构建水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种利用水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用。本发明保护一种特异DNA分子，依次包括如下区段：区段甲、区段乙和区段丙；所述区段甲为HrcC启动子；所述区段乙为TAL信号肽；所述区段丙为转录终止序列。含有以上所述特异DNA分子的重组载体也属于本发明的保护范围。本发明还保护以上任一所述重组载体的应用，为表达目的蛋白并将其转运至植物细胞。本发明可用于鉴定待测蛋白是否为效应蛋白。本发明提供了一种简单易行且可批量操作的方法，该方法可将分泌蛋白强制分泌到植物体内，从而筛选出有重大生物学意义的效应蛋白。该发明对于植物病原菌致病机制的研究起到了一定的促进作用。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物及基因工程技术领域，涉及一种利用水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用。

背景技术

许多植物和动物病原菌都配备有效应蛋白(translocated effector proteins)作为其“分子兵工厂”，效应蛋白能帮助病原菌感染宿主并在宿主中定殖。

效应蛋白对于病原菌在植物/动物中的增殖和侵染具有极其重要的作用。随着各种病原菌(细菌、真菌等)基因组测序的完成，本领域技术人员通过生物信息学分析预测了数目庞大的分泌型蛋白质。但生物信息学仅能对蛋白质的功能进行预测，预测结果的准确性无法确保，因此蛋白质是否真的具有预测的功能，仍然需要试验验证。很多病原菌分泌蛋白的含量很低且分泌方式不明确，很多寄生性真菌无法在人工培养基上培养，也没有办法进行遗传操作，因此研究这些病菌侵染时所分泌蛋白的功能非常困难。如何从数目庞大的预测蛋白中快速有效的筛选出对致病菌存在重要作用的效应蛋白就变得极其有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转运目标蛋白到植物体内的表达载体及其应用。

本发明首先保护一种特异DNA分子，自上游至下游依次包括如下区段：区段甲、区段乙和区段丙；所述区段甲为HrcC启动子；所述区段乙为TAL信号肽；所述区段丙为转录终止序列。

所述区段甲具体可如序列表的序列1第7-524位核苷酸所示。

所述区段乙具体可如序列表的序列1第525-674位核苷酸所示。

HrcC启动子和TAL信号肽的物种来源均为XOO生理小种PX099。

所述特异DNA分子中，所述区段乙和区段丙之间还具有限制性内切酶的识别序列。所述限制性内切酶具体可为限制性内切酶SacⅠ。

所述转录终止序列具体可为NOS转录终止序列。所述区段丙具体可如序列表的序列1第690-965位核苷酸所示。

所述特异DNA分子具体可为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1第7-965位核苷酸所示的DNA分子；

(a2)序列表的序列1所示的DNA分子。

含有以上任一所述特异DNA分子的重组载体也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在出发载体中插入以上任一所述特异DNA分子得到的重组载体。所述出发载体具体可为PUFR034载体。所述重组载体具体可为在PUFR034载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护以上任一所述特异DNA分子的应用，为表达目的蛋白并将其转运至植物细胞。所述目的蛋白具体可为mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具体可为序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具体可为序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述avrxa10蛋白具体可为序列表的序列4所示DNA分子编码的蛋白质。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。所述应用中，所述特异DNA分子借助水稻白叶枯病菌导入植物。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。

本发明还保护以上任一所述重组载体的应用，为表达目的蛋白并将其转运至植物细胞。所述目的蛋白具体可为mCherry蛋白、含有mCherry蛋白的融合蛋白或avrxa10蛋白。所述mCherry蛋白具体可为序列表的序列2中第1-708位核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述含有mCherry蛋白的融合蛋白具体可为序列表的序列2所示核苷酸所示DNA分子编码的蛋白质。所述avrxa10蛋白具体可为序列表的序列4所示DNA分子编码的蛋白质。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。所述应用中，所述重组载体借助水稻白叶枯病菌导入植物。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。

本发明还保护以上任一所述特异DNA分子的应用，为鉴定待测蛋白是否为效应蛋白。

本发明还保护以上任一所述重组载体的应用，为鉴定待测蛋白是否为效应蛋白。

本发明还保护一种鉴定待测蛋白是否为效应蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将待测蛋白的编码基因插入以上任一所述重组载体的所述区段乙和所述区段丙之间且所述编码基因与所述区段乙位于同一个编码框，得到重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入出发菌，得到重组菌；所述初发菌为水稻白叶枯病菌；

(3)分组操作如下：

实验组：将所述重组菌导入植物，然后观察植物发病情况；

对照组：将所述出发菌导入植物，然后观察植物发病情况；

在平行操作的前提下，如果实验组植物的发病程度不同于对照组植物，待测蛋白为效应蛋白。

所述效应蛋白为具有改变植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白质。所述改变具体可为促进。“实验组植物的发病程度不同于对照组植物”具体可为“实验组植物的发病程度高于对照组植物”。

步骤(1)中，所述待测蛋白的编码基因具体可通过重组插入所述重组载体的所述区段乙和所述区段丙之间。步骤(1)中，“将待测蛋白的编码基因插入以上任一所述重组载体的所述区段乙和所述区段丙之间”的实现方式具体如下：①用限制性内切酶SacⅠ酶切所述重组载体，回收线性化载体；②在待测蛋白的编码基因的5’末端增加片段甲(片段甲具体可为如下序列：CGGACGATGTCCGAGCTC)、3’末端增加片段乙(片段乙具体可为如下序列的反向互补序列：ACGATCTGCAGCGAGCTC)；所述片段甲由15-20个核苷酸组成，末尾的6个核苷酸为限制性内切酶SacⅠ的识别序列；所述片段乙由15-20个核苷酸组成，起始的6个核苷酸为限制性内切酶SacⅠ的识别序列；③取步骤①得到的线性化载体和步骤②得到的DNA分子，采用 II One Step Cloning Kit进行重组操作，得到所述重组质粒。

所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，具体可为水稻，更具体可为日本晴水稻。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。

所述方法中，具体可将所述重组菌或所述出发菌的菌悬液注射到所述植物的叶片中。所述方法中，实验组具体可将所述重组菌的菌悬液注射到所述植物的叶片中，对照组具体可将所述出发菌的菌悬液注射到所述植物的叶片中，7天后观察植物发病情况。所述菌悬液具体可为OD_600nm＝0.5的菌悬液。所述菌悬液的具体制备方法可为：用10mM的MgCl₂水溶液重悬所述重组菌或所述出发菌。

本发明还保护一种鉴定待测蛋白是否为效应蛋白的试剂盒，包括以上任一所述重组载体和水稻白叶枯病菌。所述水稻白叶枯病菌具体可为生理小种PX099。

本发明提供的载体，借助Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)的Ⅲ型分泌系统将待测蛋白质强制分泌到植物体内。本发明提供了一种简单易行且可批量操作的方法，该方法可将分泌蛋白强制分泌到植物体内，从而筛选出有重大生物学意义的效应蛋白。该发明对于植物病原菌致病机制的研究起到了一定的促进作用。

附图说明

图1为实施例2的结果。

图2为实施例3的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。水稻白叶枯病菌即Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)。PUFR034载体：参考文献：Robert DeFeyter,Clarence I.Kado b and Dean W.Gabriel；Small,stable shuttle vectors for use in Xanthomonas；Gene,88(1990)65-72。 II One Step Cloning Kit：Vazyme公司。

实施例1、重组质粒pLCS的制备

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。

序列表的序列1所示的双链DNA分子中，包括如下区段(5’→3’)：

区段甲：第7-524位核苷酸为区段甲；区段甲为启动子区域(HrcCpromoter)，其功能为启动外源基因强制表达；第433-458位核苷酸为PIP-box位点，其功能为是促进植物细胞壁溶解从而使Ⅲ型分泌系统发挥作用；

区段乙：第525-674位核苷酸为区段乙；区段乙为信号肽区域(TAL signal peptide)，其功能为促使蛋白质向分泌通路转移；

区段丙：第690-965位核苷酸为区段丙；区段丙为终止子区域(NOS转录终止序列)。

序列表的序列1中，第675-680位核苷酸为限制性内切酶SacⅠ的酶切识别序列。

Hrcc promoter和TAL signal peptide的物种来源均为XOO生理小种PX099。

2、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

3、用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切PUFR034载体，回收约8.7kb的载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pLCS。

经测序，对重组质粒pLCS进行结构描述如下：在PUFR034载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列1第7至965位核苷酸所示的双链DNA分子。

实施例2、验证重组质粒pLCS对目的蛋白的表达和转运效果

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

序列表的序列2中，第1-708位核苷酸编码mCherry蛋白(红色荧光蛋白)，第733-753位核苷酸编码SV40NLS，第757-777位核苷酸编码SV40NLS，第781-801位核苷酸编码SV40NLS。SV40NLS即核定位信号。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F1：5’-CGGACGATGTCCGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；

R1：5’-ACGATCTGCAGCGAGCTCTTAAGATCCTACCTTTCTCT-3’。

3、取重组质粒pLCS，采用限制性内切酶SacⅠ进行酶切，得到线性化质粒。

4、取步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的线性化质粒，采用II One Step Cloning Kit并按试剂盒说明书进行重组操作，得到具有序列表的序列3所示DNA分子的重组质粒(命名为重组质粒甲)。

5、将重组质粒甲导入水稻白叶枯病菌生理小种PX099，得到重组菌。

6、用10mM的MgCl₂水溶液重悬步骤5得到的重组菌，得到OD_600nm＝0.5的菌悬液。

7、取5叶1心的日本晴水稻，剥取倒数第二层的叶鞘，把步骤6得到的菌悬液注射到叶鞘中，3天之后观察。

结果见图1。图1中，左上图为普通视野下，右上图为观察DAPI染色的视野下(DAPI对细胞核染色)，左下图为观察红色荧光的视野下，右下图为右上图和左下图的叠加图。结果显示，在水稻叶鞘细胞核中观察到红色荧光蛋白，说明重组质粒pLCS可以有效地表达目的蛋白并且将目的蛋白转运至植物细胞内。

实施例3、检测待测蛋白是否为效应蛋白

1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。

序列表的序列4所示的DNA分子编码avrxa10蛋白。avrxa10蛋白为已知的效应蛋白(具有促进植物病原菌侵染宿主植物的功能的蛋白质)。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F2：5’-CGGACGATGTCCGAGCTCatggatcccattcgttcgcg-3’；

R2：5’-ACGATCTGCAGCGAGCTCtcagatcgtccctccgactg-3’。

3、取重组质粒pLCS，采用限制性内切酶SacⅠ进行酶切，得到线性化质粒。

4、取步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的线性化质粒，采用II One Step Cloning Kit并按试剂盒说明书进行重组操作，得到具有序列表的序列5所示DNA分子的重组质粒(命名为重组质粒乙)。

5、将重组质粒乙导入水稻白叶枯病菌生理小种PX099，得到重组菌甲。将重组质粒pLCS导入水稻白叶枯病菌生理小种PX099，得到重组菌乙。

6、用10mM的MgCl₂水溶液重悬步骤5得到的重组菌甲，得到OD_600nm＝0.5的菌悬液甲。用10mM的MgCl₂水溶液重悬步骤5得到的重组菌乙，得到OD_600nm＝0.5的菌悬液乙。

7、进行如下平行处理：

实验组：取5叶1心的日本晴水稻，把菌悬液甲注射到宽度为5mm的叶片中(每株水稻注射1个叶片，注射量为20微升)，7天之后观察发病表型。

对照组：取5叶1心的日本晴水稻，把菌悬液乙注射到宽度为5mm的叶片中(每株水稻注射1个叶片，注射量为20微升)，7天之后观察发病表型。

完成上述操作了，试验组叶片和对照组的叶片照片见图2。与对照组叶片相比，实验组叶片的发病表型更加严重，表明序列表的序列4所示的DNA分子编码的avrxa10蛋白为具有促进植物病原菌侵染宿主植物的功能的效应蛋白。

进行10次重复试验，结果一致。