水稻白叶枯病菌III型分泌系统(T3SS)抑制剂的筛选

摘要

稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是一种重要的细菌性病害，能使水稻严重减产，是我国水稻生产上的重要细菌病害之一。传统防治措施主要以抗生素为主，随着抗生素的大量使用，病原细菌抗药性的问题日益严峻。以病原细菌的毒力因子为靶点，在不影响细菌生长的前提下，阻断病原菌对宿主植物的侵染达到防治病害的目的，成为新型抗菌药物筛选及研发的新思路和新途径。T3SS（Type Ⅲ Secretion System）是病原细菌在侵染宿主植物时的关键毒力因子，存在于众多革兰氏阴性病原细菌中。由于具有高度的保守性，而且不是细菌生长的关键因素，因此可以作为新型小分子抑制剂筛选及开发的理想靶标。　　本研究将T3SS作为靶标，完成了345个化合物的筛选，主要包括植物次生代谢产物、人工合成化合物以及海洋微生物提取物。发现了对T3SS有抑制作用的化合物，进一步的生长曲线测试筛选出对病原菌生长没有影响的化合物CZ-1、CZ-4和CZ-9， Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-12和Ⅲ-14，WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24。非寄主烟草过敏性反应显示CZ-1、CZ-4和CZ-9，Ⅲ-2、Ⅲ-3和Ⅲ-4均能完全抑制HR， Ⅲ-12和Ⅲ-14则没有明显的影响，结果说明，CZ-1、CZ-4和CZ-9，Ⅲ-2、Ⅲ-3和Ⅲ-4是通过影响 T3SS 功能，而非细菌生长，影响了 Xoo 烟草诱导 HR 的能力。通过qRT-PCR和转录组测序对其相关作用机制进行了初步的研究，在添加抑制剂的情况下，相关基因均受到良好的抑制，并测试了相关化合物对Xoo在水稻幼苗及成株上致病性的影响。最终筛选得到10个具有良好活性的化合物，它们可能通过HrpG/HrpX调控途径影响了T3SS发挥作用，从而影响了Xoo在水稻上的致病性。这一结果为发展新型T3SS抑制剂及其在细菌病害防控方面提供了理论依据。

目录

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1 前言

1.1 水稻白叶枯病菌研究状况

1.1.1 Xoo的主要致病机理

1.1.2 Xoo的III型分泌系统

1.2 病原细菌T3SS研究进展

1.2.1 以病原细菌T3SS为靶标的化合物筛选方法

1.2.2 革兰氏阴性菌三型分泌系统抑制剂的筛选

1.3 本研究的目的意义及技术路线

2 材料与方法

2.1 本实验所用菌株及质粒见附录表1

2.2 试验涉及仪器及试剂

2.3 化合物的来源

2.4 试验所用培养基、菌株及植物培养条件

2.5 试验方法

2.5.2 对hpa1 基因启动子有抑制作用的化合物对野生型菌株PXO99A生长的影响

2.5.3 筛选到的化合物在处理 Xoo 过后对烟草上HR反应的测试

2.5.4 菌落计数实验

2.5.5 qRT-PCR 检测 T3SS 抑制剂处理条件下 PXO99A 的相关基因表达

2.5.7 供试化合物对 hrcT启动子活性的影响

2.5.8 Xoo 接种方法

2.5.9 Xoc接种方法

2.5.10 转录组验证

3 结果和分析

3.1 供试化合物对hpa1 基因启动子活性测试

3.1.1 植物次生代谢产物T3SS 抑制剂的流式筛选

3.1.2 人工合成的化合物T3SS 抑制剂的流式筛选

3.1.3 海洋微生物代谢产物T3SS 抑制剂的流式筛选

3.1.4 结果和分析

3.2 对hpa1 基因启动子有抑制作用的化合物对 PXO99A 生长的影响

3.2.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对Xoo生长的影响

3.2.2 人工合成化合物III-2、III-3 、III-4、III-12和 III-14对Xoo生长的影响

3.2.3 海洋微生物代谢产物WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24对Xoo生长的影响

3.2.4 结果和分析

3.3 不影响Xoo生长得化合物对 Xoo 在烟草上 HR 的测试

3.3.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对 Xoo 在烟草上 HR 的测试

3.3.2 人工合成化合物III-2、III-3、III-4、III-12和III-14对 Xoo 在烟草上 HR 的测试

3.3.3 结果和分析

3.4 对HR有抑制作用的化合物菌落计数

3.4.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9的菌落计数

3.4.2 人工合成化合物III-2、III-3和III-4的菌落计数

3.4.3 海洋微生物代谢产物WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24的菌落计数

3.4.4 结果和分析

3.5.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对PXO99A 的相关基因的影响

3.5.2 人工合成化合物III-2、III-3和III-4对PXO99A 的相关基因的影响

3.5.3 海洋微生物代谢产物WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24对PXO99A 的相关基因的影响

3.5.4 结果和分析

3.6 供试化合物对hrpG 和 hrpX基因启动子活性测试结果

3.6.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对hrpG 和 hrpX基因启动子的影响

3.6.2 人工合成化合物III-2、III-3和III-4对hrpG 和 hrpX基因启动子的影响

3.6.3 海洋微生物代谢产物WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24对hrpG 和 hrpX基因启动子的影响

3.6.4 结果和分析

3.7 供试化合物对hrcT基因启动子活性测试结果

3.7.1 植物次生代谢产物植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对hrcT基因启动子的影响

3.7.2 人工合成化合物III-2、III-3和III-4对hrcT基因启动子的影响

3.7.3 海洋微生物代谢产物WS-C-1、WS-C-17、WS-C-22和WS-C-24对 hrcT启动子的影响

3.7.4 结果和分析

3.8 Xoo 接种结果

3.8.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对 Xoo 在水稻上致病性的检测

3.8.2 人工合成化合物III-2、III-3和III-4 Xoo 在水稻上致病性的检测

3.8.3 结果和分析

3.9 Xoc 接种结果

3.9.1 植物次生代谢产物CZ-1、CZ-4和CZ-9对 Xoc 在水稻上致病性的检测

3.9.2 结果和分析

3.10 转录组验证

3.10.1 结果和分析

4 结论、讨论与展望

4.1 结论

4.2 讨论

4.3 展望

致 谢

参考文献

附录