3型分泌系统抑制剂和抗生素疗法

摘要

公开了3型分泌系统(T3SS)抑制剂、丹参酮和丹参酮类似物，以及使用其用于治疗疾病的方法。本发明总体上涉及抗生素化合物、以及使用其治疗或预防细菌感染的方法，并且更具体地但非排他地，涉及抑制3型分泌系统(T3SS)针的生物发生的包括丹参酮和丹参酮类似物在内的化合物及其使用方法。

说明书

交叉参考

本申请要求于2018年11月2日提交的美国临时申请号62/754,960的优先权权益，所述申请整体引入本文作为参考。

关于联邦资助研究的声明

本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号GM106710和CA219150下，由政府资助完成。政府在本发明中拥有一定的权利。

技术领域

本发明总体上涉及抗生素化合物、以及使用其治疗或预防细菌感染的方法，并且更具体地但非排他地，涉及抑制3型分泌系统(T3SS)针的生物发生的包括丹参酮和丹参酮类似物在内的化合物及其使用方法。

背景技术

抗微生物剂抗性正在成为公众健康的最大威胁之一。根据广泛引用的权威报告，到2050年，细菌、病毒和真菌的药物抗性感染将导致全世界每年1000万例死亡，这强调了迫切需要开发新类别的治疗剂来避免这一全球危机。细菌经由改变的膜渗透性、使其酶促失活或修饰其预期干预靶以及其它机制，来控制抗生素的摄取或流出，而发展药物抗性。常规抗生素旨在杀死，因此使细菌经受进化选择压力，其总是诱导药物抗性突变以逃避杀死。在某种程度上，理想的抗生素对现有的抗性机制是抗拒的，并且可以阻断细菌感染宿主的能力而不直接杀死它们，从而避免诱导药物抗性。为此，靶向对于存活并非必需但对于致病性至关重要的细菌毒力因子，已成为对抗抗生素抗性的最有吸引力的策略之一。原则上，这种抗毒力策略结果是细菌发展抗性的较低可能性，因为其对它们诱导较小的选择压力。许多致病性革兰氏阴性菌的一种此类毒力因子是3型分泌系统(T3SS)。

发明内容

在一个方面，本公开内容提供了治疗或预防有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的3型分泌系统(T3SS)抑制剂，其中所述T3SS抑制剂选自丹参酮、丹参酮类似物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。在一个实施方案中，丹参酮是丹参酮1(TSN1)。在一些实施方案中，丹参酮类似物是二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN)。

在另一个方面，提供用于治疗或预防有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的药物组合物，该组合物包含3型分泌系统(T3SS)抑制剂，其中所述T3SS抑制剂选自丹参酮、丹参酮类似物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。

在又一个方面，提供抑制、治疗或预防有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的3型分泌系统(T3SS)抑制剂，其中所述T3SS抑制剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。

在另一个方面，本公开内容提供了用于治疗或预防有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的药物组合物，该组合物包含3型分泌系统(T3SS)抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述T3SS抑制剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。

在又一个方面，提供鉴定3型分泌系统(T3SS)抑制剂的方法，该方法包括：

(a)将候选药剂加入包含T3SS中的蛋白质复合物的组合物中，其中所述蛋白质复合物的组分是荧光标记的；

(b)确定荧光标记组分的荧光偏振(FP)；

其中如果FP相对于参考FP水平是减少的，则候选药剂被鉴定为T3SS抑制剂。

在另一个方面，本公开内容提供了治疗或预防有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的药剂，所述药剂根据如本文所述的鉴定T3SS抑制剂的方法，鉴定为3型分泌系统(T3SS)抑制剂。

在另一个方面，提供用于治疗或预防有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的药物组合物，该组合物包含药剂和药学上可接受的载体，所述药剂根据本文所述的鉴定T3SS抑制剂的方法，鉴定为3型分泌系统(T3SS)抑制剂。

在本文任何一个方面的一个实施方案中，革兰氏阴性菌是假单胞菌属(

在一个方面，提供治疗有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的选自以下的3型分泌系统(T3SS)抑制剂：丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)、二氢丹参酮(dHTSN)及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。

在另一个方面，提供用于治疗有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的药物组合物，该组合物包含选自以下的3型分泌系统(T3SS)抑制剂和药学上可接受的载体：丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)、二氢丹参酮(dHTSN)及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。

附图说明

图1A-1B示出了铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生。图1A显示了铜绿假单胞菌的T3SS的示意图，其改编自Abrusci等人2014。图1B显示了由Quinard等人

图2A-2B示出了合成肽/蛋白质通过HPLC、ESI-MS和CD光谱学的表征。图2A显示了通过RP-HPLC和ESI-MS表征的化学合成的PscF

图3A-3E示出了丹参酮衍生物作为铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生的抑制剂的鉴定。图3A显示了用于设计用于高通量筛选(high-throughput screening, HTS)的荧光偏振测定的策略。PscE-

图4A-4C显示了与PscE-PscG相互作用的丹参酮衍生物通过NMR光谱学和分子建模的结构表征。图4A显示了在dHTSN1的存在(灰色)和不存在(黑色)下，PscE-PscG异二聚体的

图5A-5B显示了丹参酮衍生物在体外作为铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生的抑制剂的功能表征。图5A显示了100 μM的丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)、二氢丹参酮(dHTSN)和隐丹参酮(crpTSN)对铜绿假单胞菌菌株PAO1和鼠巨噬细胞系J774A.1的细胞活力的作用。数据是三次独立实验的平均值。图5B显示了100 μM的丹参酮化合物对PAO1的ExoS分泌的作用，所述PAO1在其中T3SS转录激活的低钙条件下生长。数据是三次独立实验的平均值。注意，丹参酮最初溶解于DMSO中，并且稀释到培养基内用于体外测定，其中培养基中的2% DMSO用作阴性对照。

图6A-6C示出了丹参酮衍生物在体外作为铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生的抑制剂的功能表征。图6A显示了如通过LDH释放测定所测量的，通过不同浓度的丹参酮化合物抑制PAO1对鼠巨噬细胞的细胞毒性。数据是三次独立实验的平均值。图6B显示了用100 μM的丹参酮化合物治疗的受PAO1感染的鼠巨噬细胞中，半胱天冬酶1激活的蛋白质印迹分析。图6C显示了通过不同浓度的丹参酮化合物抑制鼠巨噬细胞中的PAO1细胞内增殖。数据是三次独立实验的平均值。注意，丹参酮最初溶解于DMSO中，并且稀释到培养基内用于体外测定，其中培养基中的2% DMSO用作阴性对照。

图7A-7C显示了丹参酮衍生物在体内作为铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生的抑制剂的功能表征。图7A显示了TSN1、dHTSN和dHTSN 1对用PAO1鼻内攻击的C57BL/6J小鼠(n=20/组)的存活的作用。

图8示出了使用固相肽合成加上天然化学连接，用于制备PscE、PscF和PscG的策略。为了获得异三聚体复合物，将等摩尔比的PscE、PscF和PscG溶解于6 M GuHCl中，随后为用PBS的6倍稀释以及针对PBS的过夜透析。

图9A-9C显示了通过RP-HPLC和ESI-MS表征的PscF。图9A显示了PscF

图10A-10C显示了通过RP-HPLC和ESI-MS表征的PscE肽。图10A显示了PscE

图11A-11C 通过RP-HPLC和ESI-MS表征的PscG肽。图11A显示THZ-PscG

图12A-12D 通过RP-HPLC和ESI-MS表征的PscG肽。图12A显示了PscG

图13A-13D图示了PscE、PscF和PscG的表征。图13A显示了使用伴清蛋白(75000)、卵清蛋白(43000)、碳酸酐酶(29000)、核糖核酸酶A(13700)和抑肽酶(6500)，在Superdex75柱(10/300 GL)上获得的MW标准校准曲线。缓冲液是在室温下以0.5 ml/ml的流速运行的10 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA，pH 7.0。图13B显示了PscE-PscF-PscG在Superdex75上的洗脱。从标准校准曲线计算的表观分子量指示了异三聚体复合物的存在。图13C显示了异三聚体复合物的RP-HPLC得到通过ESI-MS确认的PscE、PscF和PscG的三个良好分辨的峰。图13D是显示了PscG、PscE、PscF、PscG-PscE异二聚体和PscG-PscE-PscF异三聚体的热变性的曲线图。所有肽都在PBS中以20 μM制备，在25℃和90℃之间通过在222 nm处的CD光谱学进行监测。非线性回归分析得到的解链温度(Tm)值对于PscF为40.1±0.5，对于PscE为58.7±1.2，对于PscG为39.2±1.5，对于PscE-PscG为43.1±1.3，对于PscF-PscG为59.9±0.9，且对于PscF-PscE-PscG为61.7±0.7。

图14A-14C图示了PscE、PscF和PscG的表征。图14A显示了在10 mM Tris、150 mMNaCl、1 mM EDTA，pH 7.0中，通过ITC定量PscF

图15A-15D描绘了以四种不同浓度的十种天然草药化合物的初始FP筛选：1 μM(图15A)、10 μM(图15B)、100 μM(图15C)和1 mM(图15D)。使用非配对t检验计算与NC组(模拟治疗)相比的显著性，并且p值如下：*p < 0.05，**p < 0.01以及***p < 0.001。甘草酸铵、黄芪甲苷、黄芩素、仙茅苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、蛇床子素、人参二醇、槲皮素和丹参酮1。

图16A显示了不同浓度的丹参酮1对在25℃下，在10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4中获得的20 μM PscG-PscE-PscF异三聚体的圆二色谱的作用。随着丹参酮1的浓度增加，PscF-PscE-PscG复合物的螺旋度逐渐减少。图16B-16C显示了通过在222 nm处的CD光谱学在25和90℃之间监测的，在300 μM丹参酮1的不存在(图16B)和存在(图16C)下，在PBS中20 μM的PscF69-85-PscE-PscG复合物的热变性。非线性回归分析得到分别为54.8和52.3的Tm值。

图17显示了在这项工作中测试的丹参酮类似物。注意：–，未观察到FP竞争测定中的浓度依赖性特性；ND，未完成。通过非配对t检验计算与模拟治疗组相比的显著性，且p值如下：ns，不显著(p > 0.05)，*p < 0.05，**p < 0.01以及***p < 0.001。

图18A-18C是一组曲线图，其显示了在10 mM Tris缓冲液、150 mM NaCl、1 mMEDTA、5% DMSO，pH 7.0中，用470 nm的激发波长从400 nm到800 nm扫描的荧光光谱。图18A显示了单独的200 μM的丹参酮化合物，并且在Tris缓冲液中的5% DMSO用作对照。图18B显示了在200 μM的丹参酮化合物的存在下100 nM的PscE-PscG。图18C显示了在200 μM的丹参酮化合物的存在下100 nM的FAM-PscF

图19显示了在大肠杆菌中表达的重组PscG的SDS-PAGE分析。S：可溶级分。IB：包涵体(inclusion body)。

图20示出了三种活性丹参酮化合物在PscG(浅灰色)和PscE(深灰色)之间形成的疏水凹槽内的分子对接。

图21是显示了如通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定所确定的，在100 μM的丹参酮化合物的存在下，PAO1和PAO1 Δ

图22显示了如通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定所确定的，在100 μM的丹参酮化合物的存在下，PAO1对鼠巨噬细胞的细胞毒性。数据针对作为阳性对照的PAO1(在丹参酮的不存在下)和阴性对照PAO1 Δ

图23显示了基于炎症程度对每组肺组织切片的组织病理学评分。数据显示为三次独立实验的平均值± SD(每组n=10)。使用非配对t检验计算与模拟治疗组相比的显著性，且p值如下：*p < 0.05，**p < 0.01以及***p < 0.001。

图24是一组曲线图，其显示了通过RP-HPLC定量丹参酮在1% DMSO中的水溶解性。层析图在Waters XBridge C18柱(4.6×150 mm，3.5 μm)上获得，所述柱运行45分钟从5%到95%的乙腈梯度。

图25A-25G显示了MBX1641的表征。图25A显示了通过RP-HPLC和ESI-MS表征的MBX1641。RP-HPLC分析在Waters XBridge C4柱(4.6×150 mm，3.5 μm)上执行，所述柱运行30分钟从5%到65%的乙腈梯度。分子质量通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)进行确定。图25B显示了MBX1641对铜绿假单胞菌菌株PAO1和鼠巨噬细胞系J774A.1的细胞活力的作用。数据是三次独立实验的平均值。图25C显示了6.25 μM的MBX1641对PAO1的ExoS分泌的作用，所述PAO1在其中T3SS转录激活的低钙条件下生长。数据是三次独立实验的平均值。图25D显示了如通过LDH释放测定所测量的，通过MBX1641抑制PAO1对鼠巨噬细胞的细胞毒性。数据是三次独立实验的平均值。图25E显示了通过MBX1641抑制鼠巨噬细胞中的PAO1细胞内增殖。数据是三次独立实验的平均值。图25F显示了通过100 μM MBX1641降低在受PAO1感染的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的细菌负荷。图25G显示了如通过在10 mM Tris、150 mM NaCl、1 mMEDTA，pH 7.0中，在室温下的荧光偏振定量的，PscF

图26A-26B显示了示例性丹参酮或丹参酮类似物化合物的结构。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的含义。本文提及的所有专利和出版物都整体引入作为参考。

如本文使用的，术语“施用(administer)”、“施用(administration)”或“施用(administering)”指(1)由健康从业者或他的授权代理人或在他或她的指导下根据本公开内容提供、给予、给药和/或开处方；和/或(2)根据本公开内容放入哺乳动物内，由哺乳动物摄入或消耗。

如本文使用的，术语“共施用(co-administration)”、“共施用(co-administering)”、“与……组合施用(administered in combination with)”、“与……组合施用(administering in combination with)”、“同时(simultaneous)”和“同时(concurrent)”，涵盖两种或更多种活性药物成分对受试者的施用，使得活性药物成分和/或其代谢产物两者同时存在于受试者中。共施用包括在分开的组合物中的同时施用，在分开的组合物中在不同时间的施用，或在其中存在两种或更多种活性药物成分的组合物中的施用。优选在分开的组合物中的同时施用以及在其中存在两种药剂的组合物中的施用。

术语“活性药物成分”和“药物”包括本文所述的化合物，且更具体地：T3SS抑制剂(例如丹参酮或丹参酮类似物，例如丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))。术语“活性药物成分”和“药物”还可以包括本文所述的结合T3SS组分的那些化合物，例如结合T3SS针蛋白或伴侣蛋白并阻断T3SS伴侣和针蛋白之间的相互作用的化合物。

术语“在体内”指在受试者的体内发生的事件。

术语“在体外”指在受试者的体外发生的事件。体外测定涵盖其中采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，并且还可以涵盖其中不采用完整细胞的无细胞测定。

术语“有效量”或“治疗有效量”指如本文所述的化合物或化合物组合的量，其足以实现预期应用包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可以取决于预期应用(体外或体内)、或受试者和待治疗的疾病状况(例如，受试者的重量、年龄和性别)、疾病状况的严重性、施用方式等而变，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语还适用于在靶细胞中诱导特定应答(例如，对细胞凋亡的敏感性增加)的剂量。具体剂量取决于所选择的特定化合物、待遵循的给药方案、化合物是否与其它化合物组合施用、施用时机、它施用于其的组织、以及化合物在其中携带的物理递送系统而变。

如该术语在本文中使用的，“疗效”涵盖治疗益处和/或预防益处。预防效应包括延迟或消除疾病或状况的出现，延迟或消除疾病或状况的症状发作，减慢、停止或逆转疾病或状况的进展或其任何组合。

术语“QD”、“qd”或“q.d.”意指每日一次、或一天一次、或每天一次。术语“BID”、“bid”或“b.i.d.”意指每日两次、或一天两次、或每天两次。术语“TID”、“tid”或“t.i.d.”意指每日三次、或一天三次、或每天三次。术语“QID”、“qid”或“q.i.d.”意指每日四次、或一天四次、或每天四次。

术语“药学上可接受的盐”指衍生自本领域已知的各种有机和无机抗衡离子的盐。药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸形成。可以由其衍生盐的优选的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。可以由其衍生盐的优选的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。药学上可接受的碱加成盐可以由无机碱和有机碱形成。可以由其衍生盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝。可以由其衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺，环状胺和碱性离子交换树脂。具体实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。在一些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐选自铵、钾、钠、钙和镁盐。术语“共晶”指衍生自本领域已知的许多共晶形成剂的分子复合物。与盐不同，共晶通常不涉及在共晶和药物之间的氢转移，而是涉及在共晶形成剂和呈晶体结构的药物之间的分子间相互作用，例如氢键合、芳环堆积或分散力。

“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”预期包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、以及惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途是本领域众所周知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗组合物中的使用。另外的活性药物成分，例如本文公开的其它药物，也可以掺入所述的组合物和方法内。

如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和/或“治疗(treating)”可以指疾病、病症或病理状况或其症状的管理，其意图是治愈、改善、稳定和/或控制疾病、病症、病理状况或其症状。关于疾病、病症或病理状况的控制，更具体地，“控制”可以包括不存在状况进展，如通过对本文所述方法的应答所评价的，其中此类应答可以是完全的(例如，使疾病缓解)或部分的(例如，减轻或改善与状况相关的任何症状)。

如本文使用的，术语“调节(modulate)”和“调节(modulation)”指生物分子(例如，蛋白质、基因、肽、抗体等等)的生物活性的改变，其中此类改变可能与生物分子的生物活性的增加(例如，增加的活性、激动、激活、表达、上调和/或增加的表达)、或生物活性的降低(例如，降低的活性、拮抗、压制、失活、下调和/或降低的表达)相关。在一些实施方案中，通过本发明的方法和化合物调节以实现治疗的生物分子可以包括3型分泌系统(T3SS)中的分子，例如T3SS针蛋白(例如PscF)或T3SS伴侣蛋白(例如，PscE、PscG)。

“抑制剂”是抑制所述活性、功能或实体的药剂。“T3SS抑制剂”或“T3SS的抑制剂”是降低3型分泌系统(T3SS)的功能或活性的药剂。在一些实施方案中，T3SS抑制剂在体外防止或降低T3SS诱导的细菌毒力。在一些实施方案中，T3SS抑制剂在体内防止或降低T3SS诱导的细菌毒力。T3SS抑制剂可以是这样的化合物，其与T3SS组分结合，并且干扰T3SS组分与其它T3SS组分的结合(例如，与相同的T3SS蛋白结合以形成同型多聚体，或与不同的T3SS蛋白结合以形成异型多聚体)。例如，化合物可以与T3SS蛋白结合并干扰其多聚化。在一些实施方案中，T3SS抑制剂与T3SS针蛋白竞争结合T3SS伴侣蛋白。在一些实施方案中，T3SS抑制剂在组合物中提供，所述组合物还包含无菌载体和/或生理学上可接受的载体。

“前药”指本文所述化合物的衍生物，其药理作用起因于通过体内化学或代谢过程转换为活性化合物。前药包括这样的类化合物，其中氨基酸残基、或者两个或更多个(例如，两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链通过酰胺键或酯键与丹参酮化合物(例如丹参酮1(TSN1))或丹参酮类似物(例如二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))的游离氨基、羟基或羧酸基团共价连接。氨基酸残基包括但不限于通常由单字母或三字母符号指定的20种天然存在的氨基酸，而且包括例如4-羟基脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、3-甲基组氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸砜。还涵盖了另外类型的前药。例如，游离羧基可以衍生为酰胺或烷基酯(例如，甲基酯和乙酰氧基甲基酯)。如本文采用的前药酯包括通过采用本领域技术人员已知的程序，使本发明的方法的化合物的一个或多个羟基与烷基、烷氧基或芳基取代的酰化剂反应，以生成乙酸酯、新戊酸酯、碳酸甲酯、苯甲酸酯等等。作为进一步的实例，可以使用基团包括但不限于半琥珀酸酯、磷酸酯、二甲基氨基乙酸酯和磷酰氧基甲氧基羰基，来衍生游离羟基，如Advanced DrugDelivery Reviews，1996，19，115中概述的。还包括羟基和氨基的氨基甲酸酯前药，如碳酸酯前药、磺酸酯前药、羟基的磺酸酯和硫酸酯一样。游离胺也可以衍生为酰胺、磺酰胺或膦酰胺。所有所述的前药部分都可以掺入基团包括但不限于醚、胺和羧酸官能团。此外，可以在体内转换以提供生物活性剂(例如丹参酮化合物，例如丹参酮1(TSN1)，或丹参酮类似物，例如二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN)))的任何化合物是在本发明的范围内的前药。各种形式的前药是本领域众所周知的。前药和前药衍生物的全面描述在以下中描述：(a)The Practice of Medicinal Chemistry，Camille G. Wermuth等人，(AcademicPress，1996)；(b)Design of Prodrugs，由H. Bundgaard编辑，(Elsevier，1985)；(c)ATextbook of Drug Design and Development，P. Krogsgaard-Larson和H. Bundgaard，编辑，(Harwood Academic Publishers，1991)。一般而言，前药可以设计为改善药物跨越生物膜的渗透，以便获得改善的药物吸收、延长药物作用的持续时间(减缓母体药物从前药中的释放、降低的药物首过代谢)、靶向药物作用、修饰或改善药物(例如，i.v.制剂和滴眼剂)的水溶性、改善局部药物递送(例如，皮肤和眼部药物递送)、改善药物的化学/酶促稳定性、或降低脱靶药物效应，且更一般而言，以便改善本发明中利用的化合物的治疗功效。

除非另有说明，否则本文所述的化学结构预期包括仅一个或多个同位素富集的原子的存在情况不同的化合物。例如，其中一个或多个氢原子被氘或氚替换，或者其中一个或多个碳原子被富含

当范围在本文中用于描述例如物理或化学特性，例如分子量或化学式时，预期包括范围的所有组合和子组合以及其中的具体实施方案。当指的是数目或数值范围时，术语“约”的使用意指所指的数目或数值范围是在实验可变性内(或在统计实验误差内)的近似值，并且因此数目或数值范围可以变化。该变化通常为所述数目或数值范围的0%至15%，优选0%至10%，更优选0%至5%。术语“包含”(以及相关术语，例如“包含(comprise)”或“包含(comprises)”或“具有”或“包括”)包括那些实施方案，例如，“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”的任何物质组合物、方法或过程的实施方案。

为了避免疑问，本文预期与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特定特征(例如整数、特性、值、用途、疾病、式、化合物或基团)，应理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。因此，适当时，此类特征可以与本文定义的任何定义、权利要求或实施方案结合使用。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征、和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些特征和/或步骤是相互排斥的组合之外。本发明并不局限于任何公开的实施方案的任何细节。本发明扩展到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何一个或多个新组合，或者扩展到如此公开的任何方法或过程的步骤的任何一个或多个新组合。

此外，如本文使用的，术语“约”意指尺寸、大小、制剂、参数、形状以及其它数量和特性不是并且无需是精确的，而是根据需要可以是近似的和/或更大或更小的，反映公差、转换系数、舍入、测量误差等等，以及本领域技术人员已知的其它因素。一般而言，无论是否明确声明是这样的，尺寸、大小、制剂、参数、形状或者其它数量或特性均为“约”或“大约”。应注意非常不同的大小、形状和尺寸的实施方案可以采用所述的布置。

此外，当在所附权利要求中以原始和修正的形式使用时，过渡术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”，在什么未叙述的另外权利要求要素或步骤(如果存在的话)排除在权利要求的范围之外的方面，定义了权利要求范围。术语“包含”预期是包括在内的或开放式的，并且不排除任何另外的未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由……组成”排除除权利要求中指定的那些外的任何要素、步骤或材料，并且在后一种情况下，排除与指定材料有关的普通杂质。术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于指定的要素、步骤或材料，以及不实质性地影响本发明的基本和新特性的那些。在替代方案中，本发明的所有实施方案可以更具体地由过渡术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个定义。

作为细胞表面附属物发现的T3SS包含~30种细菌蛋白

铜绿假单胞菌是经常在医院的重症监护室中发现的倾向于抗性的革兰氏阴性病原体。它在免疫受损的患者中引起危及生命的医院内感染，例如肺炎，并且对慢性囊性纤维化患者造成肺部恶化的主要风险

在一个实施方案中，本发明包括其为3型分泌系统(T3SS)的抑制剂的化合物。在一个实施方案中，本发明包括其为T3SS针的生物发生或组装的抑制剂的化合物。

如本文所述，丹参酮被鉴定为用于抗生素疗法的铜绿假单胞菌3型分泌系统针的生物发生的同类第一抑制剂。3型分泌系统(T3SS)作为许多致病性革兰氏阴性菌的细胞表面附属物被发现，虽然对于细菌存活并非必需的，但它是用于药物发现和开发的重要治疗靶，所述药物发现和开发旨在抑制细菌毒力而不诱导抗生素抗性。本文描述的是用于高通量筛选的基于荧光偏振的测定的设计，所述基于荧光偏振的测定作为用于靶向T3SS的抗生素发现的机制上定义明确的一般策略，以及丹参酮子集 – 传统中药中广泛用于治疗心脑血管疾病的天然草药化合物 – 作为多药抗性铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生的有效抑制剂的偶然发现。通过抑制T3SS针组装，并且因此抑制细胞毒性和致病性，所选择的丹参酮在体外降低了对巨噬细胞有毒的细菌毒力因子的分泌，并且在急性肺炎的鼠模型中拯救了用致死剂量的铜绿假单胞菌攻击的实验动物。作为在人中具有可证实的安全概况的同类第一抑制剂，丹参酮可以直接用于减轻铜绿假单胞菌相关的肺部感染，而不诱导抗生素抗性。由于T3SS在革兰氏阴性菌中是高度保守的，因此这种抗毒力策略可能适用于发现和开发对现有抗性机制抗拒的新类别的抗生素，用于治疗许多细菌感染。

在一些实施方案中，本文所述的化合物可以抑制T3SS针组装。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以降低细菌毒力因子的分泌。在一些其它实施方案中，本文所述的化合物降低细菌的细胞毒性和/或致病性。在一些实施方案中，本文所述的化合物抑制T3SS针的生物发生并且降低细菌毒力因子的分泌。在一些实施方案中，本文所述的化合物可以如所列出的或者作为其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶、互变异构体或前药进行递送。

本公开内容提供了丹参酮和丹参酮类似物化合物。丹参酮是在丹参(

在一些实施方案中，丹参酮或丹参酮类似物是丹参酮I：

在一些实施方案中，丹参酮或丹参酮类似物是二氢丹参酮1(dHTSN1)：

在一些实施方案中，丹参酮或丹参酮类似物是二氢丹参酮(dHTSN)：

本文所述的化合物和组合物可以用于治疗疾病的方法中。在一些实施方案中，本文所述的化合物和组合物可以用于治疗与3型分泌系统(T3SS)相关的疾病的方法中。在一些实施方案中，本文所述的化合物和组合物可以用于治疗细菌感染，包括由革兰氏阴性菌引起的感染和/或与革兰氏阴性菌相关的感染。本文所述的化合物和组合物还可以用于治疗如本文和下述段落中所述的病症。

在一个方面，提供了治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的方法。在一个方面，提供了降低受试者中的细菌毒力的方法。在另一个方面，提供了降低受试者中细菌的致病性和/或细胞毒性的方法。在一个方面，提供了降低或防止细菌的药物抗性发展的方法。在一些实施方案中，受试者是动物。在一些实施方案中，受试者是人。

在一个方面，提供了治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的3型分泌系统(T3SS)抑制剂。在另一个方面，提供了治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的药剂，所述药剂根据如本文所述的鉴定T3SS抑制剂的方法，鉴定为3型分泌系统(T3SS)抑制剂。在另一个方面，提供了抑制、治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的3型分泌系统(T3SS)抑制剂，其中所述T3SS抑制剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。在一个实施方案中，细菌感染是革兰氏阴性菌感染。

在一个实施方案中，T3SS抑制剂选自丹参酮、丹参酮类似物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。在一个实施方案中，丹参酮是丹参酮1(TSN1)。在一些实施方案中，丹参酮类似物是二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN)。

在一个示例性实施方案中，感染由细菌引起和/或与细菌相关。在一个示例性实施方案中，细菌是革兰氏阳性菌。在另一个示例性实施方案中，革兰氏阳性菌选自葡萄球菌属(

在一个示例性实施方案中，细菌是抗酸细菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是分枝杆菌属物种。在另一个示例性实施方案中，细菌是鸟分枝杆菌(

在另一个示例性实施方案中，细菌是假单胞菌属物种。在另一个示例性实施方案中，细菌是铜绿假单胞菌。在另一个示例性实施方案中，细菌选自铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德氏菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是鲍氏不动杆菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是嗜麦芽窄食单胞菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是洋葱伯克霍尔德氏菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是不动杆菌属物种。在另一个示例性实施方案中，细菌是无硝不动杆菌(

在另一个示例性实施方案中，细菌是肺炎链球菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是流感嗜血杆菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是金黄色葡萄球菌。在另一个示例性实施方案中，细菌是卡他莫拉菌(

在一个示例性实施方案中，细菌选自杆菌，包括芽孢杆菌属物种、棒状杆菌属物种(也为丙酸杆菌属)和梭菌属物种；丝状细菌，包括放线菌属物种和链霉菌属物种；杆菌，例如假单胞菌属物种、布鲁氏菌属物种、农杆菌属物种、博德特氏菌属物种、埃希氏菌属物种、志贺氏菌属物种、耶尔森氏菌属物种、沙门氏菌属物种、克雷伯氏菌属物种、肠杆菌属物种、嗜血杆菌属物种、巴斯德菌属物种和链杆菌属物种；螺旋体属物种、弯曲杆菌属物种、弧菌属物种；以及细胞内细菌，包括立克次体属(

在另一个方面，本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法。在一个示例性实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的化合物，从而治疗和/或预防疾病。在一个示例性实施方案中，本发明的化合物可以用于人或兽医学疗法中，特别是用于治疗或预防细菌相关疾病。在一个示例性实施方案中，化合物是本文描述的，或者其盐、前药、水合物或溶剂化物，或其组合。在一个示例性实施方案中，本发明提供了本文所述的化合物或其前药。在一个示例性实施方案中，本发明提供了本文所述的化合物或者其盐、水合物或溶剂化物。在一个示例性实施方案中，本发明提供了本文所述的化合物或其盐。在另一个示例性实施方案中，本发明的化合物是本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。在一个示例性实施方案中，化合物是本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。在一个示例性实施方案中，化合物根据本文所述的式或是其药学上可接受的盐。在一个示例性实施方案中，化合物是本文所述的组合的部分。在一个示例性实施方案中，化合物是本文所述的药物制剂的部分。在另一个示例性实施方案中，疾病是全身性疾病。在另一个示例性实施方案中，疾病是局部疾病。在一个示例性实施方案中，正在施用该化合物的受试者否则不需要用该化合物的治疗。

在一个示例性实施方案中，通过本发明的化合物的经口施用来治疗疾病。在一个示例性实施方案中，通过本发明的化合物的静脉内施用来治疗疾病。在一个示例性实施方案中，通过本发明的化合物和/或本发明的组合的皮下施用来治疗疾病。

在另一个方面，本发明提供了治疗全身性疾病的方法。该方法涉及使动物与本发明的化合物和/或本发明的组合接触。

在另一个示例性实施方案中，疾病与本文所述的细菌相关。在另一个示例性实施方案中，疾病与革兰氏阳性菌的感染相关。在一个示例性实施方案中，疾病与葡萄球菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自肺炎、胃肠炎、中毒性休克综合征、社区获得性肺炎(CAP)、脑膜炎、脓毒性关节炎、泌尿道感染、菌血症、心内膜炎、骨髓炎、皮肤和皮肤结构感染。在一个示例性实施方案中，疾病与链球菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自链球菌性咽喉炎、皮肤感染、坏死性筋膜炎、中毒性休克综合征、肺炎、中耳炎和鼻窦炎。在一个示例性实施方案中，疾病与放线菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是放线菌病。在一个示例性实施方案中，疾病与诺卡氏菌属(

在一个示例性实施方案中，疾病与分枝杆菌属物种相关。在一个示例性实施方案中，疾病与结核分枝杆菌相关。在一个示例性实施方案中，疾病与堪萨斯分枝杆菌相关。在一个示例性实施方案中，疾病与细胞内鸟分枝杆菌相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是麻风病。在另一个示例性实施方案中，疾病是结核病。在另一个示例性实施方案中，疾病是肺结核。在另一个示例性实施方案中，疾病是肺外结核病。在另一个示例性实施方案中，疾病与多药抗性结核病相关。在另一个示例性实施方案中，疾病与广泛药物抗性结核病相关。

在另一个示例性实施方案中，疾病与革兰氏阴性菌的感染相关。在一个示例性实施方案中，疾病与奈瑟球菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自脑膜炎、淋病、外耳炎和毛囊炎。在一个示例性实施方案中，疾病与埃希氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自腹泻、泌尿道感染、脑膜炎、脓毒症和HAP。在一个示例性实施方案中，疾病与志贺氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自腹泻、菌血症、心内膜炎、脑膜炎和胃肠炎。在一个示例性实施方案中，疾病与沙门氏菌物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自伤寒、脓毒症、胃肠炎、心内膜炎、鼻窦炎和脑膜炎。在一个示例性实施方案中，疾病与耶尔森氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自伤寒、腺鼠疫、肠热病和胃肠炎。在一个示例性实施方案中，疾病与克雷伯氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是脓毒症或泌尿道感染。在一个示例性实施方案中，疾病与变形杆菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是泌尿道感染。在一个示例性实施方案中，疾病与肠杆菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是医院获得性感染。在一个示例性实施方案中，疾病与沙雷氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自泌尿道感染、皮肤和皮肤结构感染以及肺炎。在一个示例性实施方案中，疾病与弧菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是霍乱或胃肠炎。在一个示例性实施方案中，疾病与弯曲杆菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是胃肠炎。在一个示例性实施方案中，疾病与螺杆菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是慢性胃炎。在一个示例性实施方案中，疾病与假单胞菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自肺炎、骨髓炎、烧伤感染、脓毒症、UTI、心内膜炎、耳炎和角膜感染。在一个示例性实施方案中，疾病与拟杆菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是牙周病或吸入性肺炎。在一个示例性实施方案中，疾病与嗜血杆菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病选自脑膜炎、会厌炎、脓毒性关节炎、脓毒症、软下疳和阴道炎。在一个示例性实施方案中，疾病与博德特氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是百日咳。在一个示例性实施方案中，疾病与军团菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是肺炎或庞蒂亚克热。在一个示例性实施方案中，疾病与弗朗西斯菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是兔热病。在一个示例性实施方案中，疾病与布鲁氏菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是布鲁氏菌病。在一个示例性实施方案中，疾病与巴斯德菌属物种相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是皮肤感染。在一个示例性实施方案中，疾病与加德纳菌属(

在一个示例性实施方案中，疾病与肺炎支原体相关。在另一个示例性实施方案中，疾病是气管支气管炎或游走性肺炎。在一个示例性实施方案中，疾病与解脲脲原体(

在一个示例性实施方案中，疾病是慢性阻塞性肺疾病急性加重。在一个示例性实施方案中，疾病是慢性阻塞性肺疾病。在一个示例性实施方案中，疾病是咽炎。在一个示例性实施方案中，疾病是扁桃体炎。在一个示例性实施方案中，疾病是慢性支气管炎急性加重(AECB)。在一个示例性实施方案中，疾病是宫颈炎。在一个示例性实施方案中，疾病是生殖器溃疡性疾病。

在一个示例性实施方案中，疾病是革兰氏阴性菌感染。在一个示例性实施方案中，革兰氏阴性菌是假单胞菌属。在一个示例性实施方案中，革兰氏阴性菌是铜绿假单胞菌。

在一个示例性实施方案中，革兰氏阴性菌感染是肺炎。在一个示例性实施方案中，革兰氏阴性菌感染是急性肺炎。

在一个示例性实施方案中，对于本文所述的任何方法，受试者是动物。在一个示例性实施方案中，动物选自人、牛、鹿、驯鹿、山羊、蜜蜂、猪、绵羊、马、母牛、公牛、犬、豚鼠、沙鼠、兔、猫、骆驼、牦牛、大象、鸵鸟、水獭、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡、鸽子、天鹅和火鸡。在另一个示例性实施方案中，对于本文所述的任何方法，动物选自人、牛、山羊、猪、绵羊、马、母牛、公牛、犬、豚鼠、沙鼠、兔、猫、鸡和火鸡。在另一个示例性实施方案中，对于本文所述的任何方法，受试者或动物是人。在一个示例性实施方案中，对于本文所述的任何方法，可以使用本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、和/或本文所述的药物制剂。在一些实施方案中，化合物是丹参酮或丹参酮类似物。在一些实施方案中，化合物是通过如本文所述的筛选方法鉴定的化合物。

可以使用本领域已知的各种动物模型来测试本文所述的方法、化合物和化合物的组合，在治疗、预防和/或管理所指示的疾病或病症中的功效。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗本文所述的疾病和状况的药物组合物。

在一个方面，提供了用于治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的药物组合物，该组合物包含3型分泌系统(T3SS)的抑制剂。在一些实施方案中，T3SS抑制剂是丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN)。

在一个方面，提供了用于治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的药物组合物，该组合物包含3型分泌系统(T3SS)抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述T3SS抑制剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。在另一个方面，提供了用于治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的药物组合物，该组合物包含药剂和药学上可接受的载体，所述药剂根据本文所述的鉴定T3SS抑制剂的方法，鉴定为3型分泌系统(T3SS)抑制剂。在一些实施方案中，细菌感染是革兰氏阴性菌感染。

在另外一个方面，用于治疗有此需要的受试者的革兰氏阴性菌感染的药物组合物，该组合物包含选自以下的3型分泌系统(T3SS)抑制剂和药学上可接受的载体：丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)、二氢丹参酮(dHTSN)及其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。

药物组合物通常配制为提供作为活性成分的治疗有效量的如本文所述的化合物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。通常，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体(包括惰性固体稀释剂和填料)、稀释剂(包括无菌水溶液和各种有机溶剂)、渗透促进剂、增溶剂和佐剂。

上述药物组合物优选用于治疗细菌感染。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的本文所述的化合物(例如，丹参酮或丹参酮类似物化合物)或其药学上可接受的盐的浓度小于例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐的浓度独立地大于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25% 19%、18.75%、18.50%、18.25% 18%、17.75%、17.50%、17.25% 17%、16.75%、16.50%、16.25% 16%、15.75%、15.50%、15.25% 15%、14.75%、14.50%、14.25% 14%、13.75%、13.50%、13.25% 13%、12.75%、12.50%、12.25% 12%、11.75%、11.50%、11.25% 11%、10.75%、10.50%、10.25% 10%、9.75%、9.50%、9.25% 9%、8.75%、8.50%、8.25% 8%、7.75%、7.50%、7.25% 7%、6.75%、6.50%、6.25% 6%、5.75%、5.50%、5.25% 5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐的浓度在以下范围内：约0.0001%至约50%、约0.001%至约40%、约0.01%至约30%、约0.02%至约29%、约0.03%至约28%、约0.04%至约27%、约0.05%至约26%、约0.06%至约25%、约0.07%至约24%、约0.08%至约23%、约0.09%至约22%、约0.1%至约21%、约0.2%至约20%、约0.3%至约19%、约0.4%至约18%、约0.5%至约17%、约0.6%至约16%、约0.7%至约15%、约0.8%至约14%、约0.9%至约12%或约1%至约10% w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐的浓度在以下范围内：约0.001%至约10%、约0.01%至约5%、约0.02%至约4.5%、约0.03%至约4%、约0.04%至约3.5%、约0.05%至约3%、约0.06%至约2.5%、约0.07%至约2%、约0.08%至约1.5%、约0.09%至约1%、约0.1%至约0.9% w/w、w/v或v/v的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的本文所述的化合物(例如，T3SS抑制剂，包括丹参酮和丹参酮类似物)或其药学上可接受的盐的量等于或小于10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的本文所述的化合物(例如，T3SS抑制剂，包括丹参酮和丹参酮类似物)或其药学上可接受的盐的量多于0.0001 g、0.0002g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5 g、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。

根据本发明提供的每种化合物在宽剂量范围内有效。例如，在成人的治疗中，独立地范围为0.01至1000 mg、0.5至100 mg、1至50 mg/天、以及5至40 mg/天的剂量是可以使用的剂量的实例。确切剂量取决于施用途径、化合物在其中施用的形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重、以及主治医生的偏好和经验。

下文描述的是非限制性的药物组合物及其制备方法。

在优选实施方案中，本发明提供了用于经口施用的药物组合物，其含有：本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，以及适合于施用的药物赋形剂。

在优选实施方案中，本发明提供了用于经口施用的固体药物组合物，其含有：(i)有效量的：丹参酮或丹参酮类似物、或其药学上可接受的盐，以及(ii)适合于施用的药物赋形剂。在一些实施方案中，组合物进一步含有(iii)有效量的另外的活性药物成分。例如，如本文使用的，另外的活性药物成分可以包括杀死细菌的一种或多种化合物。

在一些实施方案中，药物组合物可以是适合于经口消耗的液体药物组合物。

适合于经口施用的本发明的药物组合物可以呈现为离散剂型，例如胶囊、囊剂或片剂，或者各自含有预定量的作为粉末或呈颗粒的活性成分的液体或气溶胶喷雾，或在水性或非水性液体中的悬浮液，水包油型乳剂，油包水型液体乳剂，用于重构的粉末，用于经口消耗的粉末，瓶(包括瓶中的粉末或液体)，经口溶解的薄膜，锭剂，糊剂，管，胶质和包装。此类剂型可以通过任何药学方法来制备，但所有方法都包括使活性成分与构成一种或多种必要成分的载体结合的步骤。一般而言，通过将活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后，需要时，使产品成形为所需的外观，来制备组合物。例如，片剂可以通过压制或模制来制备，任选地与一种或多种辅助成分一起。压缩片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式(例如粉末或颗粒)的活性成分来制备，所述活性成分任选地与赋形剂(例如但不限于粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂或分散剂)混合。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。

本发明进一步涵盖无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些化合物的降解。例如，在制药领域中可以添加水(例如5%)作为模拟长期贮存的手段，以便确定特性如贮存期限或制剂随着时间过去的稳定性。本发明的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低水分含量的成分和低水分或低湿度条件来制备。如果预计在制造、包装和/或贮存期间与水分和/或湿气的大量接触，则可以将含有乳糖的本发明的药物组合物和剂型制备为无水的。可以制备且贮存无水药物组合物，使得维持其无水性质。相应地，无水组合物可以使用已知防止暴露于水的材料进行包装，使得它们可以包括在合适的配方药剂盒中。合适包装的实例包括但不限于气密密封的箔、塑料等等、单位剂量容器、泡罩包装和条状包装。

活性药物成分可以根据常规药物配混技术与药物载体在紧密混合物中组合。载体可以采取广泛多样的形式，取决于施用所需的制剂形式。在制备用于经口剂型的组合物中，任何常用的药物介质都可以用作载体，例如在经口液体制剂(如悬浮液、溶液和酏剂)或气雾剂的情况下的水、二醇、油、醇、调味药剂、防腐剂、着色剂等等；或在经口固体制剂的情况下，可以使用载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂，在一些实施方案中，无需采用乳糖的使用。例如，对于固体经口制剂，合适的载体包括粉末、胶囊和片剂。需要时，片剂可以通过标准的水性或非水性技术进行包被。

适用于药物组合物和剂型中的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉、明胶、天然和合成树胶例如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、其它海藻酸盐、黄蓍胶粉、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、乙酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素及其混合物。

用于本文公开的药物组合物和剂型中的合适填料的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、右旋糖酐(dextrate)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉及其混合物。

崩解剂可以用于本发明的组合物中，以提供当暴露于水性环境时崩解的片剂。太多的崩解剂可能产生在瓶中崩解的片剂。太少可能不足以使崩解发生，因此改变活性成分从剂型中释放的速率和程度。因此，可以使用既不会太少也不会太多而有害地改变活性成分的释放的足够量的崩解剂，以形成本文公开的化合物的剂型。使用的崩解剂量可以基于制剂的类型和施用模式而变，并且本领域普通技术人员可以容易地辨别。可以在药物组合物中使用约0.5至约15重量%的崩解剂、或约1至约5重量%的崩解剂。可以用于形成本发明的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂-琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其它淀粉、预胶化淀粉、其它淀粉、粘土、其它藻类、其它纤维素、树胶或其混合物。

可以用于形成本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酰富马酸钠、矿物油、轻质矿物油、丙三醇、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯(ethylaureate)、琼脂或其混合物。另外的润滑剂包括例如syloid硅胶、合成二氧化硅的凝结气溶胶、硅化的微晶纤维素或其混合物。润滑剂可以任选地以药物组合物的小于约0.5%或小于约1%(按重量计)的量添加。

当需要水性悬浮液和/或酏剂用于经口施用时，活性药物成分可以与各种甜味剂或调味药剂、色料或染料，以及如果需要的话，乳化剂和/或悬浮剂组合，连同水、乙醇、丙二醇、丙三醇及其各种组合等的稀释剂一起。

可以通过已知技术对片剂进行非包被或包被，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供经过更长时期的持续作用。例如，可以采用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于经口使用的制剂也可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

可以用于形成本发明的药物组合物和剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。即，可以采用亲水性表面活性剂的混合物，可以采用亲脂性表面活性剂的混合物，或者可以采用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活性剂的混合物。

合适的亲水性表面活性剂一般可以具有至少10的HLB值，而合适的亲脂性表面活性剂一般可以具有或小于约10的HLB值。用于表征非离子型两亲化合物的相对亲水性和疏水性的经验参数是亲水亲油平衡值(“HLB”值)。具有较低HLB值的表面活性剂是更亲脂性或疏水性的，并且具有在油中更大的溶解度，而具有较高HLB值的表面活性剂是更亲水性的，并且具有在水溶液中更大的溶解度。亲水性表面活性剂一般被视为HLB值大于约10的那些化合物，以及HLB标度对于其一般不适用的阴离子、阳离子或两性离子化合物。类似地，亲脂性(即疏水性)表面活性剂是HLB值等于或小于约10的化合物。然而，表面活性剂的HLB值仅是一般用于使得能够配制工业、药物和化妆品乳剂的粗略指导。

亲水性表面活性剂可以是离子型的或非离子型的。合适的离子型表面活性剂包括但不限于烷基铵盐；夫西地酸盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单和双甘油酯的单和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化单和双甘油酯；单和双甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

在上述组内，离子型表面活性剂包括例如：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单和双甘油酯的单和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化单和双甘油酯；单和双甘油酯的柠檬酸酯；及其混合物。

离子型表面活性剂可以是离子化形式的卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸乳酰脂、硬脂酰-2-乳酸酯、硬脂酰乳酸酯、琥珀酸单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、胆酸肌氨酸、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、油酸酯、蓖麻油酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、硬脂酸酯、硫酸月桂基酯、硫酸萜烯基酯、多库酯、月桂酰肉碱、棕榈酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱及其盐和混合物。

亲水性非离子型表面活性剂可以包括但不限于烷基葡糖苷；烷基麦芽糖苷；烷基硫代葡糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚，例如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚，例如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯，例如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和固醇组成的组的至少一个成员的亲水性酯交换反应产物；聚氧乙烯固醇、其衍生物和类似物；聚氧乙烯化维生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，以及多元醇与由甘油三酯、植物油和氢化植物油组成的组的至少一个成员的亲水性酯交换反应产物。多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、丙二醇、季戊四醇或糖。

其它亲水性非离子型表面活性剂包括但不限于PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25三油酸甘油酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20月桂酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-20硬脂酸甘油酯、PEG-20油酸甘油酯、PEG-30油酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-40月桂酸甘油酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸/辛酸甘油酯、PEG-8癸酸/辛酸甘油酯、聚甘油-10月桂酸酯、PEG-30胆固醇、PEG-25植物固醇、PEG-30大豆固醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40脱水山梨糖醇油酸酯、PEG-80脱水山梨糖醇月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂基醚、生育酚基PEG-100琥珀酸酯、PEG-24胆固醇、聚甘油-10油酸酯、Tween 40、Tween60、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、PEG 10-100壬基酚系列、PEG 15-100辛基酚系列和泊洛沙姆。

仅作为示例，合适的亲脂性表面活性剂包括：脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；脱水山梨糖醇脂肪酸酯；聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯；固醇和固醇衍生物；聚氧乙烯化固醇和固醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单和双甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和固醇组成的组的至少一个成员的疏水性酯交换反应产物；油溶性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在这个组内，优选的亲脂性表面活性剂包括甘油脂肪酸酯，丙二醇脂肪酸酯及其混合物，或者是多元醇与由植物油、氢化植物油和甘油三酯组成的组的至少一个成员的疏水性酯交换反应产物。

在一个实施方案中，组合物可以包括增溶剂，以确保本发明的化合物的良好增溶和/或溶解，并且使本发明的化合物的沉淀降到最低。对于非经口使用的组合物，例如用于注射的组合物，这可以是尤其重要的。也可以添加增溶剂，以增加亲水性药物和/或其它组分例如表面活性剂的溶解度，或者将组合物维持为稳定或同质的溶液或分散体。

合适增溶剂的实例包括但不限于下述：醇和多元醇，例如乙醇、异丙醇、丁醇、苄醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨糖醇、甘露醇、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、二甲基异山梨醇酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素和其它纤维素衍生物、环糊精和环糊精衍生物；平均分子量为约200至约6000的聚乙二醇醚，例如四氢糠醇PEG醚(四乙二醇醚(glycofurol))或甲氧基PEG；酰胺和其它含氮化合物，例如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、ε-己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮；酯例如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰基柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三醋精、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、ε-己内酯及其异构体、δ-戊内酯及其异构体、β-丁内酯及其异构体；以及本领域已知的其它增溶剂，例如二甲基乙酰胺、二甲基异山梨醇酯、N-甲基吡咯烷酮、单辛精、二甘醇单乙醚和水。

也可以使用增溶剂的混合物。实例包括但不限于三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、四乙二醇醚、二乙二醇单乙基醚、丙二醇和二甲基异山梨醇酯。特别优选的增溶剂包括山梨糖醇、甘油、三醋精、乙醇、PEG-400、四乙二醇醚和丙二醇。

可以包括的增溶剂的量并无特别限制。给定增溶剂的量可以限于生物可接受的量，其可以由本领域技术人员容易地确定。在一些情况下，包括远远超出生物可接受量的增溶剂可能是有利的，例如以使药物的浓度达到最大，其中使用常规技术(例如蒸馏或蒸发)在将组合物提供给患者之前去除过量的增溶剂。因此，如果存在的话，基于药物和其它赋形剂的组合重量，增溶剂可以以按重量计10%、25%、50%、100%或至多约200%的重量比。需要时，也可以使用非常少量的增溶剂，例如5%、2%、1%或甚至更少。通常，增溶剂可以以按重量计约1%至约100%，更通常约5%至约25%的量存在。

组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的添加剂和赋形剂。此类添加剂和赋形剂包括但不限于防粘剂、消泡剂、缓冲剂、聚合物、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度调节剂、张力剂、调味剂、色素、除臭剂、遮光剂、悬浮剂、粘合剂、填料、增塑剂、润滑剂及其混合物。

另外，可以将酸或碱掺入组合物内，以促进加工，增强稳定性或用于其它原因。药学上可接受的碱的实例包括氨基酸、氨基酸酯、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁、硅酸铝镁、合成硅酸铝、合成方解石、氢氧化铝镁、二异丙基乙胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三异丙醇胺、三甲胺、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等等。还合适的是其为药学上可接受的酸的盐的碱，所述酸例如乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、链烷磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、氢喹磺酸(hydroquinosulfonic acid)、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、单宁酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等等。还可以使用多元酸的盐，例如磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。当碱是盐时，阳离子可以是任何方便和药学上可接受的阳离子，例如铵、碱金属和碱土金属。实例可以包括但不限于钠、钾、锂、镁、钙和铵。

合适的酸是药学上可接受的有机酸或无机酸。合适无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸等等。合适有机酸的实例包括乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、链烷磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、氢喹磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、单宁酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸和尿酸。

在优选实施方案中，本发明提供了用于注射的药物组合物，其含有：本文所述的丹参酮或丹参酮类似物、或者其药学上可接受的盐，以及适合于注射的药物赋形剂。组合物中化合物的组分和量如本文所述。

本发明的组合物可以掺入其中用于通过注射施用的形式包括水性或油悬浮液或乳剂，其具有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露醇、右旋糖或无菌水溶液，以及类似的药物媒介物。

盐水中的水溶液也照常规用于注射。还可以采用乙醇、甘油、丙二醇和液体聚乙二醇(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。适当流动性可以通过以下得到维持：例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒子大小和通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。

无菌可注射溶液通过以下进行制备：将所需量的本文所述的丹参酮或丹参酮类似物或者其药学上可接受的盐，连同如上文列举的各种其它成分一起掺入适当的溶剂中，需要时，随后为过滤灭菌。一般地，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物内来制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和来自上文列举那些的所需其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，某些期望的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前的无菌过滤溶液产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。

在优选实施方案中，本发明提供了用于经皮递送的药物组合物，其含有：本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，以及适合于经皮递送的药物赋形剂。

本发明的组合物可以配制成适合于局部性或局部施用的以固体、半固体或液体形式的制剂，例如凝胶、水溶性胶冻剂、乳膏、洗剂、悬浮液、泡沫、粉末、粉末、浆料、软膏、溶液、油、糊剂、栓剂、喷雾剂、乳剂、盐溶液、基于二甲基亚砜(DMSO)的溶液。一般而言，具有较高密度的载体能够提供延长暴露于活性成分的区域。相比之下，溶液制剂可以提供活性成分对所选区域的更直接暴露。

药物组合物还可以包含合适的固相或凝胶相载体或赋形剂，其是允许治疗分子穿过皮肤的角质层渗透性屏障的增加渗透或帮助其递送的化合物。存在对于局部制剂领域的技术人员已知的许多此类渗透增强分子。此类载体和赋形剂的实例包括但不限于保湿剂(例如尿素)、二醇(例如丙二醇)、醇(例如乙醇)、脂肪酸(例如油酸)、表面活性剂(例如异丙基肉豆蔻酸酯和十二烷基硫酸钠)、吡咯烷酮、单月桂酸甘油酯、亚砜、萜烯(例如薄荷醇)、胺、酰胺、烷烃、烷醇、水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。

用于本发明的方法中的另一种示例性制剂采用经皮递送装置(“贴剂”)。此类经皮贴剂可以用于提供以控制量的以下的连续或不连续输注：本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，或连同或不连同另一种活性药物成分。

用于递送药物药剂的经皮贴剂的构建和用途是本领域众所周知的。参见例如，美国专利号5,023,252；4,992,445；和5,001,139。此类贴剂可以构造成用于药物药剂的连续、搏动或按需递送。

用于吸入或吹入的组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。优选地，组合物通过经口或鼻呼吸途径施用用于局部或全身效应。可以通过使用惰性气体雾化在优选地药学上可接受的溶剂中的组合物。雾化的溶液可以直接从雾化装置中吸入，或者雾化装置可以附着到面罩内裹(tent)或间歇性正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以优选地从装置经口或经鼻施用，所述装置以适当的方式递送制剂。干粉吸入器也可以用于提供组合物的吸入递送。

药物组合物也可以由本文所述的组合物和适合于舌下、颊、直肠、骨内、眼内、鼻内、硬膜外或椎管内施用的一种或多种药学上可接受的赋形剂制备。用于此类药物组合物的制备是本领域众所周知的。参见例如，Anderson等人，编辑，Handbook of Clinical DrugData，第十版，McGraw-Hill，2002；以及Pratt和Taylor，编辑，Principles of DrugAction，第三版，Churchill Livingston，N.Y.，1990，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。

以下的施用可以通过使化合物能够递送至作用部位的任何方法来完成：本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐、或这些化合物的药物组合物。这些方法包括经口途径、十二指肠内途径、肠胃外注射(包括静脉内、动脉内、皮下、肌内、血管内、腹膜内或输注)、局部(例如经皮施加)、直肠施用、经由通过导管或支架的局部性递送或通过吸入。本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，也可以脂肪内或鞘内施用。

本发明的组合物还可以经由浸渍或涂布的装置例如支架、或插入动脉的圆柱形聚合物进行递送。例如，此类施用方法可以帮助预防或改善在手术如球囊血管成形术之后的再狭窄。不受理论的束缚，本发明的化合物可以减缓或抑制促成再狭窄的动脉壁中的平滑肌细胞迁移和增殖。本发明的化合物可以例如通过来自支架的支柱、支架移植物、移植物、或者支架的覆盖物或护套的局部递送进行施用。在一些实施方案中，本发明的化合物与基质掺和。此类基质可以是聚合物基质，并且可以作用于将化合物结合到支架上。适合于此类用途的聚合物基质包括例如，基于内酯的聚酯或共聚酯，例如聚丙交酯、聚己内酯乙交酯、聚原酸酯、聚酐、聚氨基酸、多糖、聚磷腈、聚(醚-酯)共聚物(例如，PEO-PLLA)；聚二甲基硅氧烷、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)、基于丙烯酸酯的聚合物或共聚物(例如，聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯吡咯烷酮)、氟化聚合物例如聚四氟乙烯和纤维素酯。合适的基质可以是非降解的或可以随着时间降解，释放一种或多种化合物。本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，可以通过各种方法例如浸涂/旋涂、喷涂、浸涂和/或刷涂，而施加于支架的表面。可以将化合物施加于溶剂中并且可以允许溶剂蒸发，因此在支架上形成化合物层。可替代地，化合物可以位于支架或移植物的主体，例如微通道或微孔中。当植入时，化合物扩散出支架的主体，以接触动脉壁。此类支架可以通过以下进行制备：将制造为含有此类微孔或微通道的支架浸入本发明的化合物在合适溶剂中的溶液内，随后为溶剂的蒸发。在支架的表面上的过量药物可以经由另外的短暂溶剂清洗而去除。在又其它实施方案中，本发明的化合物可以共价连接至支架或移植物。可以使用这样的共价接头，其在体内降解，导致本发明的化合物的释放。任何生物不稳定键合都可以用于此类目的，例如酯、酰胺或酸酐键合。本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，可以另外从在血管成形术期间使用的球囊血管内施用。还可以执行本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)或二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，经由本发明的制剂的心包或外膜(advential)施加的血管外施用，以减少再狭窄。

示例性的肠胃外施用形式包括化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，在无菌水溶液例如丙二醇或右旋糖水溶液中的溶液或悬浮液。需要时，此类剂型可以是适当地缓冲的。

本发明还提供了试剂盒。试剂盒包括在合适的包装中的本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，以及书面材料，其可以包括使用说明书、临床研究的讨论和副作用列表。此类试剂盒还可以包括信息，例如科学文献参考、包装插页材料、临床试验结果和/或这些的概括等等，其指示或确定组合物的活性和/或优点，和/或描述给药、施用、副作用、药物相互作用或对医疗保健提供者有用的其它信息。此类信息可以基于各种研究的结果，例如，使用涉及体内模型的实验动物的研究和基于人临床试验的研究。试剂盒可以进一步含有另一种活性药物成分。在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，以及另一种活性药物成分，作为分开的组合物在试剂盒内的分开容器中提供。在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，以及药剂作为单一组合物在试剂盒中的容器内提供。合适的包装和另外的使用物品(例如，用于液体制剂的量杯、使对空气的暴露降到最低的箔包装等等)是本领域已知的，并且可以包括在试剂盒中。可以向健康提供者包括医生、护士、药剂师、处方官员等等提供、销售和/或推广本文所述的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒也可以直接销售给消费者。

上述试剂盒优选用于治疗本文所述的疾病和状况。在一个优选实施方案中，试剂盒用于治疗细菌感染。

在一个特定实施方案中，本文所述的试剂盒用于治疗细菌感染。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒用于治疗由革兰氏阴性菌引起的细菌感染和/或与革兰氏阴性菌相关的细菌感染。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒用于治疗选自以下的细菌感染：肺感染、皮肤感染、软组织感染、胃肠道感染、泌尿道感染、脑膜炎或脓毒症。在一些实施方案中，细菌感染是肺炎。在一些实施方案中，细菌感染是急性肺炎。

所施用的以下的量取决于待治疗的人或哺乳动物、病症或状况的严重性、施用速率、化合物的处置和开处方医生的判断：本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐。然而，各自的有效剂量以单一剂量或分份剂量在约0.001至约100 mg/kg体重/天，例如约1至约35 mg/kg/天的范围内。对于70 kg的人，这达到约0.05至7 g/天，例如约0.05至约2.5 g/天。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是绰绰有余的，而在其它情况下，可以采用更大的剂量而不引起任何有害副作用 - 例如，通过将此类较大的剂量分成几个小剂量用于全天的施用。本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐的剂量，可以以mg/kg体重或mg/m

在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐以多重剂量进行施用。在一个优选实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐以多重剂量进行施用。给药可以是每天一次、两次、三次、四次、五次、六次或多于六次。给药可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。在其它实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，每天施用约一次至每天施用约6次。在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐每天一次施用，而在其它实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐每天施用两次，并且在其它实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐每天施用三次。

本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐的施用只要有必要就可以继续。在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐施用多于1、2、3、4、5、6、7、14或28天。在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐施用少于28、14、7、6、5、4、3、2或1天。在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐，在现有基础上长期施用 - 例如用于治疗慢性效应。在另一个实施方案中，继续施用本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐的施用持续少于约7天。在又一个实施方案中，施用持续多于约6、10、14、28天，两个月，六个月或一年。在一些情况下，持续施用只要有必要就实现并且维持。

在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐的有效剂量在以下范围内：约1 mg至约500 mg、约10 mg至约300 mg、约20 mg至约250 mg、约25 mg至约200 mg、约10 mg至约200 mg、约20 mg至约150 mg、约30 mg至约120mg、约10 mg至约90 mg、约20 mg至约80 mg、约30 mg至约70 mg、约40 mg至约60 mg、约45mg至约55 mg、约48 mg至约52 mg、约50 mg至约150 mg、约60 mg至约140 mg、约70 mg至约130 mg、约80 mg至约120 mg、约90 mg至约110 mg、约95 mg至约105 mg、约150 mg至约250mg、约160 mg至约240 mg、约170 mg至约230 mg、约180 mg至约220 mg、约190 mg至约210mg、约195 mg至约205 mg、或约198至约202 mg。

在一些实施方案中，本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐的有效剂量在以下范围内：约0.01 mg/kg至约4.3 mg/kg、约0.15 mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3 mg/kg至约3.2 mg/kg、约0.35 mg/kg至约2.85 mg/kg、约0.15 mg/kg至约2.85 mg/kg、约0.3 mg至约2.15 mg/kg、约0.45 mg/kg至约1.7 mg/kg、约0.15 mg/kg至约1.3 mg/kg、约0.3 mg/kg至约1.15 mg/kg、约0.45 mg/kg至约1 mg/kg、约0.55 mg/kg至约0.85 mg/kg、约0.65 mg/kg至约0.8 mg/kg、约0.7 mg/kg至约0.75 mg/kg、约0.7 mg/kg至约2.15 mg/kg、约0.85 mg/kg至约2 mg/kg、约1 mg/kg至约1.85 mg/kg、约1.15 mg/kg至约1.7 mg/kg、约1.3 mg/kg mg至约1.6 mg/kg、约1.35 mg/kg至约1.5 mg/kg、约2.15 mg/kg至约3.6 mg/kg、约2.3 mg/kg至约3.4 mg/kg、约2.4 mg/kg至约3.3 mg/kg、约2.6 mg/kg至约3.15 mg/kg、约2.7 mg/kg至约3 mg/kg、约2.8 mg/kg至约3 mg/kg、或约2.85 mg/kg至约2.95 mg/kg。

在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能是绰绰有余的，而在其它情况下，可以采用更大的剂量而不引起任何有害副作用 - 例如，通过将此类较大的剂量分成几个小剂量用于全天的施用。

本文所述的化合物(例如T3SS抑制剂，例如丹参酮和丹参酮类似物，包括丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)和二氢丹参酮(dHTSN))、或其药学上可接受的盐的有效量，可以通过具有类似效用的药剂的任何可接受的施用模式，以单个剂量或多重剂量进行施用，所述施用模式包括直肠、颊、鼻内和经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、经口、局部或作为吸入剂。

在一个方面，提供的是抑制、治疗或预防有此需要的受试者的细菌感染的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的3型分泌系统(T3SS)抑制剂，其中所述T3SS抑制剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。

在另一个方面，提供了抑制3型分泌系统(T3SS)的方法，该方法包括使T3SS针蛋白或T3SS伴侣蛋白与药剂接触，所述药剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。在另一个方面，提供了抑制3型分泌系统(T3SS)针的生物发生的方法，该方法包括使T3SS针蛋白或T3SS伴侣蛋白与药剂接触，所述药剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。

在另一个方面，提供了降低细菌毒力、细胞毒性和/或致病性的方法，该方法包括使T3SS针蛋白或T3SS伴侣蛋白与药剂接触，所述药剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。在另一个方面，提供了降低细菌毒力因子分泌的方法，该方法包括使T3SS针蛋白或T3SS伴侣蛋白与药剂接触，所述药剂阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用。在一些实施方案中，对T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用的阻断抑制了T3SS针蛋白的组装或生物发生。

在一些实施方案中，T3SS针蛋白是PscF并且T3SS伴侣蛋白是PscE-PscG。在一些实施方案中，阻断相互作用的药剂与T3SS伴侣蛋白竞争结合T3SS针蛋白，或与T3SS针蛋白竞争结合T3SS伴侣蛋白。在一些实施方案中，药剂以小于5 μM、小于4 μM、小于3 μM、小于2 μM或小于1 μM的IC50竞争结合。在一些实施方案中，药剂以0.1 μM至5 μM、0.3 μM至5 μM、0.5μM至3 μM、0.5 μM至2 μM、0.5 μM至1 μM、0.1 μM至3 μM、0.1 μM至1 μM、0.3 μM至3 μM、0.3μM至2 μM的IC50竞争结合。在一些实施方案中，药剂以约0.1 μM、约0.2 μM、约0.3 μM、约0.4 μM、约0.5 μM、约0.6 μM、约0.7 μM、约0.8 μM、约0.9 μM、约1 μM、约1.5 μM、约2 μM、约2.5 μM、约3 μM、约3.5 μM、约4 μM、约4.5 μM或约5 μM的IC50竞争结合。

在一些实施方案中，药剂结合PscG的PscF结合口袋。在一些实施方案中，药剂结合PscG上选自Trp79、Trp 67、Trp73和Trp31的一个或多个残基。在一些实施方案中，药剂结合PscG上的残基Trp79。

在一些实施方案中，阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用的药剂是丹参酮或丹参酮类似物，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。在一些实施方案中，阻断T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白之间的相互作用的药剂是丹参酮1(TSN1)、二氢丹参酮1(dHTSN1)、二氢丹参酮(dHTSN)，或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、共晶或前药。

如本文所述，基于荧光偏振的筛选将丹参酮鉴定为铜绿假单胞菌的3型分泌系统针的生物发生的抑制剂，其具有有力的抗菌活性。

在一个方面，提供鉴定3型分泌系统(T3SS)抑制剂的方法，该方法包括：(a)将候选药剂加入包含T3SS中的蛋白质复合物的组合物中，其中所述蛋白质复合物的组分是荧光标记的；(b)确定荧光标记组分的荧光偏振(FP)；其中如果FP相对于参考FP水平是减少的，则候选药剂被鉴定为T3SS抑制剂。在一些实施方案中，蛋白质复合物包含T3SS针蛋白和T3SS伴侣蛋白。在一些实施方案中，蛋白质复合物是PscF-PscE-PscG。在一些实施方案中，该方法是高通量的。

在一些实施方案中，PscF用荧光标记进行标记。荧光标记可以是本领域已知的任何标记，例如荧光染料，例如荧光素、罗丹明或BODIPY。

在一些实施方案中，PscF是截短的。在一些实施方案中，标记的PscF包含氨基酸序列TVTRALRDLMQGILQKI(SEQ ID NO: 1)。

在一些实施方案中，参考FP水平是不存在加入组合物中的候选药剂情况下的荧光标记组分的FP。在一些实施方案中，组合物是溶液。候选药剂可以是小分子化合物。在一些实施方案中，候选药剂是丹参酮或丹参酮类似物。

实施例

现在参考下述实施例描述本文所涵盖的实施方案。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文所涵盖的公开内容决不应解释为限于这些实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变体。

实施例1：用于T3SS针生物发生的抑制剂的筛选设计

在铜绿假单胞菌T3SS(图1A)中，针由具有85个氨基酸残基的称为PscF的单一蛋白质的多重拷贝形成。在其分泌用于针组装之前，PscF在异三聚体复合物中，受到两种伴侣蛋白PscE(67 AA)和PscG(115 AA)保护。由PscE稳定的PscG呈现大的凹入疏水表面，用于与PscF的非极性残基的相互作用(图1B)；缺乏PscE或PscG或两者的铜绿假单胞菌突变体未能分泌PscF用于T3SS针的组装，并且因而是非细胞毒性的。因此，阻断PscF与PscE-PscG二聚体的相互作用的抑制剂，预计诱导细菌胞质溶胶中PscF的过早聚集和降解，削弱铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生。由于铜绿假单胞菌的存活不依赖于T3SS，因此此类抑制剂不太可能诱导抗生素抗性，因此理想地适合作为新类别的治疗剂开发，以治疗多药抗性铜绿假单胞菌感染。为了促进其发现，设计并验证了基于荧光偏振(FP)的高通量筛选(HTS)系统，并且在概念验证研究中取得了令人惊讶的发现。

实施例2：PscE、PscF和PscG的化学合成和表征

Quinaud等人报告了由重组蛋白形成的PscE-PscF-PscG三聚体复合物的第一个晶体结构。为了复制他们的发现，使用固相肽合成加上天然化学连接，来化学合成PscE、PscG和PscF

实施例3：基于FP的HTS读出的设计和验证

FP测定已在HTS中广泛用于低分子量抑制剂，在靶蛋白的小的、荧光标记的天然底物或配体存在下，所述抑制剂靶向蛋白质例如酶和受体。对于附着至快速旋转的小分子的染料，FP较低，因为该分子在溶液中快速翻滚(相对于荧光寿命)，并且有效地“扰乱”发射光的偏振。然而，在由大分子结合后，染料复合物的翻滚减慢，导致荧光发射的偏振增加。我们的FP测定的策略在图3A中示出，其中将文库化合物加入高偏振异三聚体复合物中，导致荧光标记的PscF从PscE-PscG异二聚体中置换，导致FP减少。由于PscF

实施例4：丹参酮作为PscF与PscE-PscG结合的竞争性抑制剂的鉴定

借助这种验证的FP测定，筛选超低通量的传统中药中的十种天然草药化合物：甘草酸铵、黄芪甲苷、黄芩素、仙茅苷、人参皂苷Rb1和Re、蛇床子素、人参二醇、槲皮素和丹参酮1(TSN1)(图15)。具有各种抗感染、抗炎或抗肿瘤性质，但没有针对细菌分泌系统的已知活性的这些化合物得自合作者的实验室，并且最初预期作为用于概念验证研究的“阴性对照”。令我们完全惊讶的是，初级筛选和次级筛选两者均将TSN1鉴定为阳性命中，所述TSN1在FP测定中与

实施例5：丹参酮与PscE-PscG的相互作用的结构表征

对于结构验证，包含合成PscE和

观察到Trp残基的侧链酰胺共振峰的显著变化(插图，图4A)。PscG中存在四个Trp残基，其中三个Trp 67、Trp73和Trp79位于涉及PscF相互作用的同一螺旋上(图4B)。

实施例6：丹参酮在体外阻断T3SS效应物ExoS的分泌

铜绿假单胞菌针对宿主免疫细胞和上皮细胞的细胞毒性取决于其T3SS，四种外毒素(效应蛋白)通过所述T3SS释放到宿主细胞质内：ExoS、ExoT、ExoU和ExoY。ExoS和ExoT是同源外毒素，具有GTP酶激活和ADP核糖基转移酶活性，能够破坏肌动蛋白细胞骨架并诱导细胞凋亡性细胞死亡，而ExoU具有磷脂酶A

被铜绿假单胞菌参考菌株PAO1(仅ExoS、T、Y)感染的小鼠巨噬细胞系J774A.1用作体外模型，以研究丹参酮对铜绿假单胞菌细胞毒性和致病性的作用。100 μM的丹参酮化合物无一针对PAO1是直接杀菌或抑菌的，它们针对巨噬细胞也不是生长抑制性的(图5A)。然而，蛋白质印迹分析显示了，用各100 μM的三种活性丹参酮化合物处理PAO1(其在转录激活T3SS的低钙条件下生长)，显著降低了ExoS的分泌(图5B)。与生物化学发现一致，dHTSN和dHTSN1在抑制ExoS分泌方面比TSN1更活跃，而crpTSN没有显示抑制活性。这些数据确认了，铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生受损，可以导致细菌外毒素和其它毒力因子的分泌减少。

实施例7：丹参酮降低铜绿假单胞菌PAO1对巨噬细胞的细胞毒性，并且抑制细胞内细菌存活

被吞噬的铜绿假单胞菌感染的巨噬细胞经历由促炎半胱天冬酶-1介导的快速细胞死亡(细胞焦亡)，所述促炎半胱天冬酶-1经由Nod样受体激活，所述Nod样受体通过经由T3SS注入胞质溶胶内的细菌鞭毛蛋白发信号。J774A.1细胞在各种丹参酮化合物的存在下由PAO1感染，并且通过测量经由濒死巨噬细胞释放到培养基内的细胞质酶乳酸脱氢酶(LDH)，来定量细胞毒性。如图6A中所示，TSN1、dHTSN和dHTSN1以剂量依赖性方式抑制铜绿假单胞菌诱导的细胞裂解，而crpTSN是无活性的。蛋白质印迹分析暗示活化的半胱天冬酶-1降低作为受感染的巨噬细胞存活的合理原因(图6B)，这与T3SS通过丹参酮的功能性抑制一致。值得注意的是，通过100 μM的两种最活跃的丹参酮dHTSN和dHTSN1(分别为EC

尽管是真正的细胞外病原体，被吞噬的铜绿假单胞菌可以在巨噬细胞中瞬时存活且甚至复制，这是由破坏巨噬细胞的抗菌效应子功能的细菌毒力因子成为可能的细胞事件。最近的成像研究揭示了，被巨噬细胞吞食进入吞噬泡内的铜绿假单胞菌PAO1，随后可以逃逸到细胞质内，它在其中最终诱导细胞裂解(Preeti Garai等人，bioRxiv 389718；doi:https://doi.org/10.1101/389718)。引人注目的是，吞噬体逃逸和细胞内细菌介导的细胞裂解两者均强烈依赖于ExoS – 正是丹参酮阻断的T3SS效应物。在感染后2小时，受PAO1感染的J774A.1细胞用庆大霉素处理，以杀死细胞外细菌，并且定量来自裂解细胞的细胞内细菌。如图6C中所示，三种活性丹参酮剂量依赖性地抑制细胞内细菌存活，确认了丹参酮确实可以通过抑制ExoS分泌来保护巨噬细胞功能，以防止通过吞噬的PAO1介导的吞噬体逃逸和细胞裂解。

值得注意的是，铜绿假单胞菌可以在体外和体内侵入上皮细胞并且在其中活跃繁殖，其中ExoS通过以下促进其在侵入后的细胞内存活：(1)帮助铜绿假单胞菌避免溶酶体降解，以及(2)产生膜泡作为细菌的复制小生境。矛盾的是，ExoS长期以来被认为能够通过肌动蛋白细胞骨架的失稳，来防止铜绿假单胞菌被上皮细胞内化或内吞。然而，最近以来的研究已通过以下调和了这些相互矛盾的发现：将ExoS声称的抗内化活性与“人工”报告系统的使用联系起来，包括不含细菌的ExoS的异位表达或在PA103(铜绿假单胞菌的效应物无效的细胞毒性菌株)的背景下ExoS的反式表达。当ExoS在铜绿假单胞菌菌株如PAO1中天然编码时，它并不防止细菌内化到上皮细胞内。

实施例8：丹参酮在急性肺炎的鼠模型中的体内功效

吞噬巨噬细胞和嗜中性粒细胞在体内急性铜绿假单胞菌感染期间的细菌清除中起关键作用。为了破坏其抗菌防御，铜绿假单胞菌已进化出依赖T3SS的机制，以裂解巨噬细胞并损害嗜中性粒细胞功能。通过嗜中性粒细胞的活性氧(ROS)产生对于被吞噬细菌的细胞内杀死是至关重要的。最近的研究证实了，通过PAO1分泌的T3SS效应物ExoS和ExoT独立地抑制人嗜中性粒细胞中的ROS产生。因此，铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生抑制应该改善巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬功能，导致从受感染的宿主中的有效细菌清除。

使用急性肺炎的鼠模型调查丹参酮是否可以在体内保护不受铜绿假单胞菌感染。如图7A(

在其中受感染小鼠在感染时接受单剂量治疗的分开的体内实验中，对感染后18小时采样的支气管肺泡灌洗液中的PAO1进行定量；活性丹参酮显著降低了肺中的细菌负荷(图7B)– 这一后果可能至少部分起于通过功能性吞噬细胞的细菌清除，所述功能性吞噬细胞通过受损的铜绿假单胞菌T3SS提供。与这些发现一致，在感染后18小时，来自模拟治疗的小鼠的肺的H&E染色揭示了阻塞气道的广泛细胞浸润和组织损伤(图7C，S16)。相比之下，通过丹参酮和dHTSN1的治疗特别显著地降低了炎症，如通过嗜中性粒细胞最低限度浸润到肺的肺泡空间内证明的(图7C，S16)。总之，我们的体内数据支持以下假定：丹参酮通过抑制经由T3SS的细菌毒力因子分泌，来预防与假单胞菌感染相关的肺病理状况。

实施例9：其它已知的T3SS抑制剂

值得注意的是，许多研究已经验证了T3SS作为用于抗生素发现和开发的有吸引力的药物靶。最近的两篇论文提供了用于治疗铜绿假单胞菌感染的新策略(包括T3SS的靶向)的全面综述。用T3SS结构蛋白和效应蛋白的被动免疫和主动免疫，可以在体外和体内防止或降低T3SS诱导的细菌毒力。尽管各种细胞报告基因测定加上文库筛选，导致相对低效力的一些T3SS小分子抑制剂的鉴定，但缺乏精确分子靶和作用机制的了解已阻碍了其进一步开发。苯氧基乙酰胺是唯一已知的一类化合物，其通过与PscF结合干扰其多聚化来阻断T3SS介导的铜绿假单胞菌效应物的分泌和易位两者。我们在体外和体内测定中测试了原型苯氧基乙酰胺化合物MBX-1641，并且发现与dHTSN和dHTSN1在功能上可比较。如图S18中所示，MBX-1641抑制PAO1中的ExoS分泌、PAO1对鼠巨噬细胞的细胞毒性以及PAO1的细胞内增殖。进一步地，MBX-1641降低了受PAO1感染的小鼠的支气管肺泡灌洗液中的细菌负荷(图S18F)。然而，与丹参酮形成对比，MBX-1641对PscF与PscE-PscG的结合没有作用，如通过荧光偏振分析的(图S18G)。这些发现指示了，苯氧基乙酰胺和丹参酮作为铜绿假单胞菌T3SS的抑制剂在机制上不同。

结论

选择性丹参酮已确定为机制上确定的铜绿假单胞菌T3SS针的生物发生的抑制剂。丹参酮的生物化学和生物物理以及体外和体内功能研究，验证了这些天然草药化合物作为用于开发一类新抗生素的有希望的药物候选物，用于治疗多药抗性的铜绿假单胞菌感染。作为在人中具有可证实的安全性概况、广泛用于治疗心脑血管疾病的传统中药中的活性成分，丹参酮可以在确定各个化合物的安全性的综合毒理学研究结束后直接使用，以减轻铜绿假单胞菌相关的肺部感染，而不诱导抗生素抗性。我们的工作通过开发用于文库化合物的自动HTS的灵敏荧光偏振测定，证实了靶向T3SS针的生物发生用于抗生素发现的可行性。由于T3SS在许多其它致病性革兰氏阴性菌中是高度保守的，所述革兰氏阴性菌例如大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、弧菌属、伯克霍尔德氏菌属和衣原体属，我们用于抗生素发现的策略可能在对抗抗生素抗性方面具有广泛牵涉。

实施例1-9中描述的结果使用下述材料和方法获得。

实验程序

材料。Boc-氨基酸购自Peptides Institute(日本)。Boc-Leu-OCH

肽合成。所有肽都使用优化的HBTU活化/DIEA原位中和方案来合成，所述方案由Kent及同事开发用于Boc化学固相肽合成(SPPS)。来自树脂的肽裂解和侧链脱保护反应在0-4℃下在HF中执行1小时。在用冷乙醚沉淀后，粗产物在使用C18反相柱的制备型HPLC上纯化至同质性。分子质量通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)进行确定。

天然化学连接。天然化学连接反应在含有6 M盐酸胍(GuHCl)、100 mM MPAA和40mM TCEP，pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中进行。使用Thz代替Cys来保护在PscG的位置26处的δ-巯基赖氨酸，以避免分子内头尾连接反应。在通过MeONH

MBX1641的化学合成。如报告的，化合物MBX1641直接由2-(2,4-二氯苯氧基)丙酸和3,4-亚甲基二氧基苄胺(Alfa Aesar)进行制备。粗产物在使用C4反相柱的制备型HPLC上纯化至同质性。分子质量通过ESI-MS进行确定。

异三聚体复合物的共折叠和表征。通过以下实现多肽折叠：将多肽(以相同的摩尔比)以1 mg/mL溶解于6 M GuHCl中，随后为用含有 0.5 mM TCEP、pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的6倍稀释，以及针对相同缓冲液的过夜透析。在透析后，在室温下，在使用流速为0.5ml/分钟的Superdex 75柱的ÄKTA蛋白质纯化系统上，通过尺寸排阻层析分析蛋白质复合物。根据标准校准曲线计算表观分子量。蛋白质复合物还通过在Waters XBridge C18柱(4.6×150 mm，3.5 μm)上的反相HPLC进行分析，并且通过ESI-MS确定其分子质量。

荧光偏振(FP)和基于FP的竞争性结合测定。所有荧光偏振测定都使用黑色的低蛋白质结合的96孔板(Thermo Fisher Scientific)，在100 μl/孔的10 mM Tris缓冲液的总体积中完成，所述Tris缓冲液含有150 mM NaCl和1 mM EDTA，pH 7.0，除非另有说明。在温和混合和温育3小时后，在Tecan Infinite M2000荧光板阅读器上，在470 nm(激发)和530nm(发射)波长处获取FP读数。如先前所述的执行非线性回归分析，以产生Kd和IC

对于PscF与PscG或PscE-PscG的直接结合，将等体积的FAM-PscF

等温滴定量热法(ITC)。ITC用于确定分子间相互作用的结合亲和力-

圆二色性(CD)光谱学和热变性。使用1-mm石英比色皿，在圆二色性光谱仪(Jasco，Easton，MD)上，在室温下，获得在10 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中浓度为200 nM的蛋白质的CD光谱。使用配备温度控制器的JASCO圆二色性光谱仪，在PBS中进行蛋白质热变性。将在PBS，pH 7.4中制备的2.5 mL蛋白质溶液(10 μM)等分到3 mL比色皿内。在恒定搅拌下，以每分钟1℃的加热速率，在25℃和90℃之间以1度的间隔获取测量。在每加热1分钟后，比色皿中的溶液等待20秒，然后在16秒时期内检测信号。加热和数据采集用通过JASCO提供的控制软件完全自动化。如先前所述执行数据处理。

在含有20 mM磷酸钠(pH 7.4)、100 mM NaCl、0.1% NaN

分子对接。PscE-PscF-PscG的异三聚体复合物的3维结构用于分子对接。从异三聚体复合物中去除PscF，以制备用于对接的分子靶，PscE中显示异三聚体复合物中的高b因子值的四个N末端残基(GSHM)也是如此。使用AutoDockTools软件套件，制备用于对接的三种活性丹参酮化合物和PscE-PscG复合物。AutoGrid模块用于创建网格框，具有在沿着XYZ方向的44.174、28.238、18.306处的中心以及106、102、82个点的大小，伴随0.375 Å的间距。对接计算由使用Lamarkian Genetic算法的AutoDock4.2.6执行，具有150的群体大小以及设定为10 000 000的估计和世代数目。对于每种化合物执行100次对接运行，并且对接的构象使用AutoDockTools以2.0 Å的截断进行聚类，得到超过总运行95%的最大聚类。

细菌菌株和细胞系以及生长条件。铜绿假单胞菌分离株PAO1及其突变株PAO1 Δ

杀菌活性测定。在丹参酮抑制剂(100 μM化合物，2% DMSO)的存在下，将PAO1过夜培养物在LB中以1:100稀释。在伴随温和搅动的3小时温育后，将细菌稀释并铺平板。杀菌活性通过菌落计数进行确定，并且针对模拟治疗(仅2% DMSO)下的活性进行标准化。结果表示为三次独立实验的输入细菌的平均值± SD百分比。

丹参酮对巨噬细胞的细胞毒性。将总共1x10

细胞活力=(OD

T3SS介导的效应物分泌的抑制。对于T3SS诱导，在丹参酮抑制剂(100 μM化合物，2% DMSO)的存在下，将PAO1过夜培养物在含有5 mM EGTA和20 mM MgCl

细胞质乳酸脱氢酶(LDH)释放测定。将1x 10

半胱天冬酶1介导的受PAO1感染的巨噬细胞的细胞焦亡。将2x 10

细菌内化的定量。将5x10

动物研究。本研究中使用的6周龄雌性C57BL/6J小鼠得自西安交通大学的实验动物中心(Experimental Animal Center)。所有动物都维持在生命科学与技术学院(Schoolof Life Science and Technology)的动物护理设施中，并且随意提供食物和水。动物研究通过西安交通大学的动物研究和伦理委员会(Committee on Animal Research andEthics)批准。

C57BL/6J小鼠用吸入的七氟醚轻度麻醉，并且在用吸入的七氟醚轻度麻醉后，通过PAO1(20 μL PBS中的1×10

对于存活研究，在感染时或感染后8小时，以及每12小时直至动物死亡或实验结束，向受感染的动物鼻内施用丹参酮抑制剂(100 μM，1% DMSO，在10 μL PBS中)。含有1%DMSO的PBS用作模拟治疗。

统计分析。除非另有说明，否则数据从一式三份或四份的至少三次独立实验中收集。将数据合并，且如所示的表示为平均值± SEM或平均值± SD，使用GraphPad Prism版本7，通过各种统计检验分析结果。p < 0.05被视为统计学显著的。显微镜检查图像代表至少两次独立实验。

支持信息

PscE、PscF和PscG的化学合成以及层析和质谱表征；PscE-PscF-PscG的尺寸排阻层析；PscE、PscF、PscG、PscE-PscG和PscE-PscF-PscG的热变性；通过等温滴定量热法和/或荧光偏振定量PscG与PscF或PscE的相互作用；基于荧光偏振的天然草药化合物的初始筛选；丹参酮对PscE-PscF-PscG的构象和稳定性的作用；丹参酮衍生物及其荧光光谱性质；在大肠杆菌中表达的重组PscG的SDS-PAGE分析；丹参酮在PscE-PscG中的分子对接；PAO1和PAO1

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本文引用了许多专利和非专利出版物，以便描述本发明所属领域的现有技术。 这些出版物各自的全部公开内容引入本文作为参考。

虽然上文已描述和/或例证了本发明的某些实施方案，但根据前述公开内容，各种其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。 因此，本发明并不限于所描述和/或例证的特定实施方案，而是能够具有相当大的变化和修改，而不脱离所附权利要求的范围和精神。

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