金络合物与奥拉帕尼或其他PARP1/2抑制剂的组合用于治疗耐所述PARP1/2抑制剂的癌症的用途

摘要

本申请涉及用于治疗耐已知疗法的癌症的金络合物。在一些实施方式中，所述癌症耐第一PARP抑制剂和/或所述金络合物与第二PARP抑制剂组合使用。

说明书

本发明涉及癌症，并且尤其涉及用于治疗、预防或减轻癌症的新组合物、疗法和方法。

癌细胞的特征在于基因组不稳定性，这主要源于活性氧/氮物质(“ROS”)、电离辐射、化疗剂和偶然的基因突变产生的DNA损伤。因此，DNA损伤是许多癌症治疗的直接和间接目标。

真核细胞已经发展出复杂的信号传导-转导机制-DNA损伤应答(“DDR”)，其可维持细胞基因组的完整性。DDR可以检测DNA损伤并且修复它们，和/或暂时和永久地抑制细胞周期，和/或促进细胞死亡。参与DDR的基因的异常修复机制和突变促进了人癌症的出现、发展和进展。

不幸的是，对药物疗法的固有或获取的耐性仍然是不可避免的挑战。数个特征，比如肿瘤的细胞组成、肿瘤微环境和药物效率导致肿瘤细胞通过与健康细胞在不利条件下生存所利用的相同机制压制了药物治疗。

多ADP核糖聚合酶(PARP)修复损伤的DNA。与普通细胞相比，数种形式的癌症更取决于PARP，这使得PARP成为用于癌症疗法的有吸引力的目标。迄今为止，FDA批准的唯一一类抑制DDR的癌症疗法是PARP抑制剂(PARPis)。批准的PARPis包括奥拉帕尼(商标名LYNPARZA(AZ和Merck))、尼拉帕尼(商标名ZEJULA(GSK))、鲁卡帕尼(商标名RUBRACA(Clovis Oncology))和他拉唑帕尼(商标名TALZENNA(Pfizer))。第一个获得批准、研究最多和使用最多的PARPi是奥拉帕尼(2014年首次获得FDA批准)。

PARPis抑制DNA单链断裂(SSB)修复过程-DDR的一个关键组成部分。SSB的抑制可导致DNA双链断裂(DSB)。如果SSB修复被抑制，则癌细胞变得更加依赖这种DSB修复过程。如果这种DSB修复过程失活(例如，由于基因突变)，则可出现细胞凋亡(细胞死亡)。

PARPis被批准用于治疗各种类型的卵巢癌和乳腺癌患者(根据患者的遗传亚型和疾病进展状态)。前列腺癌、肺癌和胰腺癌等的后期临床研究也在进行中。

对PARPi疗法的耐性是重要并且日益增加的临床问题。特别是，复发性肿瘤可比原始肿瘤更具侵袭性。

每个获批的PARPi对于DNA单链断裂修复抑制具有相同的作用机制。这称为“PARP捕获”机制，由此PARPi药物与PARP1的催化结构域结合，而PARP1附接至DNA损伤。不需要抑制PARP酶家族的其他成员。

由于现有的PARPis具有相同的作用机制并且可能具有相同的耐药机制，因此对一种PARPi具有耐性的临床病例可已经对所有其他批准的PARPis表现出耐性。因此，PARPi耐性已被证实为临床上的一个主要问题。

本发明源于发明人尝试克服与现有技术相关的问题的工作。

根据第一方面，提供了用于治疗耐已知癌症疗法的癌症的金络合物。

有利地，发明人已经发现金络合物令人吃惊地有效治疗耐已知疗法的癌细胞。

在第二方面中，提供了治疗、预防或减轻受试者中耐已知癌症疗法的癌症的方法，方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的金络合物。

金络合物可为式I、式II、式III、式IV或式V的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或多晶型：

其中R

R

R

R

可理解的是，上述化合物中的原子可被其同位素取代，并且该化合物仍将落入该式的范围内。例如，上述结构之一中的氢可被氘取代，并且这种化合物将落入相关式的范围内。

优选地，金络合物为式(I)的化合物。

式(I)的化合物可为式(Ia)的化合物：

优选地，R

优选地，R

R

R

在一个实施方式中，R

在可选的实施方式中，R

因此，金络合物可为金诺芬或金硫葡糖或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或多晶型。

可理解的是，金诺芬和金硫葡糖具有如下结构：

术语“药学上可接受的盐”可理解为指本文提供的化合物的任何盐，其保留了化合物的生物学特性并且是无毒的或另外对于药物用途为不是非期望的。这种盐可衍生自本领域公知的多种有机和无机抗衡离子。这种盐包括，但不限于：(1)与如下的有机或无机酸形成的酸加成盐，比如盐酸、溴化氢、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、腺苷酸、天冬氨酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、已酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-庚-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂酰基硫酸、葡糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、黏糠酸等酸；或(2)当母体化合物中存在的酸质子(a)被金属离子，例如碱金属离子、碱土离子或铝离子、或碱金属或碱土金属氢氧化物，比如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌和氢氧化钡、铵取代时，或(b)当与有机碱，比如脂族胺、脂环族胺或芳族有机胺，比如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、N-甲基葡萄糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、四甲基铵盐氢氧化物等配位时形成碱加成盐。

药学上可接受的盐可以包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等，并且当化合物含有碱性官能团时，无毒有机或无机酸的盐，比如氢卤化物，例如盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；碳酸盐或碳酸氢盐、硫酸盐或硫酸氢盐、硼酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、糖二酸盐、硬脂酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、乙醇酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、右旋樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环磺酸盐、苯甲酸盐、羟乙基磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、月桂酸盐、甲磺酸盐(甲磺酸盐)、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、乙磺酸盐、1,2-乙二磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、苯磺酸酯(苯磺酸盐)、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基双环[2.2.2]-庚-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔乙酸丁盐、月桂酰基硫酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、氨基磺酸环己盐、奎尼酸盐、黏糠酸盐、昔萘酸盐(xinofoate)等。

也可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐。

术语“溶剂化物”可理解为指本文提供的化合物或其盐，其进一步包括通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的溶剂。当溶剂为水时，溶剂化物为水合物。

癌症可为实体瘤或实体癌。癌症可为血癌、肠癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。血癌可为骨髓瘤。肠癌可为结肠癌或直肠癌。脑癌可为神经胶质瘤或胶质母细胞瘤。乳腺癌可为BRCA阳性乳腺癌。乳腺癌可为HER2阳性乳腺癌或HER2阴性乳腺癌。乳腺癌可为三阴性乳腺癌。肝癌可为肝细胞癌。肺癌可为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。皮肤癌可为黑色素瘤。

癌症可为耐第一PARP抑制剂的治疗的癌症。患者可之前已经接受过第一PARP抑制剂治疗。第一PARP抑制剂可为第一PARP1抑制剂。第一PARP1抑制剂可为硫代苹果酸金盐、金硫葡糖(ATG)、鲁卡帕尼、奥拉帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼、帕米帕利、2X-121或金诺芬。优选地，第一PARP1抑制剂为鲁卡帕尼、奥拉帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼或帕米帕利。在一些实施方式中，第一PARP1抑制剂为奥拉帕尼。

已知当用PARP抑制剂治疗患有癌症的患者时，癌症可对PARP抑制剂产生耐性，从而降低了后续治疗的效果。本发明人已经发现，可用金络合物治疗耐PARP抑制剂(例如，奥拉帕尼)治疗的癌细胞。

金络合物可与第二PARP抑制剂组合使用。第二PARP抑制剂可与第一PARP抑制剂相同或不同。第二PARP抑制剂可为第二PARP1抑制剂。第二PARP1抑制剂可为硫代苹果酸金盐、金硫葡糖(ATG)、鲁卡帕尼、奥拉帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼、帕米帕利、2X-121或金诺芬。优选地，第二PARP1抑制剂是鲁卡帕尼、奥拉帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼或帕米帕利。在一些实施方式中，第二PARP1抑制剂为奥拉帕尼。

因此，方法可包括向有需要的受试者施用金络合物和第二PARP抑制剂。

如实施例中描述的，发明人惊奇地发现金络合物和第二PARP抑制剂的组合具有协同作用。

金络合物可在第二PARP抑制剂之前、之后或同时使用。

因此，金络合物和任选地第二PARP抑制剂可与化疗药物(或本文描述的多种化疗药物的组合)组合使用。化疗药物可包括博莱霉素、卡培他滨、卡铂、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、多西他赛、多柔比星、表柔比星、艾日布林、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、吉西他滨、甲氨蝶呤、氮芥、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松龙、甲基苄肼、长春碱、长春新碱和/或长春瑞滨。金络合物和任选地第二PARP抑制剂可在化疗药物之前、之后或同时使用。在优选的实施方式中，金络合物和任选地第二PARP抑制剂在化疗药物之后使用。

可选地或另外地，金络合物和任选地第二PARP抑制剂可与损伤DNA或干扰DNA损伤应答过程(DDR)的药物组合使用。因此，金络合物和任选地第二PARP抑制剂可与ATM抑制剂、ATR抑制剂、检查点抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂或wee1抑制剂组合使用。检查点抑制剂可为编程细胞死亡蛋白1(PD-1)抑制剂、编程死亡配体1(PD-L1)抑制剂或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)抑制剂。

可选地或另外地，金络合物和任选地第二PARP抑制剂可与损伤DNA的电离辐射结合使用。

金络合物和任选地第二PARP抑制剂可组合成具有多种不同形式的组合物，尤其取决于组合物的使用方式。因此，例如，组合物可为可被施用于需要治疗的人或动物的粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳霜、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液或任何其他合适的形式。应当理解，根据本发明的药物载体应为被给予它的受试者良好耐受的载体。

可以以许多方式使用本文描述的包括金络合物和任选地第二PARP抑制剂的药物。包括金络合物和任选地第二PARP抑制剂的组合物可通过吸入(例如，鼻内)施用。组合物也可配制用于局部使用。例如，可将乳膏或软膏施加至皮肤上。

根据本发明的金络合物和任选地第二PARP抑制剂也可并入缓释或延迟释放装置中。例如，这种装置可插入皮肤上或皮肤下，并且药物可以在数周甚至数月内释放。装置可至少位于治疗部位附近。当需要用根据本发明使用的金络合物和任选地第二PARP抑制剂进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如，至少每天注射)时，这种装置可特别有利。

根据本发明的金络合物和任选地第二PARP抑制剂以及组合物可通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位，例如注射至癌性肿瘤或与其相邻的血流中而施用至受试者。注射可为静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)、皮内(推注或输注)或肌内(推注或输注)。

在优选的实施方式中，口服施用金络合物和任选地第二PARP抑制剂。因此，金络合物和任选地第二PARP抑制剂可包含在例如可以以片剂、胶囊或液体形式口服摄取的组合物中。

应当理解，所需的金络合物和任选地第二PARP抑制剂的量由其生物活性和生物利用度决定，这又取决于施用方式、金络合物以及任选地第二PARP抑制剂的理化性质，以及它是用作单药疗法还是用于组合疗法。施用频率也将受到金络合物和任选地第二PARP抑制剂在被治疗的受试者体内的半衰期的影响。待施用的最佳剂量可由本领域技术人员确定，并且将随着特定的金络合物和特定任选地第二PARP抑制剂、药物组合物的强度、施用方式和癌症的进展而变化。取决于待治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、膳食和施用时间。

可在待治疗的癌症发作之前、期间或之后施用金络合物和任选地第二PARP抑制剂。可单次施用日剂量。然而，优选地，一天给予金络合物和任选地第二PARP抑制剂两次或更多次，那我最优选每天两次。

通常，在0.01μg/kg体重和500mg/kg体重之间的金络合物和任选地第二PARP抑制剂的日剂量可用于治疗、减轻或预防癌症。更优选地，日剂量在0.01mg/kg体重和400mg/kg体重之间，更优选在0.1mg/kg和200mg/kg体重之间，并且最优选地在大约1mg/kg和100mg/kg体重之间。

接受治疗的患者可在醒来时服用第一剂，并且然后在晚上(如果采用双剂量方案)或此后间隔3小时或4小时服用第二剂。可选地，可使用缓释装置向患者提供最佳剂量的金络合物和任选地第二PARP抑制剂，而不需要重复的给药。

可使用例如制药工业常规采用的已知方法(例如，体内实验、临床试验等)来形成包括根据本发明的金络合物和任选地第二PARP抑制剂的具体制剂以及精确的治疗方案(比如，金络合物和任选地第二PARP抑制剂的每日剂量，以及施用频率)。发明人认为他们首次描述了基于金络合物和第二PARP抑制剂治疗癌症的药物组合物。

因此，在本发明的第三方面中，提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包括(i)金络合物、(ii)第二PARP抑制剂和(iii)药学上可接受的载体。

药物组合物可用于癌症受试者中的治疗性缓解、预防或治疗。

金络合物和第二PARP抑制剂可为如结合第一方面和第二方面所限定的。

在第四方面中，本发明还提供了制备根据第三方面的组合物的方法，方法包括使治疗有效量的(i)金络合物、(ii)第二PARP抑制剂和(iii)药学上可接受的载体接触。

“受试者”可为脊椎动物或哺乳动物。最优选地，受试者为人。

所述金络合物和任选地第二PARP抑制剂的“治疗有效量”为当施用至受试者时治疗癌症需要的药物量的任何量。

例如，每天使用的金络合物和任选地第二PARP抑制剂的治疗有效量可为约0.01mg至约2,000mg，并且优选地约0.1mg至约1,000mg。

可理解的是，确切的剂量可能取决于提供的金络合物。此外，在金络合物与PARP抑制剂一起使用的实施方式中，PARP抑制剂的剂量可取决于选择的PARP抑制剂。

例如，金诺芬可以以0.01mg至100mg之间，更优选地0.1mg至50mg之间或0.5mg至25mg之间，并且最优选地1mg至15mg之间或4mg至10mg之间的日剂量提供。例如，金诺芬可以以6mg/天的日剂量施用，或者以6毫克的单次日剂量或每天两次的3毫克剂量施用。此外，在6个月后增加至9mg/天的每日剂量，其可以作为三次单独的3毫克剂量提供。

可选地，金硫葡糖可以5mg和1000mg之间的月剂量提供，更优选地10mg至500mg之间的月剂量，更优选地20mg和200mg之间的月剂量。例如，金硫葡糖可作为初始10mg IM(肌内)测试剂量施用，并且观察患者15分钟至30分钟的不良反应和/或过敏反应。然后可在一周后给予患者25mg IM的剂量，并在一周后给予另一剂25mg IM的剂量。然后患者可维持每周一次50mg IM，直到达到0.8G至1G的累积剂量。如果记录到了临床反应，则剂量可能会减少到每三到四周肌肉注射50mg的维持剂量。基于该患者对金硫葡糖的反应和耐受性，该维持剂量可以无限期地继续。

PARP抑制剂的期望剂量可有很大变化，并且取决于选择的PARP抑制剂。合适的日剂量将是技术人员已知的。

例如，奥拉帕尼可以以10mg和1,600mg之间，更优选地100mg和1,200mg之间或300mg和1,000mg之间，最优选地400mg和800mg之间的日剂量施用。奥拉帕尼可每天施用两次，例如以200mg、300mg或400mg的剂量，每日给予两次。

尼拉帕尼可以以1mg和1,000mg之间，更优选地50mg和500mg之间或100mg和400mg之间，最优选地230mg和350mg之间的日剂量施用。奥拉帕尼可每天施用一次，例如以300mg的剂量。

最后，他拉唑帕尼可以以0.01mg和10mg之间，更优选地0.05mg和5mg之间或0.1mg和2mg之间，以及最优选地0.25mg和1mg之间的日剂量施用。

本文所指的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。

在一个实施方式中，药学上可接受的载体可为固体，并且组合物可为粉末或片剂的形式。固体药学上可接受的载体可包括一种或多种物质，这些物质也可以用作调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填料、助流剂、压缩助剂、惰性粘结剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂崩解剂。载体也可为封装材料。在粉末中，载体为与根据本发明的精细活性剂(即，金络合物和任选地第二PARP抑制剂)混合的精细固体。在片剂中，金络合物和任选地第二PARP抑制剂可以以合适的比例与具有必要压缩特性的赋形剂混合并且压制成期望的形状和尺寸。粉末和片剂优选地包含高达99％的金络合物和任选地第二PARP抑制剂。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施方式中，药物载体可为凝胶并且组合物可为乳霜等的形式。

然而，药物载体可为液体，并且药物组合物为溶液形式。液体载体用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的金络合物和任选地第二PARP抑制剂可溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体，比如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体载体可包含其他合适的药物添加剂，比如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服和肠胃外施用的液体载体的适当例子包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇类(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，载体也可为油性酯，比如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物。用于加压组合物的液体载体可为卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。

作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和特别是皮下注射来利用。金络合物和任选地第二PARP抑制剂可制备为无菌固体组合物，其可在施用时使用无菌水、盐水或其他合适的无菌可注射介质溶解或悬浮。

本发明的金络合物和任选地第二PARP抑制剂以及组合物可以以含有其他溶质或悬浮剂(例如，足以使溶液等渗的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等的无菌溶液或悬浮液的形式施用。根据本发明使用的金络合物和任选地第二PARP抑制剂也可以以液体或固体组合物的形式口服施用。适用于口服施用的组合物包括固体形式，比如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂和粉剂，以及液体形式，比如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液和混悬液。

本文描述的所有特征(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合与任何上述方面组合，除非组合中的至少一些这样的特征和/或步骤是互斥的。

为了更好地理解本发明，并且显示了可如何实施本发明的实施方式，现将通过示例的方式参考附图，其中：

图1提供了显示(A)金诺芬、(B)奥拉帕尼、(C)尼拉帕尼和(D)他拉唑帕尼在不同浓度下抑制野生型A2780细胞的细胞增殖的能力的图表；

图2提供了显示(A)金诺芬、(B)奥拉帕尼、(C)尼拉帕尼和(D)他拉唑帕尼在不同浓度下抑制耐奥拉帕尼的A2780细胞的细胞增殖的能力的图表；

图3提供了显示金诺芬和奥拉帕尼的组合在不同浓度下抑制耐奥拉帕尼的A2780细胞的细胞增殖的能力的图表；

图4提供了显示金诺芬与(A)尼拉帕尼或(B)他拉唑帕尼的组合在不同浓度下抑制耐奥拉帕尼的A2780细胞的细胞增殖的能力的图表；

图5提供了显示(A)金诺芬和(B)奥拉帕尼在不同浓度下抑制耐奥拉帕尼的HCC1937细胞的细胞增殖的能力的图表；

图6提供了显示金诺芬和奥拉帕尼的组合在不同浓度下抑制耐奥拉帕尼的HCC1937细胞的细胞增殖的能力的图表；

图7为显示金硫葡糖(ATG)在不同浓度下抑制耐奥拉帕尼的A2780细胞的细胞增殖的能力的图表；和

图8提供了显示123.46nM浓度下的ATG与各种浓度的(A)奥拉帕尼、(B)尼拉帕尼和(C)他拉唑帕尼的组合抑制耐奥拉帕尼的A2780细胞的细胞增殖的能力的图表。

方法

制备耐奥拉帕尼的细胞

A2780卵巢癌细胞(野生型“WT”)在具有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养。

A2780细胞系是从卵巢子宫内膜样腺癌肿瘤建立的卵巢癌细胞系。建立A2780细胞系的患者在取出组织之前没有接受肿瘤治疗，并且因此细胞系没有暴露过任何抗癌药物或化学品。其通常用作模型来观察卵巢癌的各种化学品、递送方法和治疗的效果并且测试其效力。

为了获得耐奥拉帕尼的细胞，将细胞在补充有20μM奥拉帕尼的细胞培养基(具有10％FBS的RPMI 1640培养基)中培养1个月，以产生耐奥拉帕尼的A2780细胞(“R”)。一个月后，在使用前将细胞在补充有10μM奥拉帕尼的细胞培养基(具有10％FBS的RPMI 1640培养基)中连续培养并且最多两个月以保持耐性。

细胞接种

将细胞从烧瓶中收集到细胞培养基(具有10％FBS的RPMI 1640培养基)中，并且然后计数。用培养基稀释细胞，并且向384孔细胞培养板的各孔中添加40μL细胞悬浮液(1000个细胞/孔)。用盖子覆盖住板，并且在室温下放置30分钟而不摇动。然后将培养板转移至37℃和5％CO

化合物制备和处理

将测试化合物以30mM的浓度溶解在DMSO中以产生储备溶液。将45μL的储备溶液转移到384pp板中。通过使用TECAN(EVO200)液体处理器将15μL化合物溶液转移到30μL DMSO中，进行3倍10点稀释。然后将板在室温下以1,000RPM旋转1分钟。然后将40nL稀释的化合物从化合物源板转移到细胞板中。然后将细胞板盖上盖子并且置于37℃和5％CO

检测

将CellTiter

数据分析

抑制活性用下式计算：

抑制作用(％)＝100×(Lum

其中Lum

通过使用Xlfit(v5.3.1.3)，式201拟合曲线来计算IC

Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

结果

结果显示在表1至表4以及图1和图2中。

令人惊讶的是，相比于野生型细胞，金诺芬似乎是更好的耐奥拉帕尼的细胞的增殖的抑制剂，并且对两者均实现了100％的抑制。

同时，从以上提供的数据可以清楚地看出，耐奥拉帕尼的细胞也耐尼拉帕尼和他拉唑帕尼。这是由于在这种情况下所有三种抑制剂都发生了相同的耐药机制。因此，在这种情况下，将患者从奥拉帕利单药疗法转换为尼拉帕尼或他拉唑帕尼单药疗法不会成功的。

方法

方法如实施例1中描述。在每个测试中，用金诺芬和奥拉帕尼的组合处理细胞。金诺芬的浓度保持恒定，而奥拉帕尼的浓度是变化的。

所有测试进行一式三份，并且计算平均抑制作用。

数据分析

可使用Colby方法进行评估混合物中的协同作用或拮抗作用。

如果没有协同作用或拮抗作用，则使用该方法计算A和B混合物的预期结果(E)。

E可以使用下式计算：

E＝X+Y-XY/100

其中X是化合物A的观察结果，Y是化合物B的观察结果。如果观察到的值大于E，则这表明了协同作用。

结果

结果显示在表5和表6以及图3和表4中。

观察到的金诺芬和PARPi的组合的增殖抑制作用始终高于预期值。这表明金诺芬和PARPi的组合对耐奥拉帕尼的细胞表现出协同作用。

无法计算较低浓度的奥拉帕尼的预期值，因为无法进行测试以提供在这些浓度下作为唯一活性剂的奥拉帕尼的抑制百分比。但是，观察到的抑制作用仍然相对较高，表明在低至60pM奥拉帕尼的浓度下仍观察到协同作用。所观察到的值显著高于较低浓度的尼拉帕利和他拉唑帕尼的预期值，进一步证实了该结论。

由于不期望单独使用时耐PARPi的细胞显示出对与第二种活性剂结合的PARPi的敏感性，因此上述结果尤其令人惊讶。

方法

除使用HCC1937细胞系以外，方法如实施例1和实施例2中描述的一样。

HCC1937细胞系由具有生殖系BRCA1突变的24岁患者的原发性乳腺癌建立。其为三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系的一个示例。乳腺癌患者常规具有雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)的表达和估计的HER-2/Neu的扩增。这些标志物允许将乳腺癌肿瘤分为激素受体阳性肿瘤、HER-2/Neu扩增肿瘤以及不表达ER、PR并且不具有HER-2/Neu扩增的那些肿瘤。基于缺少这三种分子标志物，后一组被称为三阴性乳腺癌。TNBC约占所有乳腺癌的10％至15％，并且与其他亚型的乳腺癌相比，患有TNBC的患者具有较差的结果。

结果

结果显示在表7和表8以及图5和图6中。

与实施例2中观察到的结果相似，对于奥拉帕尼和金诺芬的组合也观察到了协同作用。值得注意的是，在使用浓度为10,000nM的奥拉帕尼的结果中没有观察到这种作用。然而，由于在较高和较低浓度的奥拉帕尼下均观察到了协同作用，因此认为这一结果最有可能是由于实验误差造成的。

因此，结果显示金诺芬和PARPi的组合可协同使用以抑制多种癌细胞系的增殖。

方法

除了使用金硫葡萄糖代替金诺芬以外，方法如实施例1和实施例2中描述的一样。

结果

奥拉帕尼、尼拉帕尼和他拉唑帕尼抑制耐奥拉帕尼的A2780卵巢癌细胞增殖的能力提供在表2中(上面)。同时，金硫葡萄糖(ATG)抑制这些细胞的能力提供在表9和图7中。

还研究了ATG与PARPi的组合的抑制剂效果，并且结果提供在表10和图8中。

再次，观察到了明显的协同作用。这表明协同作用不限于金诺芬，而是可延伸至与PARPi组合的其他金络合物。