去除单糖组分、富集唾液乳糖或去除有色杂质(例如通过用活性炭处理)。在一个实施例中，将HA-GOS进行纳滤(NF)或超滤步骤(UF)以去除单糖和蛋白质。可进行另外的浓缩步骤(例如使用NF或蒸发)以获得浓缩的、优选富含SL的HA-GOS制剂，其干物质含量至少为70％、优选至少为75％。

HA-GOS

本文还提供了一种低变应原性的GOS制剂，其可通过根据本发明的方法获得。

如本文所用，术语“低变应原性的GOS制剂”(缩写为HA-GOS)是指不触发Bc-GOS诱导的过敏的GOS组合物。换句话说，术语“低变应原性的GOS制剂”是指一种GOS组合物，当施用给患有通过环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶产生的GOS引起的过敏的受试者时，与通过环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶产生的GOS制剂相比，会引起过敏反应降低。更特别地，与通过环状芽孢杆菌获得的GOS制剂相比，在从该受试者分离的血液样品上进行嗜碱性粒细胞活化测试时，低变应原性的GOS制剂的评分降低。

在一个具体的方面，本发明提供了一种低变应原性的GOS制剂，其包含至少0.3wt.％的唾液乳糖，优选至少0.35wt.％的唾液乳糖。使用SL-CWP作为乳糖饲料时，可获得该HA-GOS制剂。例如，本文提供了一种HA-GOS制剂，基于总干物质包含至少50wt.％的DP2-DP7 GOS(确保双歧效应)和至少0.30wt.％的唾液乳糖。从此类制剂去除乳糖和单糖提供了一种HA-GOS制剂，基于总干物质包含至少70wt.％、优选至少75wt.％的DP2-DP7 GOS(确保双歧效应)和至少0.35wt.％的唾液乳糖。该HA-GOS制剂具有类似于从纯化的乳糖饲料制备的GOS制剂的GOS组成，但富含唾液乳糖。此外，该SL-CWP乳糖饲料中存在的维生素也可能存在于该HA-GOS制剂中。该SL-CWP乳糖饲料中存在的(部分)矿物质也可能存在。

还提供了当使用CWP作为乳糖饲料时获得的HA-GOS制剂。此类HA-GOS制剂包含基于总干物质的至少50wt.％的DP2-DP7 GOS。从此类制剂去除乳糖和单糖提供了一种HA-GOS制剂，基于总干物质包含至少70wt.％、优选至少75wt.％的DP2-DP7 GOS。该HA-GOS制剂具有类似于从纯化的乳糖饲料制备的GOS制剂的组成。此外，该CWP乳糖饲料中存在的维生素也可能存在于该HA-GOS制剂中。该SL-CWP乳糖饲料中存在的(部分)矿物质也可能存在。

观察到通过本发明的方法获得的HA-GOS比常规GOS更富含4GL。4GL是DP3 GOS，其化学式为半乳糖(β1→4)乳糖。4GL是一种人乳糖(HMO)。

同时，观察到通过本发明的方法获得的HA-GOS富含非蛋白质氮(NPN)。NPN来源于尿素、氨、胆碱、氨基糖、尿酸、肌酸/肌酐、肉碱、游离氨基酸、肽、磷脂、多胺和/或核苷酸/核苷。NPN被认为在肠道成熟、微生物组发育、饱腹感和饱食感、脂肪生成、大脑发育和/或免疫系统调节中发挥作用。

另一实施例涉及用于至少部分地预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应的方法中的本发明的低变应原性的GOS制剂。还提供了一种至少部分地预防受试者中的(IgE介导的)过敏反应的方法，该方法包括向该受试者施用本发明的低变应原性的GOS制剂。例如，已知该受试者对通过使用衍生自环状芽胞杆菌的β-半乳糖苷酶对乳糖进行转半乳糖基化而获得的GOS制剂具有超敏反应或对其具有超敏反应的机会的增加。

在这些实施例中，该受试者是哺乳动物，特别是人类。该受试者可能有任何年龄。在一个优选的实施例中，该受试者是青少年或成人。青少年在本文定义为年龄在13至20岁之间的人。成人在本文定义为年龄在20岁或以上的人。在另一优选的实施例中，该受试者是年龄在3岁(36个月)至13岁之间的儿童。在又另一优选的实施例中，该受试者是年龄在0至3岁之间、优选年龄在18个月或以上、更优选年龄在24个月或以上的儿童。迄今为止，在年龄在18个月或以下的受试者中尚未报告与GOS相关的罕见过敏。因此，在一个优选的实施例中，该受试者是年龄在18个月或以上、优选年龄在24个月或以上、更优选年龄在36个月或以上的成人、青少年或儿童。

鉴于东南亚(例如新加坡、日本)4’-GOS和/或6’-GOS相关过敏的局部发病率，该受试者优选是东南亚来源。

低变应原性的营养组合物

本发明还涉及一种营养组合物，其包含用于生产此类HA-GOS制剂的根据本发明的方法中的HA-GOS制剂。在一个实施例中，该营养组合物是孕妇用MUM组合物、成长乳(GUM)、后续配方食品或婴儿配方食品。

本发明还涉及一种用于提供低变应原性的营养组合物的方法，包括(i)根据本文披露的方法提供该GOS制剂，以及(ii)将所述低变应原性的GOS制剂与至少一种进一步的低变应原性的或非变应原性的成分一起配制在低变应原性的营养组合物中。选自由低变应原性的或非变应原性的蛋白质源组成的组的该至少一种另外的成分可包含非变应原性的乳蛋白水解物、游离氨基酸、益生菌、脂质源和碳水化合物，诸如乳糖、蔗糖、淀粉或麦芽糊精。本发明还提供了一种营养组合物，其可通过此方法获得。

低变应原性的或非变应原性的蛋白质源是本领域已知的，特别是用于婴儿配方食品中。如本文所用的术语非变应原性的水解物和基本上不含变应原性的蛋白质的水解物是可互换的。它们是指可施用于对饮食蛋白质(更特别是牛乳蛋白质)具有不耐受的婴儿而不会引起过敏反应的蛋白质水解物。在一个实施例中，至少一种另外的低变应原性的或非变应原性的成分选自非变应原性的蛋白质水解物和基本上不含变应原性的蛋白质的水解物、低变应原性的蛋白质源、和水解的乳清蛋白质。例如，US 5,039,532披露了水解的乳清蛋白质材料，未从其去除由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白组成的变应原，并且其中包括水解的变应原性的水解的蛋白质材料呈具有的分子量不超过10,000Da的水解残基形式，使得水解的材料基本上不含变应原性的蛋白质和蛋白质源的变应原。在一个实施例中，包括具有最大3000Da的肽的低变应原性的酪蛋白水解物。

作为碳水化合物源，任何类型的碳水化合物或不同碳水化合物的混合物，都可以提供通常用于儿童食品配方中的碳水化合物。合适的碳水化合物源是二糖(诸如乳糖和糖)、单糖(诸如葡萄糖和麦芽糊精)、淀粉和具有益生元效应的碳水化合物源。在一个实施例中，使用人乳低聚糖。

根据本发明的组合物中的脂质源可以是适合用于(儿童)营养产品中的任何类型的脂质或脂质的组合。合适的脂质源的实例是甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯，磷脂，鞘脂，脂肪酸，及其酯或盐。该脂质可以具有动物、植物、微生物或合成源。特别令人感兴趣的是多不饱和脂肪酸(PUFA)，诸如γ-亚麻酸(GLA)、二高γ-亚麻酸(DHGLA)、花生四烯酸(AA)、十八碳四烯酸(SA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA)和共轭亚油酸(CLA)。CLA在保护免于儿童湿疹和呼吸道疾病上是重要的。这特别涉及CLA的顺式9、反式11和顺式12异构体。合适的植物脂质源的实例包括太阳花油、高油酸阳光花油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、大豆油等。动物源的合适的脂质源的实例包括乳脂，例如无水乳脂(AMF)、奶油等。在一个优选的实施例中，使用乳脂和植物源的脂质的组合。

在一个实施例中，根据本发明的组合物包含益生菌。在本发明的上下文中，术语“益生菌”是指益生菌的菌株。益生菌是本领域已知的。适当地，该益生菌不进行基因修饰。合适的益生菌包括双歧杆菌(Bifidobacteria)属细菌(例如短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum))、乳酸杆菌(Lactobacillus)属细菌(例如嗜酸乳酸杆菌(L.Acidophilus)、副干酪乳酸杆菌(L.paracasei)、约翰逊氏乳酸杆菌(L.johnsonii)、植物乳酸杆菌(L.plantarum)、罗伊氏乳酸杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus)、干酪乳酸杆菌(L.casei)、乳酸乳球菌(L.lactis))和链球菌(Streptococcus)属细菌(例如嗜热乳酸链球菌(S.thermophilus))。短双歧杆菌和长双歧杆菌是尤其合适的益生菌。可以例如从健康的人乳喂养的婴儿的粪便中分离合适的短双歧杆菌菌株。

益生元和益生菌的组合也称为“合生素”。该益生菌可以以任何合适的浓度存在于组合物中，适当地在本发明的上下文中以治疗有效的量或“有效处理量”。合适地，本发明组合物中包含益生菌，其量为10exp2-10exp13 cfu/g组合物干重、合适地10exp5-10exp12cfu/g、最合适地10exp7-10exp10 cfu/g。

此外，该组合物可含有一种或多种常规的微成分，诸如维生素、抗氧化剂、矿物质、游离氨基酸、核苷酸、牛磺酸、肉碱和多胺。合适的抗氧化剂的实例是BHT、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E、α和β胡萝卜素、叶黄素、玉米质、番茄红素和磷脂。

根据本发明的组合物可用作营养组合物、营养疗法、营养支持，用作医疗食品，用作特殊医疗目的的食物或用作营养补充剂。本组合物适当地是肠内组合物。将该组合物施用给或打算施用给有需要的受试者。该受试者是哺乳动物，特别是人类，且该受试者可能有任何年龄。在一个优选的实施例中，该受试者是成人。该受试者可能是例如老年人或绝经后妇女。该受试者也可能是孕妇。因此，在一些实施例中，本组合物是孕妇的MUM组合物。在另一优选的实施例中，该受试者是青少年。在一个具体的方面，该营养组合物是成长乳(GUM)或后续配方食品。

一种本文提供的营养组合物，包含从低成本乳糖饲料获得的HA-GOS，在营养领域中具有许多有利的应用。例如，本发明提供了一种用于至少部分地预防受试者中的GOS制剂的超敏反应的方法，包括向该受试者施用低变应原性的营养组合物，该营养组合物包含本发明的低变应原性的GOS制剂，优选其中该受试者是成人、青少年或儿童，更优选具有18个月或更高的年龄。在一个具体的方面，该受试者是东南亚源。

附图说明

图1：OPL组成的图示(按干物质)。

图2：酶促将OPL转化为BOS的示意图。

图3：“OPL至富含SL的GOS”过程的图示。

图4A：通过表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c测量的测试受试者1号中嗜碱性粒细胞活化的结果(MFl＝平均荧光)。

图4B：通过表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c测量的测试受试者2号中嗜碱性粒细胞活化的结果(MFl＝平均荧光)。

图4C：通过表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c测量的测试受试者3号中嗜碱性粒细胞活化的结果(MFl＝平均荧光)。

实验部分

衍生自土生隐球菌的β-半乳糖苷酶

用于本发明中的根据衍生自土生隐球菌的SEQ ID NO:1、2、3和4的β-半乳糖苷酶(也称为“Tetris酶”)获自天野酶公司(Amano Enzyme Inc.)(日本名古屋)。天野公司在WO2017/115826中披露了这些β-半乳糖苷酶及其制备方法。在WO 2017/115826中披露了衍生自土生隐球菌的(突变型)β-半乳糖苷酶的制备方法以及酶性质。

实例1：低变应原性的GOS(HA-GOS)的制备。

该实例描述了确定该Tetris酶从作为乳糖饲料的干酪乳清渗透物(CWP)制备HA-GOS的最佳工艺条件的过程。

采用电渗析(ED)将该干酪乳清渗透物从约12mS去矿化至4mS或以下。浓缩后，在制备HA-GOS时使用该去矿化的CWP作为乳糖饲料。

去矿化之前和之后该干酪乳清渗透物的组成如表3所示。

表3：干酪乳清渗透物(CWP)的组成。

实验装置

温度：65℃、67.5℃或70℃

乳糖含量(DM)：45％、50％或55％

酶用量：50％、75％或100％，其中100％＝0,94LU/克乳糖

将干酪乳清渗透物(CWP)用作乳糖饲料。首先将CWP去矿化至4％的矿物质含量。然后将该去矿化的CWP浓缩(通过蒸发)至乳糖含量为45％、50％或55％。然后通过添加不同用量(0.5、0.75或1.0)的Tetris酶(BGP1150931SDR批次)来引发该GOS反应。在黑暗中使用磁性搅拌，该GOS反应在水浴中进行。在该过程之前或过程中未进行pH调整。该反应温度为65℃、67.5℃或70℃。

表4总结了各个实验的实验细节。

表4：从去矿化的CWP制备HA-GOS的各个实验的细节。

*将该样品用于该BAT测试中以确定低变应原性。

GOS产量

表5、6和7显示在65℃(表5)、67.5℃(表6)和70℃(表7)的几个实验中，基于乳糖的GOS量。这些结果表明该酶在各种反应条件下将乳糖转化为GOS的效果如何。此外，它表明了基于干物质(DM)和基于乳糖的GOS量。以基于总产物的GOS量添加第三列。最高产量可以是最高DM的情况。它还表明，酶的正常用量的0.5即使在24小时后也足以造成基于DM的超过45％GOS。

表5：使用CWP作为乳糖饲料，在各种乳糖浓度下，温度为65℃，基于乳糖、DM和总产物的GOS的GOS浓度。

表6：使用CWP作为乳糖饲料，在各种乳糖浓度下，温度为67.5℃，基于乳糖、DM和总产物的GOS的GOS浓度。

表7：使用CWP作为乳糖饲料，在各种乳糖浓度下，温度为70℃，基于乳糖、DM和总产物的GOS的GOS浓度。

表8和9显示了针对在一系列实验中变化的不同参数的HA-GOS产量的平均值。

表8：GOS产量的平均值，表示为在24h反应时间后基于乳糖含量的GOS(意指样品中所有乳糖转化为GOS的x％)。

表9：GOS产量的平均值，表示为在24h反应时间后基于乳糖含量的GOS(意指样品中所有乳糖转化为GOS的x％)。

根据本发明的HA-GOS制剂的另外特征示于表10和11中。表10显示了与使用纯化的乳糖作为乳糖饲料使用Tetris酶获得的参考GOS制剂的糖谱相比，根据本发明的HA-GOS的糖谱。

表10：根据本发明的HA-GOS和参考GOS的糖谱。

1参考GOS是用纯化的乳糖作为乳糖饲料使用Tetris酶获得的参考GOS制剂。

2使用Tetris酶，获自CWP的根据本发明的HA-GOS制剂。

表11显示了与使用纯化的乳糖作为乳糖饲料使用Tetris酶获得的参考GOS的分布相比，根据本发明的HA-GOS的二糖至庚糖(聚合度(DP)2至7)的分布。

表11：与参考GOS的分布相比，根据本发明的HA-GOS的DP分布。

1参考GOS是用纯化的乳糖作为乳糖饲料使用Tetris酶获得的参考GOS制剂。

2使用Tetris酶，获自CWP的根据本发明的HA-GOS制剂。

由上文断定，在将CWP用作生产HA-GOS制剂的方法中的乳糖饲料时，当最小酶用量为0.65LU/克乳糖，在70℃温度下持续24小时反应时间，最小乳糖浓度>50％，CWP用作原料时，获得优异的结果。

在42小时的反应时间的情况下，最佳反应条件是0.75LU/克的酶用量，温度为65℃，且乳糖浓度为50％。

在选择最佳条件时，重要的是要记住，最佳条件是在一定范围内，且具体条件可以在组合最佳范围内所有3个选定参数时定义。例如，当选择0.75LU/克酶用量时，温度为65℃，且乳糖浓度为≥50％。

实例2：从SL-CWP制备HA-GOS

该实施例描述了可如何获得富含SL的CWP(SL-CWP)，并用作乳糖饲料，以进行HA-GOS的经济高效制造。

首先通过使用本领域已知的程序进行结晶来使CWP经受乳糖去除步骤。为此，将CWP典型地浓缩至约48％(w/w)，将该溶液冷却至15℃并搅拌8-24小时以允许乳糖结晶。通过离心分离如此形成的乳糖晶体。获得的母液称为OPL或DLP，典型地含有约24％(w/w)干物质。将OPL或DLP浓缩至44％(w/w)或更高以进一步应用或处理。OPL或DLP富含唾液乳糖SL，可以使其经受上述各种处理，以在去除盐和单糖后获得高纯度(>75％GOS)的富含SL的HA-GOS。

由此获得的SL-CWP的组成示于表12中。

表12：SL-CWP(乳糖贫化的乳清；OPL)和CWP的典型化学组成。

使用Tetris酶用SL-CWP作为乳糖饲料的HA-GOS制剂。

在65℃下使用65％(w/w)SL-CWP(如上所述制备)用2LU/克乳糖的酶用量进行反应。24小时反应时间后，通过离心分离形成的HA-GOS，并通过在100℃下加热15分钟使该酶变性。通过HPLC分析最终产物以确定DP(聚合度)分布。发现该DP组成与使用纯化的乳糖作为乳糖饲料用Tetrisβ-半乳糖苷酶制备的参考GOS高度相似(见表13)。在去除矿物质之后，该GOS水平为至少约45wt.％，且该SL水平为至少约0.4wt.％。

表13：用环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶(BC-GOS)生产的常规GOS制剂、使用源自土生隐球菌的“Tetris”酶从纯化的乳糖获得的参考GOS(Ref-GOS)和使用源自根据本发明的土生隐球菌的“Tetris”酶从SL-CWP获得的HA-GOS的DP组成的比较。

1BC-GOS是用纯化的乳糖作为乳糖饲料和环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶生产的常规GOS制剂。

2.参考GOS是用纯化的乳糖作为乳糖饲料使用Tetris酶获得的参考GOS制剂。

3使用Tetris酶，获自SL-CWP的根据本发明的HA-GOS制剂。

表14和15总结了采用“Tetris”酶在转半乳糖基化方法中使用纯化的乳糖、CWP或SL-CWP作为乳糖饲料获得的HA-GOS的组成。还包括BC-GOS，是指使用环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶获得的商业GOS制剂，以及粗原料CWP和SL-CWP的组成。

表14：在采用“Tetris”酶(Ref-GOS)或环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶(BC-GOS)的转半乳糖基化方法中使用纯化乳糖作为乳糖饲料获得的GOS的组成。

1BC-GOS是用纯化的乳糖作为乳糖饲料和环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶生产的常规GOS制剂。

2.参考GOS是用纯化的乳糖作为乳糖饲料使用Tetris酶获得的参考GOS制剂。

表15：在采用“Tetris”酶的转半乳糖基化方法中使用CWP或SL-CWP作为乳糖饲料获得的HA-GOS的组成，以及粗原料CWP和SL-CWP的组成。

1使用Tetris酶，获自CWP的根据本发明的HA-GOS(CWP)制剂。

2使用Tetris酶，获自SL-CWP的根据本发明的HA-GOS(SL-CWP)制剂。

实例3：嗜碱性粒细胞活化测试

该实施例描述了嗜碱性粒细胞活化测试，以证明患有已知的低聚半乳糖过敏的多个人受试者中的HA-GOS的变应原降低。以用干酪乳清渗透物(CWP)作为乳糖饲料制备的HA-GOS和用富含SL的干酪乳清渗透物(SL-CWP)作为乳糖饲料制备的HA-GOS进行了测试。用CWP作为乳糖饲料制备的HA-GOS在此称为HA-GOS(CWP)。用SL-CWP作为乳糖饲料制备的HA-GOS在此称为HA-GOS(SL-CWP)。

材料

测试中包括HA-GOS(CWL)(PT731批次；见实例1)、HA-GOS(SL-CWP)(见实例2)和使用环状芽孢杆菌酶获得的商业GOS制剂(BC-GOS)。将材料在室温下储存在黑暗中直至使用。

受试者

如Soh等人(Anaphylaxis to galacto-oligosaccharides-an evaluation in anatopic population in Singapore[对低聚半乳糖的过敏反应-新加坡特应性群体中的评估],Allergy[过敏],2015,70,1020-1023)的文章中所述，从先前针对新加坡特应性群体中GOS过敏患病率进行研究的队列中选择合适的受试者。该研究经新加坡国立大学医院机构伦理审查委员会(National University Hospital Singapore institutional ethicalreview board)批准。所有受试者的书面知情同意书是在研究开始之前获得的。

嗜碱性粒细胞活化测试

对患者血液样品进行了嗜碱性粒细胞活化测试。将肝素化的外周血等分试样(100μL)在37℃下预孵育5分钟，并且然后用100μL的PBS(阴性对照)、抗IgE抗体(阳性对照，G7-18；加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,Calif))或稀释的GOS样品孵育15分钟(37℃)。孵育后，将细胞在PBS-EDTA(20mmol/L)中洗涤，并且然后用藻红蛋白标记的抗人IgE(Ige21；eBioscience公司,圣何塞,加利福尼亚州)、生物素标记的抗人CD203c(NP4D6；百进生技公司(BioLegend),圣何塞,加利福尼亚州)和荧光素异硫氰酸酯标记的抗人CD63(MEM-259，百进生技公司)mAb在48℃下孵育20分钟。CD203c和CD63的表达都是嗜碱性粒细胞活化的标记物。用1％BSA/PBS洗涤细胞后，添加别藻蓝素-偶联的链霉亲和素(BD生物科学公司)，并在48℃下孵育15分钟。此后，用2mL的FACS裂解液(BD生物科学公司)使样品经受红细胞裂解。然后洗涤细胞，将其再悬浮于1％BSA/PBS中，并通过FACSCalibur(BD生物科学公司)进行分析。基于侧面散射特征和IgE表达(IgE高)检测嗜碱性粒细胞。

结果

图4a-4c显示在三个受试者上进行的嗜碱性粒细胞活化测试的结果。图4a显示通过表达嗜碱性粒细胞活化标记物CD203c测量的测试受试者1号中嗜碱性粒细胞活化的结果(MFl＝平均荧光)。类似地，图4b和4c分别显示测试受试者2号和3号中的嗜碱性粒细胞活化，

结果表明，所有三个受试者都对BC-GOS有阳性的嗜碱性粒细胞活化反应，表明该受试者对BC-GOS过敏，因此证实了以前的发现(Soh等人,2015)。然而，在任何受试者中用HA-GOS(CWP)或HA-GOS(SL-CWP)孵育嗜碱性粒细胞均未显示或几乎没有任何嗜碱性粒细胞活化。仅在测试的最高浓度下，HA-GOS(CWP)和HA-GOS(SL-CWP)显示出非常轻微的嗜碱性粒细胞活化，与参考BC-GOS反应相比显然降低。

结论

BC-GOS过敏受试者中的嗜碱性粒细胞活化测试表明，与BC-GOS相比，HA-GOS(CWP)和HA-GOS(SL-CWP)具有显著降低的变应原性。可以得出结论，根据本发明的HA-GOS(CWP)和HA-GOS(SL-CWP)显然是低变应原性的。