新型水稻白叶枯病菌III型分泌系统抑制剂的筛选及初步构效研究

摘要

水稻白叶枯病是世界范围内制约水稻生产的重要因素，该病害是由水稻黄单胞菌属白叶枯病菌致病变种稻生黄单胞菌 Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Ishiyama)（以下简称侵Xoo）染所致，可在水稻任意生长阶段侵染植株。目前，化学防治是防治水稻白叶枯病的主要途径，然而传统杀菌剂防效不佳，甚至导致病原菌抗性增强。因此，寻求具有新型作用机制的抗菌剂具有重要的应用价值。　　细菌Ⅲ型分泌系统（T3SS）是水稻白叶枯病菌的重要毒性因子，在病原菌侵染过程中向寄主体内分泌效应蛋白，该系统可为药物分子设计提供新型作用靶标。前期研究表明，以TS006为主的多酚类化合物作为新型T3SS抑制剂对水稻白叶枯病具有较好的防治效果。本论文基于课题组建立的水稻白叶枯病菌T3SS抑制剂筛选模型，以TS006为阳性对照，通过高通量筛选（HTS）检测前期合成的216个化合物对hpal基因启动子的抑制活性；测定高活性化合物对Xoo的生长影响；通过测试活性化合物对Xoo在烟草上HR反应的影响，研究T3SS抑制剂对Xoo在水稻幼苗和成株上致病性的影响。本文筛选得到了两类具有新颖结构骨架的水稻白叶枯病T3SS抑制剂，即β-硝基苯烯类化合物（YM-2、YM-10）及β-硝基苯烯丙酸类化合物（ZGX-7、XY-254）。　　结果表明，100μmol/Lβ-硝基苯烯丙酸XY-254 对hpa1启动子抑制率达到97%，而200μmol/L阳性对照TS006对hpa1启动子抑制率仅为77%，且该化合物对hpa1启动子抑制率随浓度升高而提高，呈显著的浓度依赖性。在丰富培养基（M210）和hrp诱导培养基（XOM2）中，该化合物对Xoo适应期、生长期、平稳期及衰落期均未表现出显著的抑制作用，表明细菌各生长阶段均不受其影响。化合物XY-254能够抑制Xoo在烟草上HR反应，也能显著抑制Xoo在水稻幼苗和成株的致病性，表明其具有作为T3SS抑制剂的潜力。以化合物XY-254作为先导化合物，利用构象限制原理、生物电子等排原理、拼和原理等设计合成了24个系列结构衍生物2a-7d，化合物结构经 1H NMR确认。本文研究结果为进一步开发以化合物XY-254为先导化合物的新型杀菌剂提供了扎实的基础。

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1 前言

水稻白叶枯病是由黄单胞菌侵染导致的水稻病害。目前，化学防治是防治水稻白叶枯病的主要方法，然而传统杀菌

1.1 水稻白叶枯病

1.1.1 病害症状

1.1.2 病害分布

1.1.3 传播途径和发病条件

1.1.4 主要致病机理

1.1.5 水稻白叶枯病的防治药剂

1.2细菌III型分泌系统研究进展

1.2.1 T3SS的装置

1.2.2 T3SS的编码基因

1.2.3 T3SS的调控

1.2.4 T3SS的效应子

1.2.5 Harpin蛋白

1.3 病原细菌T3SS抑制剂研究进展

1.3.1 以T3SS为靶标的化合物筛选方法

1.3.2 T3SS抑制剂及其作用机制

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 主要试剂和仪器

2.1.3 小分子化合物

2.1.4 培养基，菌株及植物培养条件

2.2 试验方法

2.2.2 hpa1基因启动子活性抑制物对PXO99A生长的影响

2.2.3化合物对Xoo在烟草的HR反应的影响

2.2.4 T3SS抑制剂对Xoo在水稻上致病性的影响

2.3 结果与分析

2.3.1 hpa1 基因启动子活性抑制化合物的筛选结果

2.3.2 hpa1启动子活性抑制物对PXO99A生长影响的结果

通过做曲线图和误差线分析，与等体积的DMSO溶剂对照相比，L-DOPA、YM-2、YM-10、YM-

2.3.3 活性化合物对Xoo在烟草上HR反应的检测

经过统计学差异性分析，7个化合物均没有抑制菌落的生长（P>0.05）

2.3.4 T3SS抑制剂对Xoo在水稻上致病性影响的结果

2.4 讨论和结论

2.4.1 讨论

2.4.2 结论

3.1目标化合物的设计

3.2 仪器和试剂

3.1..1 仪器

实验使用仪器列表如下：

3.3 实验方法

3.2.1合成路线设计

3.2.2 合成方法

3.4结果与讨论

3.4.1 化合物的结构表征

3.4.2讨论

3.5结论

致 谢

参考文献

附录1 攻读硕士期间发表的学术论文及获奖情况

附录2 化合物对Xoo各生长阶段的影响

附录3 化合物的核磁谱