治疗和预防肺部状况的活的生物治疗剂

摘要

描述了使用活的生物治疗剂(特别是经修饰的微生物，诸如通过环境选择压力并筛选出对治疗或预防肺部状况有治疗益处的特征而产生的嵌合微生物杂种或微生物突变体)来治疗肺部状况的方法和组合物。

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月17日提交的美国临时申请号62/746,742的权益，其通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及设计用于治疗和/或预防肺部状况(诸如囊性纤维化患者中慢性感染)的活体生物治疗菌株。特别地，活的生物治疗剂包括一种或多种经修饰的微生物，诸如使用来自环境压力源的选择性压力产生的嵌合微生物杂种或微生物突变体。

背景技术

肺部健康和疾病受肺部微生物群的影响。肺部状况多种多样，范围从炎症性疾病(诸如哮喘(asthma)或慢性阻塞性肺病(COPD))到感染性染病(如肺炎(pneumonia))，再到肺癌-其中这些疾病中的许多种都具有危及生命的后果。对于这些疾病中的一些，已知细菌病原体(agent)与疾病状态之间存在直接联系。对于其他疾病，怀疑是细菌病原体，但仍有待证明因果关系。直到最近，治疗细菌引起的疾病的唯一方法是利用抗生素。尽管抗生素已经挽救了许多生命并仍然有用，但它们不加选择的作用方式趋向于清除有益细菌和共生细菌以及有害菌株。这种对肺微生物群多样性的非预想的附带损害的后果现在变得更好的理解，因为如囊性纤维化(CF)等此类疾病表明慢性感染和抗生素的使用与肺微生物群多样性减少和临床结果不佳有关。

囊性纤维化是一种隐性遗传性遗传疾病，在2000名白人新生儿中就存在一人。由于位于7号染色体上的CF跨膜电导调节子(CFTR)基因中的一个或多个基因突变，囊性纤维化患者具有改变的肺部环境。CFTR突变会导致受到影响的人的细胞膜中的氯离子通道发生故障。与正常基因型肺相比，上皮表面氯离子的减少由于通过渗透上皮吸收水分而导致更厚的粘液和效率低下(Clunes,M.,et al(2007)Drug Discov Today Dis Mech 4(2):63–72)。这种较厚的粘液允许诸如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等生物在CF肺中形成生物膜。此外，由于改变的环境，CF患者的先天免疫系统无法有效工作以清除微生物。这导致CF肺中更高含量的DNA，这也促进更厚的粘液(Wang,Y.,et al(2014)Int J BiochemCell Biol 52:47-57)。由于病原体可以隐藏在CF患者较厚的粘液或唾液中，因此它们可以逃避抗生素和免疫应答。在6至10年龄之间的CF儿童中发现金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的患病率最高(LiPuma,J.(Apr.2010)Clinical MicrobiologyReviews 23(2):299–323)。随着患者年龄的增长，铜绿假单胞菌的发病率从10岁时CF患者的30％增加到18岁时患有慢性铜绿假单胞菌感染患者的80％。尽管标准抗生素治疗有助于控制侵袭性爆发，没有治疗方法可以完全消除感染。90％的CF患者死于肺部疾病，主要因为慢性假单胞菌感染(Gaspar,M.C.,et al(2013)Eur J Clin Microbiol Infect DisDOI10.1007/s10096-103-1876-y)。

需要一种替代疗法来清除慢性肺部感染，尤其是那些表现在CF患者肺部的感染。此外，滥用抗生素的贡献具有深远的影响，并增加了抗生素抗性在全球范围内的传播。迫切需要安全且有效的抗生素替代品。

发明简述

提供了用于治疗或预防肺部(例如肺和/或呼吸)状况的方法、组合物和试剂盒。

在一方面，提供了用于治疗或预防肺部状况的方法。所述方法包括向需其的个体施用治疗或预防有效量的经修饰的微生物(活的生物治疗剂)，例如通过选择压力产生的嵌合微生物杂种或微生物突变体，其中所述施用导致在所述个体中肺部状况的至少一种症状的预防、改善或消除。例如，所述经修饰的微生物可具有诸如但不限于以下能力的特征：降解生物膜，诸如假单胞菌属(Pseudomonas)生物膜；降解粘蛋白；竞争性抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；和/或分泌针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的细菌素。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括微生物感染。例如，所述微生物感染可以包括细菌感染，诸如包括一种或多种来自以下属的细菌物种的感染：假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、潘多拉菌属(Pandoraea)、埃希氏菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、莫拉氏菌属(Moraxell)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、韦荣菌属(Veillonella)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)和/或利斯特氏菌属(Listeria)。

在一个实施方案中，所述微生物感染是铜绿假单胞菌感染。在一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌感染是慢性铜绿假单胞菌感染。

在一个实施方案中，微生物感染是金黄色葡萄球菌感染。在一个实施方案中，金黄色葡萄球菌感染是慢性金黄色葡萄球菌感染。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括真菌感染，诸如包括来自以下属的一种或多种真菌物种的感染：念珠菌属(Candida)、马拉色菌属(Malassezia)、新萨托菌属(Neosartorya)、酵母菌属(Saccharaomyces)和/或曲霉属(Aspergillus)。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括真核感染，诸如来自以下属的一种或多种真核物种：蛔虫属(Ascaris)、血吸虫属(Schistosoma)、弓形虫属(Toxoplasma)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、环孢子虫属(Cyclospora)和/或并殖吸虫属(Paragonimus)。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括病毒感染，诸如选自以下的一种或多种病毒：流感病毒、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)(RSV)、冠状病毒(Coronavirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、副流感病毒(Parainfluenza virus)、腺病毒(Adenovirus)、星状病毒(Astrovirus)、杯状病毒(Calicivirus)和/或细小病毒(Parvovirus)。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括纤维化疾病(fibrotic disease)(FD)，诸如囊性纤维化(cystic fibrosis)(CF)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis)(IPF)或间质性肺炎(interstitial pneumonia)。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括炎性疾病，诸如哮喘(asthma)、COPD、支气管扩张(bronchiectasis)或肺炎(pneumonia)。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、狼疮(lupus)、结节病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)或干燥综合征(Sjogren's syndrome)(针对肺纤维化(PF)的危险因素)。

在一个实施方案中，所述肺部状况包括癌症，例如，腺癌(adenocarcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)或大细胞癌(large cell carcinoma)。

在一些实施方案中，如本文所述的一种或多种经修饰的微生物与一种或多种其他处理组合施用以治疗、预防或改善所述肺部状况的至少一种症状。例如，其他处理可以包括抗生素、噬菌体、抗体、肽、酶、糖、含糖聚合物、细菌素和/或孢子。

在一些实施方案中，将治疗或预防有效量的如本文所述的经修饰的微生物配制在固体剂型中(诸如干粉)、液体剂型中(诸如溶液)或半固体剂型中。在一个实施方案中，固体或液体剂型通过吸入施用。例如，可以配制固体剂型用于在肺中雾化，例如用于在大气道、小气道和/或呼吸性细支气管中吸入和释放。在另一个实施方案中，鼻内施用经修饰的微生物，例如，作为喷鼻剂或肺/鼻冲洗溶液。

在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包括治疗或预防有效量的如本文所述的经修饰的微生物和药学上可接受的载体，其配制用于治疗或预防肺部状况。

在另一方面，提供了包括如本文所述的药物组合物的剂型。例如，剂型可以包括治疗或预防有效剂量或治疗或预防有效剂量的如本文所述的药物组合物的百分比。剂型可以是固体、液体或半固体，例如配制成吸入溶液或干粉、喷鼻剂或肺/鼻冲洗溶液。

在另一方面，提供了试剂盒，其包括药物组合物，例如单位剂量，和任选地，使用说明书或关于如本文所述的肺部状况的治疗或预防方法的患者说明书。

附图简述

图1显示了F2BH2(上部2个斑块)和F2BH3(下部2个斑块)作为白色斑块，在48小时时针对平板上散布的铜绿假单胞菌(Xen-5)的荧光素酶产生菌株的清除厌氧细菌素活性；来自IVIS机器中生物发光的图片。

图2显示了亲本和经修饰的菌株的海藻酸裂解酶活性，由海藻酸琼脂平板上的可见清除区域描述。

图3显示了亲本和经修饰的菌株的粘蛋白酶活性，由粘蛋白琼脂平板上的可见清除区描述

图4A-4B显示了通过API 50 CH碳水化合物发酵条(strips)(bioMérieux,Inc.,Marcy l'Etoile,法国)表征的亲本和经修饰的菌株的碳水化合物代谢谱。图4A显示了对活的生物治疗剂LH1细菌素敏感的示例性细菌，利用定量交叉划线测定(cross-streakassay)得到证实。图4B显示了对活的生物治疗剂LH1亲本菌株细菌素敏感的示例性细菌，利用定量交叉划线测定得到证实。

图5显示了改进的交叉划线测定。厌氧生长48小时后，将7株多药抗性的金黄色葡萄球菌菌株划线穿过LH1，并将抑制生长的测量结果记录在表I中测试的其他测定中。

图6显示了

图7显示了定性滴落测定(drop test)中经修饰的菌株LH1和乳杆菌亲本菌株对金黄色葡萄球菌CF临床分离株的定性抗菌活性，显示了琼脂平板上的可见抑制区。

图8显示了利用野生型(WT)、LH1和媒介物对照的乙酸乙酯全细胞提取物针对铜绿假单胞菌CF临床分离株进行的滴落测定。

图9显示了利用WT菌株A、WT菌株B、LH1、媒介物对照的乙酸乙酯全细胞提取物对金黄色葡萄球菌CF临床分离株的滴落测定。

图10显示了利用粗乙酸乙酯提取物(上清液、沉淀物和3kD过滤上清液)针对金黄色葡萄球菌CF临床分离株进行的滴落测定。

图11显示了当以2:1的比例组合时，LH1和WT亲本菌株杀死并继续抑制浮游铜绿假单胞菌菌株PA01的生长长达8小时。

图12显示了LH1去除碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌(AR0243、CD CAR Bank)3天厌氧生物膜的能力。铜绿假单胞菌生物膜在用10

图13显示了LH1与WT亲本相比去除碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌(AR0243，CDC ARBank)3天厌氧生物膜的能力。铜绿假单胞菌生物膜在用10

图14显示了LH1在CF粘蛋白培养基中生长长达4小时的能力。将LH1接种到CF粘蛋白培养基中，并在37℃下厌氧生长4小时。LH1通过在厌氧条件下铺板用于活菌计数来定量。

图15显示了LH1在CF唾液中生长长达4小时的能力。将LH1接种到CF唾液中，并在37℃下厌氧生长4小时。LH1通过在厌氧条件下铺板用于活菌计数来定量。

图16显示了LH1在时间杀灭测定(time-kill assay)中减少合并CF唾液中内源性金黄色葡萄球菌的能力。合并的CF唾液用10

图17显示了LH1粗提取物减少合并的CF唾液中内源性金黄色葡萄球菌的能力。合并的CF唾液用1:1LH1处理并厌氧培养24小时，然后铺入金黄色葡萄球菌选择性培养基(Vogel-Johnson琼脂)上进行活菌计数，显示处理1小时后内源性金黄色葡萄球菌被去除。

图18显示了LH1粗提取物在生长抑制测定中减少碳青霉烯抗性的铜绿假单胞菌的能力。与媒介物对照相比，用未稀释的、1:2和1:100稀释的LH1粗提取物处理并有氧培养24小时的铜绿假单胞菌菌苔(lawn)显示出以剂量依赖性方式抑制生长。

图19显示了由透性酶基因移码突变产生的预测蛋白质的理化相纸。分析的性质包括分子量、消光系数、等电点、生理pH下的净电荷、估计的溶解度和沿着预测蛋白质的氨基酸序列的亲水性(Hopp-Woods标度)。

图20显示了使用Kyte-Doolittle标度的新预测蛋白质沿其氨基酸序列的疏水性。可以看到疏水性和亲水性的交替区域。

图21显示了用于对通透酶基因中编码移码突变的区域进行测序的扩增PCR产物。引物Perm03-F(5’-GCCGCCATAAAGCAAATGATCA-3’)(SEQ ID NO:1)和Perm01-R(5’-AGCCATCATGAACCGTCTCTTC-3’)(SEQ ID NO:2)以及Hot Start Taq DNA聚合酶(NEBiolabs)用于一起扩增PCR产物。PCR产物的可视化通过用SYBR Safe DNA凝胶染料(Invitrogen)对PCR反应的琼脂糖凝胶电泳进行染色来完成。来自10个菌落的PCR产物被纯化并送去进行Sanger测序。

图22显示了与媒介物对照相比，用1:10稀释的100X LH1粗提取物处理4小时后囊性纤维化患者唾液样品的流动性(pourability)

图23显示了鼻内递送10

发明详述

本发明提供了使用经修饰的微生物菌株(诸如使用选择压力产生的嵌合微生物杂种和/或微生物突变体)作为活的生物治疗剂来治疗肺部状况的方法和组合物。例如，可以如美国专利号9,765,358中所述产生经修饰的微生物，其通过引用整体并入本文。例如，GRAS(通常认为是安全的)物种的经修饰的微生物，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，例如这两种物种的嵌合微生物杂种或这些物种之一或两者的微生物突变体，可以用于本文所述的方法中。经修饰的微生物可拥有具有诸如以下能力的特征：降解生物膜，诸如假单胞菌属生物膜；降解粘蛋白；竞争性抑制金黄色葡萄球菌；和/或分泌针对铜绿假单胞菌的细菌素。在一些实施方案中，活的生物治疗剂可以通过鼻腔和/或吸入途径递送。

活的生物治疗剂被合理地设计用于治疗肺和/或鼻窦的传染性和炎性疾病。

针对对于预防疾病的症状和/或根本原因(诸如微生物感染)至关重要的特定特征筛选安全的益生菌微生物，然后通过产生经修饰的微生物菌株来改善生存力(survivability)。产生的菌株保留了对预防和/或治疗症状和/或根本原因至关重要的所有特征，诸如抗菌特征，同时能够更好地在肺部环境中存活。用于产生本文所述的经修饰的微生物的选择压力可包括抗真菌物质、有机化合物、溶剂、高温、低温、紫外线、渗透压力源、无机化学品、电离辐射、大气气体成分、维生素或辅因子、缺乏维生素或辅因子、酸、碱、碳水化合物源、氮源、生物毒素、肽、防腐剂物质、除草剂、杀真菌剂、杀虫剂或其他微生物发酵液的滤液。

如本文所述的经修饰的微生物菌株可用于减少炎症、维持针对肺病原体的厌氧/微需氧杀菌活性、扩大代谢特征，和/或产生具有针对生物膜、DNA和疤痕组织的活性的酶。在一些实施方案中，利用活的生物治疗剂的治疗也可能干扰癌症毒性机制以支持将肺癌患者纳入治疗。

除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同含义。Singleton,et al.,

本文提供的数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，核酸按5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基方向从左到右书写。

术语

“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用(例如，一个或多个)，除非上下文另有明确规定。

“营养缺陷型”是能够产生生长所需营养的生物体或细胞。在其中的实例中，通常是指细胞不能制造必需氨基酸。

缩写“CFU”是指菌落形成单位。

“嵌合生物”或“嵌合体”是指含有来自两种或更多种微生物物种的遗传信息的单细胞生物。

“接合”是通过直接的细胞与细胞接触或通过两个细胞之间的桥状连接在微生物之间转移遗传物质。

术语“培养”是指在用于生长的适当条件下，在液体或固体培养基中生长细胞群，例如微生物细胞。

缩写“DMSO”是指二甲基亚砜。

术语“源自”通常表示一种特定材料在另一种特定材料中找到其来源或具有可以参考另单元特定材料描述的特征。

术语“剂型”是指适合作为针对施用个体的单一剂量的物理离散单元，每个单元含有预定量的活性物质以及合适的药物赋形剂，所述预定量的活性物质经计算可产生所需的治疗或预防效果。“单位剂量”是在一段时间内足以在个体中提供治疗或预防有效水平的物质的量。

“环境压力源”是细胞周围环境中威胁体内平衡的因素。

“基因型”是生物体的遗传构成。

“体内平衡”是相互依赖的元素之间趋于相对稳定平衡的趋势，尤其是由生理过程维持的。

“水平基因转移”是在不同物种基因组之间的DNA的传递。

“杂种”是由两个遗传上不同的变种、物种或属培育出的生物体。

“个体”或“受试者”是指脊椎动物，典型的哺乳动物，诸如人。术语“个体”或“受试者”还指非人类哺乳动物，诸如，例如狗、猫、啮齿类动物等。

“活的生物治疗剂”是指适用于预防、治疗或治愈人类、动物或植物的疾病或状况的活体微生物。

“肺部状况”是指肺或更大呼吸道的疾病或急性或慢性不利状况，包括但不限于微生物感染、炎性疾病和癌症。

缩写“MIC”是指最低抑菌浓度。

“微生物”或“微生物菌株”是指单细胞生物，诸如细菌或真菌细胞，例如酵母。

术语“经修饰的”是指使用一种或多种环境压力源来修饰基因的表型表达或潜在基因组DNA的序列的过程。

“经修饰的微生物”或“经修饰的微生物菌株”是指与其源自的亲本生物体相比，通过应用一种或多种环境压力源诱导，而不使用重组技术或添加来自外源(如载体)的核酸，在基因组核苷酸序列或表型基因表达中具有一个或多个改变的单细胞生物体。

“突变体”是指与其源自的亲本生物体相比，在基因组核苷酸序列中具有一个或多个改变的生物体。

“寡产孢子(Oligo-sporogenic)”是一种微生物菌株，其中只有少数菌落成员形成孢子。

“有机化合物”是一大类气体、液体或固体化合物的任何成员，其分子含有碳。

“渗透压力源”是环境中的因素，其导致细胞周围溶质浓度变化，从而导致水穿过细胞膜的运动发生快速变化。

“亲本菌株”是指从中衍生嵌合体或突变体的微生物菌株。

“亲本供体”是直接通过接合、转化或其他DNA转移过程提供转移到另一物种或菌株的遗传物质；或间接通过提供促进亲本宿主中DNA和/或表型改变的条件、压力源、化学诱导剂等有助于亲本宿主遗传改变的菌株。

“亲本宿主”是通过环境压力源的作用或通过接合、转化或其他DNA转移过程从另一物种或菌株接收外源DNA，其DNA发生改变的菌株。

“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，尤其是人类。

“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，如本文所述的活的生物治疗剂(经修饰的微生物)与其一起施用。

“表型”是生物体的可观察特征，取决于基因型和环境。

“表型可塑性”是在暴露于不同环境时产生一种以上表型的一种基因型的能力。表型可塑性是生物体响应环境变化而改变其表型的能力。

“质粒”是在各种细菌菌株中发现的染色体外遗传元件。

“多倍体”是生物体获得一组或额外多组染色体的情况。

“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指降低患疾病或病症的风险(即，使可能暴露于或易患该疾病但尚未经历或表现出该疾病的症状的受试者不发展该疾病的至少一种临床症状，或导致症状发展的严重程度低于没有治疗的情况)。“预防(prevention)”或“预防(prophylaxis)”可以指延迟疾病或病症的发作。

“预防有效量”是指如本文所述的经修饰的微生物的量，其当施用于个体用于预防疾病或状况时，足以影响该疾病或状况的此类预防，或足以防止该疾病或状况的至少一种症状的发展，或与未施用该化合物的情况相比，足以产生较低水平的严重程度的症状的发展。“预防有效量”可根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

“预防(prophylaxis)”是指为预防疾病或状况或其至少一种症状而采取的措施。

“原养生物(prototroph)”是能够合成所需营养物的生物体或细胞。在其实例中通常是指必需氨基酸的自动合成。

“重组DNA(rDNA)分子”是通过遗传重组的实验室方法(诸如分子克隆)形成的DNA分子，其将来自多种来源的遗传物质汇集在一起，创建原本不会在基因组中发现的序列。

术语“重组”是染色体之间基因交换的过程或行为，导致不同的遗传组合并最终形成具有与亲本不同的染色体的独特后代。

“菌株改变”是通过自然或人工手段添加或删除DNA以改变物种中的基因表达。

如本文所用，“生存力(survivability)”是指在给定环境中持续存在的微生物的能力，即，在给定位置维持存在并且能够从该位置恢复以在别处生长。微生物不必积极地分裂或代谢活跃。例如，在肺的情况下，如本文所述，如果获得肺，微生物可以从肺样品中生长。

“治疗有效量”是指本文所述的经修饰的微生物的量，当施用于个体用于治疗疾病或病症时，足以影响对该疾病或病症的此类治疗或足以降低严重性或消除该疾病或状况的至少一种症状。“治疗有效量”是指将引起医师或其他临床医生正在寻找的受试者的生物学或医学反应的经修饰的微生物的量。“治疗有效量”可根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重等而变化。

“转座子”是可以进行转座的染色体片段，尤其是在宿主DNA中没有互补序列的情况下，可以作为一个整体在染色体、噬菌体和质粒DNA之间易位的细菌DNA片段。

在一个实施方案中，任何疾病或病症的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指改善疾病或病症(即阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”或“治疗”是指改善受试者可能无法辨别的至少一个物理参数。在又一个实施方案中，“治疗”或“治疗”是指在物理上(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或两者调节疾病或病症。

“载体”是用作人工携带外来遗传物质到另一细胞中的媒介物的DNA分子，在所述另一细胞中它可以复制和/或表达。含有外源DNA的载体称为重组DNA。

“野生型”是指自然界中存在的微生物。

治疗方法

提供了使用经修饰的微生物用于治疗肺部状况的方法，例如与炎症、感染和纤维化相关的肺和/或大呼吸道疾病或慢性状况。作为修饰过程的一部分，将一个或一系列环境压力和选择工具应用于亲本微生物以促进表型表达的修饰或基因组核苷酸序列的改变。在一个实施例中，经修饰的微生物是嵌合微生物杂种。在另一个实施方案中，经修饰的微生物是微生物突变体。可采用产生如本文所述的经修饰的微生物的环境压力和选择工具的非限制性实例包括抗真菌物质、有机化合物、溶剂、高温、低温、紫外线、渗透压力源、无机化学品、电离辐射、大气气体成分、维生素或辅因子、缺乏维生素或辅因子、酸、碱、碳水化合物源、氮源、生物毒素、肽、防腐剂物质、除草剂、杀菌剂、杀虫剂或其他微生物发酵液的滤液。

然后筛选这些经修饰的微生物以获得所需的性状。在这种情况下，所需的性状包括允许经修饰的微生物治疗肺部(例如，肺或呼吸)起源的疾病的性质。这些性状包括提高肺中的生存力、杀死靶标细菌、粘附于上皮细胞和/或粘液的能力、抑制炎症的能力、去除细菌生物膜的能力以及表现出粘液溶解活性的能力。产生经修饰的微生物的非限制性方法可以在美国专利号9,765,358中发现，该专利通过引用整体并入本文，以及以下的实施例中。

包括有利于治疗肺源性疾病的性质的亲本微生物的实例包括以下属的物种：乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、云母弧菌属(Micavibrio)、吸血弧菌属(Vampirovibrio)、吸血球菌属(Vampirococcus)、潜入杆菌属(Daptobacter)、溶杆菌属(Lysobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、Aristabacter、噬细胞菌属(Cytophaga)、加德纳菌属(Gardnerella)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、厌氧杆菌属(Anaerobacter)、Caprobacillus、产醋杆菌属(Oxobacter)、孢杆菌属(Sporobacter)、优杆菌属(Eubacterium)、螺旋杆菌属(Heliobacterium)、颤螺菌属(Ocillospira)、消化球菌属(Peptococcus)、脱卤杆菌属(Dehalobacter)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、粪球菌属(Coprococcus)、毛螺菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、Peptostroptococcus、穆尔氏菌属(Moorella)、利斯特氏菌属(Listeria)、枝原体属(Mycoplasma)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、螺杆菌属(Helicobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、盐单胞菌属(Halomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、放线菌属(Actinomyces)、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、柄杆菌属(Caulobacter)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、农杆菌属(Agrobacterium)、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、磁螺菌属(Magnetospirillum)、磁杆菌属(Magnetobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、立克次体(Rikettsia)、Eleftheria、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosacchoromyces)、鹅掌菌属(Schefferomyces)、接合酵母属(Zygosaccharmomyces)、亚罗酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、德克酵母属(Dekkera)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)和孢圆酵母属(Torulaspora)。在一个实施方案中，细菌菌株是乳杆菌属(Lactobacillus)物种，例如植物乳杆菌(L.plantarum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、旧金山乳杆菌(L.sanfransciscensis)、鼠李糖乳杆菌(L.rahamnosus)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)或罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)。

包括有利于改善肺生存力的性质的亲本微生物的实例包括来自以下门的微生物：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和蓝藻门(Cyanobacteria)，更具体地是以下属的物种：Bifidobacteriu、加德纳菌属(Gardnerella)、梭菌属(Clostridium)、Deionococcus、粪杆菌属(Faecalibacterium)、厌氧杆菌属(Anaerobacter)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、产醋杆菌属(Oxobacter)、孢杆菌属(Sporobacter)、优杆菌属(Eubacterium)、螺旋杆菌属(Heliobacterium)、颤螺菌属(Oscillospira)、消化球菌属(Peptococcus)、脱卤杆菌属(Dehalobacter)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、粪球菌属(Coprococcus)、毛螺菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、Micavibrio、吸血弧菌属(Vampirovibrio)、吸血球菌属(Vampirococcus)、潜入杆菌属(Daptobacter)、溶杆菌属(Lysobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、Aristabacter、噬细胞菌属(Cytophaga)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)和埃希氏菌属(Escherichia)。

如本文所述的经修饰的微生物可施用于个体以治疗、预防或改善肺部状况的至少一种症状。例如，固体、液体或半固体形式的经修饰的微生物可用于治疗或预防人类或非人类哺乳动物中的肺部状况。

用于可能治疗或预防方面有益的如本文所述的治疗方法的肺部状况的实例包括肺部感染、炎性疾病和癌症。肺部感染可由细菌、病毒、寄生虫和/或真菌引起。可由经修饰的微生物治疗或预防的由细菌感染引起的肺部疾病的实例包括但不限于：由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、肺炎衣原体(Chlamydophilia pneumonia)和嗜肺军团菌(Legionella pneumonophilia)引起的肺炎。可以使用经修饰的微生物减少或消除与肺部细菌感染相关的症状的实例包括但不限于：胸痛、胃痛、发烧、头痛、食欲不振、呕吐、咳嗽、呼吸急促和粘液产生。

如本文所述的经修饰的微生物可用于治疗或预防肺的炎性疾病。人类的肺含有大量微生物。大多数情况下，这些微生物对宿主的健康起着有益的作用；然而，对肺微生物群落的丰度、多样性和/或组成的干扰可能是有害的，并导致多种疾病、病症和/或综合征。可以使用经修饰的微生物治疗或预防的肺部炎性疾病的实例包括但不限于：哮喘、COPD、支气管扩张和肺炎。

本文所述的经修饰的微生物可用于治疗或预防与肺相关或起源于肺的其他疾病或综合征。此类疾病的实例包括但不限于：代谢紊乱、自身免疫性疾病，诸如类风湿性关节炎、狼疮、结节病、硬皮病或干燥综合征，纤维化疾病(FD)诸如囊性纤维化(CF)、特发性肺纤维化(IPF)、间质性肺炎和癌症(例如，腺癌、鳞状细胞癌或大细胞癌)。

如本文所述的经修饰的微生物可以多种方式施用于受试者。例如，可以将固体、液体或半固体形式的经修饰的微生物，例如作为吸入溶液或粉末、喷鼻剂或鼻/肺冲洗液施用于个体。例如，吸入递送可以每天发生一次、两次、三次或四次，持续1至21天或更长，例如，1、2、3、4、5、6、7、10、14或21天。

如本文所述的经修饰的微生物可以单独施用或作为多种微生物的混合物施用。剂量可根据使用的特定经修饰的微生物、要治疗的特定病痛(ailment)、患者的年龄、体重和健康状况、患者对治疗的反应和/或其他参数而变化，这些参数可由医师或其他人医学专业人士评估。可通过吸入、鼻内和/或气管内滴药(intratracheal installation)/冲洗递送的经修饰的微生物的示例剂量包括约10至约10

本文所述的经修饰的微生物可与其他治疗剂组合使用以治疗肺部状况。可与经修饰的微生物组合使用的其他治疗剂的实例包括但不限于抗生素、抗真菌剂、噬菌体、肽、酶、糖、含糖聚合物(glycopolymer)、细菌素、益生菌、抗体和孢子。例如，可以通过同时或顺序施用经修饰的微生物与一种或多种额外的治疗剂组合来实现协同或累加效应。可以在施用经修饰的微生物之前、同时或之后施用额外的治疗剂。

在一些实施方案中，可以在经修饰的微生物之前施用额外的治疗剂。这方面的一个实例是施用一种或多种抗生素(例如，阿莫西林和克拉维酸、氯唑西林(cloxacillin)和克拉维酸、氯唑西林和双氯西林(dicloxacillin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢地尼(cefdinir)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)、头孢呋辛(cefuroxime)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)和甲氧苄啶(trimethoprim)、红霉素/磺胺异噻唑(sulfisoxazol)、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、四环素、强力霉素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、替加环素(tigecycline)、万古霉素(vancomycin)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meripenem)、clistimethate/粘菌素(colistin)、甲氧西林、苯唑西林(oxacillin)和萘夫西林(nafcillin)、cabenicillin、替卡西林(ticarcillin)、哌拉西林(piperacillin)、美洛西林(mezlocillin)和阿洛西林(azlocillin)、替卡西林(ticarcillin)和克拉维酸、哌拉西林和他唑巴坦(tazobactam)、头孢氨苄、头孢地尼、头孢丙烯和头孢克洛、头孢吡肟(cefepime)、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、克拉霉素和阿奇霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南和利奈唑胺(linezolid))或噬菌体，以从肺部清除不需要的微生物，然后施用一剂量或多剂量经修饰的微生物以防止进一步感染。另一个实例是施用抗生素诸如妥布霉素以清除微生物感染的原发感染，诸如铜绿假单胞菌，然后施用一剂量或多剂量经修饰的微生物以防止感染的慢性化。在一些实施方案中，额外的治疗剂可以与经修饰的微生物施用同时施用。

组合物

提供了包括一种或多种如本文所述的经修饰的微生物的组合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物，并且包括至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括载体分子。

在一些实施方案中，将组合物与能动的(motile)生物体(或以其他方式优化用于靶向感染)一起配制以递送至其被施用的个体内的期望作用部位。例如，组合物可以配制用于鼻施用。

在一些实施方案中，组合物配制用于递送至其被施用的个体内的期望作用部位。例如，该组合物可以配制用于施用于肺中的大气道和小气道，或细支气管中。

当用作药物时，即用于治疗或预防肺部状况，本文所述的组合物通常以药物组合物的形式施用。此类组合物可以以制药领域熟知的方式制备并且包括至少一种活性化合物，即，如本文所述的经修饰的微生物。

通常，组合物以药学有效量施用，即治疗或预防有效量。实际施用的活性剂，即本文所述的经修饰的微生物的量通常由医生根据相关情况确定，包括待治疗的状况、选择的施用途径、施用的经修饰的微生物的活性、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度等。

药物组合物可以通过多种途径施用，包括吸入、鼻内或气管内滴注。取决于预期的递送途径，药物组合物优选配制成干粉组合物或溶液。

用于吸入施用的组合物可以采用散装液体溶液或悬浮液，或散装粉末的形式。然而，更常见的是，组合物以单位剂型存在以促进精准给药。典型的单位剂型包括预装填的、预先计量的安瓿或液体组合物的注射器、在固体组合物的情况下的明胶胶囊、箔-箔泡罩(foil-foil blister)或计量药物储库等。在此类组合物的一些实施方案中，活性剂，即如本文所述的经修饰的微生物，可以为次要组分(按重量计约0.1％至约50％，或约1％至约40％)，其余为各种媒介物或载体和有助于形成所需的剂型的加工助剂。

适合吸入施用的液体形式可以包括合适的水性或非水性媒介物，其具有缓冲剂、悬浮剂和分散剂、着色剂、调味剂等。固体形式可以包括，例如，任何以下成分，或类似性质的化合物：赋形剂，诸如半乳糖或甘露糖。

在一些实施方案中，为了配制成用于本文所述方法中的剂型，可以将经修饰的微生物冻干(例如，冷冻干燥)，然后以粉末形式与其他成分混合在一起以增加蛋白质产量或生存力、延长保质期和优化产品参数。在一些实施方案中，这些成分包括：水；盐类；糖，诸如单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、纤维二糖、麦芽糖、海藻糖)、三糖(例如棉子糖、松三糖、麦芽三糖)，和/或低聚糖(例如淀粉、糖原、纤维素、木聚糖、低聚果糖(fructooligosaccharide)、菊粉)；糖醇(例如木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、丙三醇)。

用于药物组合物的上述组分仅仅是代表性的。其他材料以及加工技术等在Remington’s

试剂盒

提供了用于如本文所述的治疗肺部状况的方法中的试剂盒。例如，试剂盒可以包括一单位剂量或多单位剂量的如本文所述的经修饰的微生物。可以将经修饰的微生物配制成药物组合物，例如，以一种或多种治疗或预防有效量的待治疗的肺部状况，例如，以一种或多种剂型。任选地，提供了在本文所述的方法中使用和/或施用，例如吸入或鼻内施用组合物的使用说明书。

如本文所述的试剂盒的使用说明书可以以印刷形式或电子介质形式(例如CD或DVD)提供，或以可以获得此类使用说明书的网址或移动应用的形式提供。

可以以合适的包装提供试剂盒。如本文所用，“包装”是指通常用于系统中并且能够将适用于本文所述方法的组合物保持在固定限度内的固体基质或材料。此类材料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料和塑料箔层压封套(laminated envelope)等。如果采用电子束灭菌技术，包装应具有足够低的密度以允许对内容物进行灭菌。

以下实施例旨在说明而非限制本发明。

实施例

使用先前描述的方法(美国专利号9,765,358)产生经修饰的微生物。经修饰的微生物LH1起源于对德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)分别应用代谢(蛋白质)和大气(氧气)压力源的过程。这产生了LH1，其具有代谢8种新碳水化合物的能力，同时保留厌氧呼吸。

简而言之，将亲本培养物(枯草芽孢杆菌和LH1)混合在一起并过滤到无菌硝酸纤维素0.2μm过滤器上。然后用10ml无菌PBS通过注射器洗涤过滤器。将过滤器倒置在脱氧的M9海藻酸(alginate)平板上。将平板在厌氧室内37℃下培养72小时。

培养后，将来自每种条件的过滤器放入1.5ml微量离心管内的1ml PBS中。将含有过滤器的微量离心管涡旋，然后在8000RFC下旋转减慢10分钟。将细胞沉淀重悬在PBS中并铺入两个新鲜的厌氧M9 NB平板上。平板在厌氧室中培养96小时。没有看到菌落，因此将平板移至需氧培养箱中16小时以萌发任何孢子。

需氧培养16小时后检查平板的菌落。然后将单个菌落在M9 NB需氧平板上重新划线并在4小时后移入厌氧室(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)亲本需要4小时的氧气暴露以从孢子形式发芽)。对于菌落厌氧培养24至120小时后检查平板。

10个菌落在48小时内生长。分析了所有经修饰的微生物针对假单胞菌的细菌素活性、厌氧生长、碳水化合物代谢概况、海藻酸裂解酶的产生、蛋白酶和粘蛋白酶的产生。这十种经修饰的微生物中的三种在形成孢子前可以增加四到八倍(F2BH1、F2BH2、F2BH3)，且其中两种菌株还获得了针对假单胞菌(Pseudomonas)的细菌素(F2BH2、F2BH3)。

图1显示了F2BH2(上部2个斑块)和F2BH3(下部2个斑块)，显示为白色斑块，在48小时时针对平板上散布的铜绿假单胞菌的荧光素酶产生菌株的清除厌氧细菌素活性；来自IVIS机器中生物发光的图片。与野生型德氏乳杆菌(L.delbrueckii)亲本(其白色斑块和清除率显示细菌素活性)相比，野生型枯草芽孢杆菌(B.subtilis)亲本不显示针对假单胞菌(Pseudomonas)的厌氧活性。经修饰的微生物BH3起源于对德氏乳杆菌(L.delbrueckii)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)分别应用代谢(蛋白质)和大气(氧气)压力源的过程。这产生了BH3，其具有代谢一种新碳水化合物的能力，同时保留有氧呼吸、海藻酸裂解酶和粘蛋白酶活性。与保留其德氏乳杆菌(L.delbrueckii)亲本杀菌活性的LH1相比，这种经修饰的微生物BH3针对假单胞菌显示出最小的厌氧活性(4个小清除点)。

将生长在经修饰的BHI中的20μl体积的过夜需氧培养物滴在海藻酸钠平板上。图2描述了使用含有已用碘染色的海藻酸钠的平板产生海藻酸裂解酶。碘与海藻酸钠结合并显示出已被海藻酸裂解酶降解的清除区。从野生型乳杆菌(Lactobacillus)亲本中未观察到海藻酸裂解酶活性，但在野生型芽孢杆菌(Bacillus)亲本中存在海藻酸裂解酶产生。第一轮修饰后，产生了一种经修饰的微生物(LH1)，且未显示海藻酸裂解酶活性。另一种经修饰的微生物(BH3)保留了海藻酸裂解酶产生。在所有三种经二次修饰的微生物F2BH1、F2BH2和F2BH3中都观察到海藻酸裂解酶产生。

菌株在经修饰的BHI中有氧生长过夜，并将20μl滴在0.3％的粘蛋白平板的中心。将平板在0.1％酰胺黑的3.5M乙酸中浸泡30分钟，然后用1.2M乙酸洗涤。在37℃需氧培养24小时后，在菌落周围观察到粘蛋白裂解区(脱色晕圈(halo))。图3显示了野生型芽孢杆菌、BH3和所有三种经二次修饰微生物F2BH1-3显示粘蛋白降解。

在37℃下厌氧培养48小时后，使用Biomerieux的api 50 CH测试测定菌株的厌氧碳水化合物代谢。如图4所示，野生型芽孢杆菌亲本在厌氧条件下没有显示碳水化合物代谢。BH3仅显示乳糖代谢，而F2BH1-3显示出不同水平的厌氧碳水化合物代谢，其中F2BH2表明在厌氧条件下针对经修饰的形态学枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的微生物代谢的最多数量的碳水化合物。

经修饰的细菌菌株产生具有抗病原菌抗菌活性的代谢物和细菌素。在经修饰的交叉划线测定(cross-streak assay)中证明了针对药物抗性病原体的抗菌活性。对于经修饰的交叉划线测定，经修饰的微生物(LH1或野生型乳杆菌亲本)在BHIL液体培养基中过夜生长，并在适应厌氧条件的BHIL琼脂上划单线。在从ARBank(CDC)获得的病原菌株和对照细菌垂直于经修饰的微生物交叉划线并在有氧条件下生长24小时之前，将平板在37℃下厌氧培养48小时。用卡尺测量与病原菌生长受到抑制的经修饰的微生物生长的距离(mm)并标准化为对照。

表I显示了示例性细菌，显示了对经修饰的微生物(LH1)的敏感性。

表I.对活的生物治疗剂LH1细菌素敏感的示例性细菌。

注意，通过经修饰的交叉划线测定测量的抗菌活性在抑制已知与导致疾病的感染或定植相关的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长方面具有广泛的范围。交叉划线测定的实例如图5所示，其中顶部的对照菌株(甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus))对LH1细菌素具有抗性，其在厌氧生长48小时后扩散到琼脂中，而来自于CDC AR Bank(AR0562-AR0568)的多药抗性的金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株很敏感，并测量和记录了与LH1的距离。表II显示了关于敏感性的LH1

表II.LH1的抗生素敏感性。

抗菌活性在抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长方面具有广泛的范围。抗生素敏感性表明对一种关键抗生素(妥布霉素)的先天抗性，该抗生素可以在肺部感染期间共同施用，但对大多数抗生素很敏感。

在类似的定性分析中，滴落测定(drop test)用于表明经修饰的微生物抑制荧光铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)生长的能力。在另一个滴落测定中(顶部两滴细菌，底部两滴过滤上清液)证明了LH1活细胞和/或过滤上清液对生长的抑制(图1)。另一个滴落测定显示了含有在厌氧生长24小时内积累的代谢物的LH1和乳杆菌亲本菌株上清液对金黄色葡萄球菌CF临床分离株生长的抑制区(图7)。芽孢杆菌亲本菌株在有氧生长24小时后没有显示出抑制区。

在额外的滴落测定中，全细胞粗提取物显示LH1针对铜绿假单胞菌(图8)和金黄色葡萄球菌(图9)的抗菌活性与亲本菌株相比，LH1中CF临床分离株增加。对3kDa过滤粗提取物的进一步滴落测定表明，大约10kDa的分泌蛋白负责对金黄色葡萄球菌CF分离株增加的抗菌活性(图10)。

还在浮游状态下测试了体外抗菌活性。铜绿假单胞菌菌株PA01(2x10

研究了经修饰的微生物(LH1)去除厌氧铜绿假单胞菌生物膜的能力。将碳青霉烯(carbapenem)抗性的铜绿假单胞菌临床分离株(AR0243；CDC ARBank)培养物按1:1000接种在LB液体培养基中并生长至对数中期，然后离心并重悬于等体积的LBN培养基(含10g/L硝酸盐的LB)中，且生物膜在厌氧条件下在96孔组织培养板中在37℃下静态生长3天。用PBS洗涤生物膜以去除非贴壁细胞，然后用LH1处理4小时。用PBS洗涤处理过的生物膜以去除非贴壁细胞并用1％结晶紫染色剂染色30分钟。用PBS洗涤后，将乙醇放入孔中5分钟，然后去除并置于新的96孔板中。测量OD600以量化剩余的生物膜。

图12显示经修饰的微生物可有效去除厌氧环境中的碳青霉烯抗性铜绿假单胞菌临床分离株。4小时后，与PBS对照相比，用10

LH1在CF粘蛋白培养基和CF唾液中的生长。CF粘蛋白培养基以约10

为了检查CF唾液中LH1的活性，将来自4-5名CF受试者的合并唾液按1:2唾液：PBS(w/v)稀释，并通过珠磨匀浆。在厌氧时间杀灭测定(anaerobic time-kill assay)中用LH1处理等分试样。将处理过的唾液铺入金黄色葡萄球菌选择性培养基(Vogel-Johnson Agar)上以进行活菌计数。

在类似的研究中，使用乙酸乙酯在生长4天后获得100X浓缩LH1废培养基的粗提取物。将提取物以1:10的比例稀释到唾液中并培养长达2小时。提取物也被稀释，并以1:2和1:100的比例将10μl放入空白抗生素测试盘中，然后放置在用0.5MacFarland铜绿假单胞菌(AR0243)划线用于菌苔(lawn)生长的平板上。将具有粗提取物盘(和5％二甲亚砜对照，DMSO)的平板在37℃下培养过夜。

全基因组测序用于鉴定支持LH1的经修饰的抗菌和代谢活性的遗传变异。鉴定了两种可追踪且稳定的遗传修饰。引物Perm03-F(5’-GCCGCCATAAAGCAAATGATCA-3’)(SEQ IDNO:1)和Perm01-R(5’-AGCCATCATGAACCGTCTCTTC-3’)(SEQ ID NO:2)以及OneTaq热启动DNA聚合酶(NEBiolabs)被用于在药物/代谢物转运蛋白(DMT)超家族的通透酶中扩增该区域，显示含有一种遗传修饰(T缺失)。该PCR工具用于验证在60多代传代后获得的10个单菌落中遗传修饰的稳定性。来自10个菌落的PCR产物被纯化并送去进行Sanger测序。

图14显示LH1在4小时后继续在CF粘蛋白培养基中生长，导致在接种10

与LH1的粗提取物一起培养显示在1小时内完全根除金黄色葡萄球菌(从10

全基因组测序显示，LH1在药物/代谢物转运者(DMT)超家族的通透酶基因中具有缺失，其导致移码，从而导致新蛋白质的表达，并负责增加对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。这种新蛋白质被表征并显示为10.2kDa，具有可能的分泌信号肽前导，pH 11.87的等电点，生理pH下的净正电荷(13)和表明水溶性较差的亲水性概况(图19、20)。新蛋白质序列的进一步表征还表明存在可能促进蛋白质分泌的前导序列和净正电荷，其被吸引并掺入带负电荷的细菌膜中(图19)。第二个基因变化是PTS、果糖特异性转运者亚基IIC中的点突变；取代(A>G)导致延伸ORF的5'端的基因间区域中的终止密码子丢失。这可能有助于改变代谢活性，但仍有待充分表征。

在传代超过60代后，使用PCR扩增10个单独菌落的经修饰的通透酶区域。对这些PCR产物进行测序并发现其保留了遗传修饰，表明遗传变化是稳定且可追踪的(图21)。

在常规临床实践中从7名囊性纤维化患者中获得唾液样本，将其合并，按1:2唾液：PBS(w/v)稀释，并通过珠磨匀浆。将100μL体积的合并唾液放入微量离心管中，并用10

未经处理的唾液样品不能流动(pour)，但经活的生物治疗剂粗提取物处理的唾液可流动，如图22所示。用活的生物治疗剂(LH1)处理显示能够降低囊性纤维化唾液的粘度。

活的生物治疗剂(经修饰的微生物)的安全性概况是一个重要的考虑因素。最初的体内研究使用小鼠模型来提供初步评估。在鼻内以10

在小鼠肺感染模型中这项急性安全性研究表明，F2BH2以10

体外细胞培养方法用于检查经修饰的微生物对癌症免疫应答的影响。用活的生物治疗剂(如本文所述的一种或多种经修饰的微生物)处理以评估处理后的宿主响应。

动物模型用于检查疾病和炎症的生物标志物。在肺部处理后评估用活的生物治疗剂(如本文所述的一种或多种经修饰的微生物)处理以减少肺部炎症和疾病标志物。

动物模型用于检查受感染动物肺部感染的减少。在肺中处理后评估用活的生物治疗剂(如本文所述的一种或多种经修饰的微生物)处理以减少肺中的感染。

动物模型用于检查在健康和患病动物的肺/鼻窦中长期使用活的生物治疗剂的安全性。在肺或鼻窦中处理后评估用活的生物治疗剂(如本文所述的一种或多种经修饰的微生物)处理以显示在肺中安全使用。

在健康和患病动物的肺/鼻窦中使用活的生物治疗剂(如本文所述的一种或多种经修饰的微生物)后，使用动物模型来检查对肺、鼻窦和口咽以及胃肠道(GI)微生物组的影响。在肺或鼻窦中处理后，评估用活的生物治疗剂治疗显示的出对微生物组的影响。

尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对上述发明进行了一些详细的描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离所附权利要求中描述的本发明的精神和范围的情况下实施某些改变和修改。因此，该描述不应被解释为限制本发明的范围。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的并在相同程度上通过引用整体并入本文，就像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入一样。