调节M2巨噬细胞极化的方法及其在治疗中的用途

摘要

提供了治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M巨噬细胞比率的疾病或病症的方法。该方法包括：（a）在IL33和/或GM‑SCF的存在下培养嗜碱性粒细胞；和（b）在培养之后，向受试者施用治疗有效量的嗜碱性粒细胞，从而治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

说明书

本申请要求于2018年8月24日提交的美国临时专利申请号62/722,196的优先权，所述美国临时专利申请的内容在此整体引入作为参考。

在其一些实施方案中，本发明涉及调节M2巨噬细胞极化的方法及其在治疗中的用途。

哺乳动物组织由不同细胞类型组成，所述细胞类型包括：成纤维细胞、上皮、内皮和免疫谱系。在特定的环境背景下，胚胎发育过程中的组织形成需要不同细胞类型之间的协调功能和交叉对话。肺发育成专门的定型细胞类型是高度受调控的过程，其特征在于独特的途径和功能特性。平行地，免疫系统的细胞从造血部位迁移到肺，以便建立活性免疫区室，其与基质细胞相互作用，并且影响组织分化、生长和功能。

哺乳动物的肺是中央呼吸器官，特点在于不同组的专门细胞类型。肺中的气体交换在肺泡中发生，所述肺泡由专门的上皮细胞组成：介导气体交换的肺泡1型（AT）细胞、以及分泌表面活性物质并维持肺的表面张力的AT2细胞（Whitsett和Alenghat，2015）。肺泡上皮细胞在小管（E16.5）和囊状（E18.5）期从其共有的祖先分支，导致形态和基因表达中的急剧变化（Treutlein等人，2014）。另一个主要的细胞类型是肺泡巨噬细胞（AM），其清除来自肺泡腔的表面活性物质，并且充当重要的免疫调节剂，抑制肺中不需要的免疫应答（Hussell和Bell，2014）。AM源于胎儿肝胚胎前体，并且是自我维持的，没有来自成年骨髓的贡献（Epelman等人，2014；Hashimoto等人，2013；Murphy等人，2008；Shibata等人，2001）。肺巨噬细胞的第一波出现在胚胎日12.5（E12.5），随后为胎儿肝衍生的单核细胞起源的第二波，其在肺泡化为成熟AM的过程中继续其分化轴（Ginhoux，2014；Ginhoux和Jung，2014；Hoeffel和Ginhoux，2018；Kopf等人，2015；Tan和Krasnow，2016）。

每种组织且特别是肺中的免疫应答必须得到严格调控并适应其需求，因为异常的免疫活化可能引起组织损伤和病理状态，包括慢性炎症、纤维化和自身免疫应答。因此，每种组织都配备有独特的信号传导环境，其与免疫区室相互作用，并且塑造细胞的基因表达和染色质景观（Butovsky等人，2014；Cipolletta等人，2015；Cohen等人，2014；Greter等人，2012；Hussell和Bell，2014；Lavin等人，2014；Okabe和Medzhitov，2014；Panduro等人，2016；Yu等人，2017）。在肺背景下，AM显示出通过其基因表达和功能显而易见的组织特异性表型（Gautier等人，2012；Guilliams等人，2013b；Kopf等人，2015；Lavin等人，2014）。我们对肺泡化过程期间的动态信号传导的理解存在很大差距，因为使AM离体生长的尝试尚未成功（Fejer等人，2013）。肺巨噬细胞的发育和成熟显示为依赖于由上皮细胞（主要是AT2）、先天性淋巴细胞（ILC）和AM自身传递的不同生长和分化线索（de Kleer等人，2016；Guilliams等人，2013a；Saluzzo等人，2017；Yu等人，2017）。对肺中的其它肺驻留免疫和非免疫细胞类型的功能和交叉对话目前知之甚少。

嗜碱性粒细胞被认为是短命的粒细胞，其特征在于细胞质中的分叶核和分泌颗粒的存在。在它们进入并巡逻血液之前，它们在骨髓中完成其成熟。在病理条件如寄生虫感染和变应性病症下，嗜碱性粒细胞被募集并侵入组织实质（Min等人，2004；Mukai等人，2005；Oh等人，2007），并且其主要功能已主要归于在过敏反应中诱导Th2应答、以及在蠕虫感染后诱导IL-4分泌（Mack等人，2005；Min等人，2004；Sokol等人，2009；Sullivan和Locksley，2009；Tschopp等人，2006；Tsujimura等人，2008）。

因此，巨噬细胞极化的主动调节是抗炎和抗癌疗法开发中的一种方法。

另外的有关背景技术：

WO2016185026

EP3072525A1

WO2017097876

Wynn TA，Nat Rev Immunol. 2015 May；15（5）:271-82。

发明内容

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供了治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症的方法，该方法包括：

（a）在IL33和/或GM-SCF的存在下培养嗜碱性粒细胞；和

（b）在培养之后，向受试者施用治疗有效量的嗜碱性粒细胞，

从而治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了通过在IL33和/或GM-SCF的存在下培养而生成的治疗有效量的嗜碱性粒细胞，其用于治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据本发明的一些实施方案，嗜碱性粒细胞是血液循环的嗜碱性粒细胞或衍生自骨髓。

根据本发明的一些实施方案，该方法进一步包括在（a）之前：

（i）从骨髓或外周血中分离嗜碱性粒细胞；

（ii）在IL-3的存在下，从骨髓或外周血分化嗜碱性粒细胞，以便获得分化的培养物；

（iii）从分化的培养物中分离cKIT群体。

根据本发明的一些实施方案，（ii）在培养中执行8-10天。

根据本发明的一些实施方案，（a）执行长达48小时。

根据本发明的一些实施方案，执行培养，以便实现肺嗜碱性粒细胞表型。

根据本发明的一些实施方案，肺嗜碱性粒细胞表型包含选自以下的生长因子和细胞因子的表达：

根据本发明的一些实施方案，肺嗜碱性粒细胞表型包含

根据本发明的一些实施方案，肺嗜碱性粒细胞表型包含Fcera1

根据本发明的一些实施方案，嗜碱性粒细胞是人的。

根据本发明的一些实施方案，嗜碱性粒细胞包含Fcer1、Il13ra1、Itga2、Cd69、Cd244、Itgam、Cd63、Cd24、Il2ra、Il18rap和C3ar1的表达标记。

根据本发明的一些实施方案，嗜碱性粒细胞对受试者是自体的。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的选自IL6、IL13和HGF的信号传导分子，从而治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据本发明一些实施方案的一个方面，提供治疗有效量的选自IL6、IL13和HGF的信号传导分子，其用于治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据本发明的一些实施方案，治疗有效量增加了M1/M2巨噬细胞比率。

根据本发明的一些实施方案，受试者是人受试者。

根据本发明的一些实施方案，施用是以局部施用途径。

根据本发明的一些实施方案，施用是对于肺的。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症是炎性疾病。

根据本发明的一些实施方案，炎性疾病选自：脓毒病，败血病，肺炎，败血性休克，全身性炎性反应综合征（SIRS），急性呼吸窘迫综合征（ARDS），急性肺损伤，吸入性肺炎，感染，胰腺炎，菌血症，腹膜炎，腹腔脓肿，由于外伤的炎症，由于手术的炎症，慢性炎性疾病，缺血，器官或组织的缺血再灌注损伤，由于疾病的组织损伤，由于化学疗法或放射疗法的组织损伤，以及对摄入、吸入、输注、注射或递送的物质的反应，肾小球肾炎，肠感染，机会性感染，以及用于经历大手术或透析的受试者，免疫受损的受试者，服用免疫抑制剂的受试者，患有HIV/AIDS的受试者，患有疑似心内膜炎的受试者，具有发烧的受试者，具有不明原因发烧的受试者，患有囊性纤维化的受试者，患有糖尿病的受试者，患有慢性肾功能衰竭的受试者，患有支气管扩张的受试者，患有慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、肺气肿或哮喘的受试者，患有发热性嗜中性粒细胞减少症的受试者，患有脑膜炎的受试者，患有败血性关节炎的受试者，患有尿路感染的受试者，患有坏死性筋膜炎的受试者，患有其它疑似A组链球菌感染的受试者，进行了脾切除术的受试者，患有复发或疑似肠球菌感染的受试者，与感染风险增加相关的其它医学和外科状况、革兰氏阳性脓毒病、革兰氏阴性脓毒病、培养物阴性脓毒病、真菌性脓毒病、脑膜炎球菌血症、泵后综合征、心脏眩晕综合征、中风、充血性心力衰竭、肝炎、会厌炎、大肠杆菌0157:H7、疟疾、气性坏疽、中毒性休克综合征、先兆子痫、子痫、HELP综合征、分枝杆菌结核病、卡氏肺囊虫病、肺炎、利什曼病、溶血性尿毒综合征/血栓性血小板减少性紫癜、登革出血热、盆腔炎性疾病、军团菌、莱姆病、甲型流感、EB病毒、脑炎、炎性疾病和自身免疫性包括类风湿关节炎、骨关节炎、进行性系统性硬化、系统性红斑狼疮、炎性肠病、特发性肺纤维化、结节病、超敏性肺炎、系统性血管炎、韦格纳氏肉芽肿病，包括心脏、肝、肺、肾、骨髓的移植，移植物抗宿主病，移植排斥，镰状细胞性贫血，肾病综合征，试剂例如OKT3的毒性，细胞因子疗法，隐热蛋白（cryoporin）相关周期性综合征和肝硬化。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症是自身免疫性疾病。

根据本发明的一些实施方案，自身免疫性疾病选自艾迪生氏病、变态反应、斑秃、阿尔茨海默氏病、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征（休斯综合征）、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、自身免疫性疾病（例如狼疮、RA、MS、格雷夫斯病等）、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞氏病、伯格氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、乳糜泻/腹腔疾病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征（CFIDS）、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病（CIPD）、慢性复发性多发性神经病（格巴二氏综合征）、丘斯二氏综合征（CSS）、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病（CAD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、CREST综合征、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、特发性混合性冷球蛋白血症、埃文斯综合征、眼球突出、纤维肌痛、古德帕斯彻氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、IgA肾病、免疫增生性疾病或病症（例如牛皮癣）、炎性肠病（IBD）包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）、间质性肺病、青少年糖尿病、青少年关节炎、青少年特发性关节炎（JIA）、川崎病、朗爱二氏肌无力综合征、扁平苔藓、狼疮、狼疮性肾炎、淋巴细胞性垂体炎（Lymphoscytic Lypophisitis）、美尼尔氏病、米勒费雪综合征/急性播散性脑脊髓脊神经根病、混合性结缔组织病、多发性硬化（MS）、肌风湿病、肌痛性脑脊髓炎（ME）、重症肌无力、眼部炎症、落叶性天疱疮、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺综合征（惠特克氏综合征）、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自体免疫性胆管病、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、赖特氏综合征/反应性关节炎、再狭窄、风湿热、风湿性疾病、类风湿性关节炎、结节病、施密特氏综合征、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬皮病、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症是肺疾病。

根据本发明的一些实施方案，M2/M1巨噬细胞包含肺泡巨噬细胞。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症是慢性阻塞性肺疾病（COPD）。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症的方法，其中所述病症与嗜碱性粒细胞增多症无关，该方法包括耗竭受试者中的嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞的活性，从而治疗受试者中可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据本发明的一些实施方案，耗竭是通过耗竭嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞的活性的试剂。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供耗竭嗜碱性粒细胞或嗜碱性粒细胞的活性的试剂，其用于治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据本发明的一些实施方案，试剂针对至少一种嗜碱性粒细胞标记物。

根据本发明的一些实施方案，试剂靶向FceR1a、IL33R和/或CSF2Rb。

根据本发明的一些实施方案，试剂靶向GM-CSF和/或IL33。

根据本发明的一些实施方案，耗竭是离体实现的。

根据本发明的一些实施方案，耗竭是在体外实现的。

根据本发明的一些实施方案，嗜碱性粒细胞是血液循环的嗜碱性粒细胞。

根据本发明的一些实施方案，嗜碱性粒细胞是肺驻留的嗜碱性粒细胞。

根据本发明的一些实施方案，耗竭是以局部方式实现的。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症是癌症。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症是黑色素瘤。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症是肺纤维化。

根据本发明的一些实施方案，可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的辅助疾病或病症选自癌症、纤维化疾病。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供增加M1/M2巨噬细胞比率的方法，该方法包括从巨噬细胞附近耗竭具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞或耗竭嗜碱性粒细胞的活性，从而增加M1/M2巨噬细胞比率。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供增加M2/M1巨噬细胞比率的方法，该方法包括在巨噬细胞或嗜碱性粒细胞的效应物附近富集具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞，从而增加M2/M1巨噬细胞比率。

根据本发明的一些实施方案，富集是通过GM-CSF和/或IL33。

根据本发明的一些实施方案，效应物选自IL6、IL13和HGF。

根据本发明的一些实施方案，该方法是离体实现的。

根据本发明的一些实施方案，该方法是在体内实现的。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了示例性的方法和/或材料，但与本文描述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实践或测试中。在冲突的情况下，以专利说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不预期必然是限制性的。

附图说明

本发明的一些实施方案在本文中仅通过示例的方式，参考附图进行描述。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示出的细节是作为示例并且用于本发明的实施方案的说明性讨论的目的。就这一点而言，结合附图进行的描述使得可以如何实践本发明的实施方案，对于本领域技术人员是显而易见的。

在附图中：

图1A-C显示了在发育过程中肺细胞的单细胞图。图1A. 实验设计。从沿着肺发育的各个时间点收集单细胞。图1B. 来自免疫区室和非免疫区室的单细胞RNA-seq数据通过MetaCell包（未显示）进行进行分析和聚类，导致单细胞二维投影到图形表示上。分析了来自所有时间点来自17只小鼠的20,931个单细胞。260个元细胞（meta-cell）与22种细胞类型和状态相关，并且通过颜色代码进行注释和标记。图1C. 在肺发育的2D图的顶部，关键细胞类型特异性标记物基因的表达分位数。条描绘了对于相等的细胞数目下采样的，跨越所有细胞类型的标记物基因的UMI分布。

图2A-G显示了在肺发育过程中的细胞组成和基因表达的动态变化。图2A. 来自2D图上的不同时间点的细胞投影。图2B-C. 跨越时间点的免疫（CD45

图3A-I显示了肺驻留的嗜碱性粒细胞与免疫区室和其它区室广泛地相互作用。图3A. 配体受体图分析的图示。每个节点是一个配体或受体，而一条线代表相互作用。图3B.跨越所有时间点合并的肺发育的配体-受体图。基于其关联结构（方法），将基因（配体和受体）投影到2D图上。根据图1A-C，与特异性细胞有关的基因按其独特的颜色进行标记。图3C.在免疫区室（绿色）和非免疫区室（红色）中活化的基因的投影。实心圆圈和空心圆圈分别代表配体和受体。灰色圆圈代表对一个区室非特异性的配体/受体。图3D-E. 通过GO富集（方法）将配体分类成功能群。图D. 在免疫区室和非免疫区室中，配体功能群的富集。图3E. 在免疫区室和非免疫区室中，其配体来自不同功能群的受体的富集。FDR校正的费希尔精确检验；p < 0.05。图3F-I. 平滑肌成纤维细胞（F）、AT2细胞（G）、ILC（H）和嗜碱性粒细胞（I）的LR相互作用图。彩色节点代表在细胞类型中上调的基因（>2倍变化），而灰色节点代表其相互作用配偶体。实心圆圈和空心圆圈分别代表配体和受体。*p < 0.05，**p < 0.01，***p <0.005。

图4A-G显示了肺嗜碱性粒细胞的空间和转录组表征。图4A. 通过TissueFAXS检测Mcpt8

图5A-L显示了肺驻留的嗜碱性粒细胞被IL33和GM-CSF引发。图5A. 配体

图6A-P肺嗜碱性粒细胞对于AM的转录和功能发育是必需的。图6A. 配体

图7A-I提供了与肺嗜碱性粒细胞的空间和转录组表征有关的另外数据。图7A. 对于每个时间点，在衍生自E16.5、PN 30小时、PN第8.5天和8周成年小鼠n=3-5的肺切片中，具有苏木精背景的Mcpt8

图8A-G提供了与由IL33和GM-CSF引发的肺驻留的嗜碱性粒细胞有关的另外数据。图8A. Il1rl1敲除或其同窝对照的肺嗜碱性粒细胞，与在PN 30小时下衍生自小鼠的肺或血液嗜碱性粒细胞的基因表达相似性。通过k最近邻多数投票（方法），将每个Il1rl1 KO细胞分配给血液或肺。图8B-E. BM衍生的细胞与IL3一起生长，以诱导嗜碱性粒细胞10天，然后将cKIT

图9A-N提供了与肺嗜碱性粒细胞有关的另外数据，所述肺嗜碱性粒细胞对于AM的转录和功能发育是必需的。图9A. 配体

具体实施方式

在其一些实施方案中，本发明涉及调节M2巨噬细胞极化的方法及其在治疗中的用途。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明在其应用中并不一定限于下述说明书中阐述的或由实施例例示的细节。本发明能够具有其它实施方案，或者能够以各种方式被实践或进行。

衍生自单核细胞前体的巨噬细胞根据局部组织环境经历特异性分化。各种巨噬细胞功能与巨噬细胞上的受体相互作用的类型和细胞因子的存在相联系。类似于T辅助1型和T辅助2型（TH1-TH2）极化，已定义了关于巨噬细胞的两种不同的极化活化状态：经典活化的（M1）巨噬细胞表型和替代活化的（M2）巨噬细胞表型。类似于T细胞，存在一些活化性巨噬细胞和一些抑制性巨噬细胞，因此，应该基于巨噬细胞的特异性功能活性对其进行定义。经典活化的（M1）巨噬细胞在TH1细胞免疫应答中具有效应细胞的作用。替代活化的（M2）巨噬细胞似乎涉及免疫抑制和组织修复。出于这些原因，调节M1/M2的比率一方面已被视为用于治疗炎症和自身免疫性的相关方法，并且另一方面已被视为用于治疗癌症的相关方法。

在将本发明付诸实践的同时，本发明人已鉴定了与肺泡紧密接近定位的嗜碱性粒细胞的肺驻留群体。这些嗜碱性粒细胞的特征在于独特的基因表达表型和细胞因子/生长因子分泌。它们在指导肺中的肺泡巨噬细胞的成熟和功能中起重要作用。提示肺驻留的嗜碱性粒细胞表型也是并不限于肺的疾病状况的标志，提示它们针对治疗可以受益于M1/M2调节的医学状况可以是有益的。

具体地，本发明人报告了沿着肺发育的主要时间点，通过对50,770个细胞的单细胞RNA测序，免疫和非免疫肺细胞的广泛概况分析。观察到高度不同组的细胞类型和状态，并且鉴定了从原始细胞到成熟AM的发育轨迹的复杂动态，包括三波巨噬细胞类型。相互作用的配体和受体的分析揭示了紧密联系的相互作用网络，并且突出显示了嗜碱性粒细胞作为肺中表达主要生长因子和细胞因子信号传导的细胞。肺中的嗜碱性粒细胞与肺泡紧密接近定位，并且显示出与周围循环的嗜碱性粒细胞高度不同的肺特异性表型。使用Il1rl1（IL-33受体）敲除小鼠和体外培养物，本发明人发现，肺嗜碱性粒细胞的教育由来自肺环境的GM-CSF（Csf2）和IL-33的组合印迹来介导，并且可以通过引入这些细胞因子在体外重现。使用抗体耗竭策略、白喉毒素介导的嗜碱性粒细胞的选择性耗竭和体外共培养实验，本发明人证实了嗜碱性粒细胞在指导肺中的肺泡巨噬细胞（AM）的成熟和功能中起重要作用。这些发现为巨噬细胞操纵和基于嗜碱性粒细胞的治疗药开辟了新的临床策略。

因此，根据本发明的一个方面，提供了增加M2/M1巨噬细胞比率的方法。该方法包括在巨噬细胞或嗜碱性粒细胞的效应物附近富集具有肺嗜碱性粒细胞表型的所述嗜碱性粒细胞，从而增加M2/M1巨噬细胞比率。

如本文使用的，“M1巨噬细胞”指特征在于促炎基因的表达的巨噬细胞，并且通常在TH1细胞免疫应答中具有效应子功能。根据本发明的一些实施方案，M1巨噬细胞可以通过使用FACS或其细胞因子分泌概况（例如，TNFα、IL1b）进行鉴定，并且可以通过例如ELISA或在RNA水平例如通过使用RT-PCR进行定量。

如本文使用的，“M2巨噬细胞”指具有免疫抑制活性和组织修复的巨噬细胞。根据本发明一些实施方案，M2巨噬细胞可以通过使用特异性标记物（例如MRC1、ARG1）的细胞数目，例如通过使用FACS，或者通过其细胞因子分泌概况（例如，IL-10、CCL17、CCL22）进行定量，并且可以通过例如ELISA或在RNA水平例如通过使用RT-PCR进行定量。

如本文使用的，“肺泡巨噬细胞”或“AM”指在肺泡中发现的一类巨噬细胞。AM源于胎儿肝胚胎前体，并且是自我维持的，没有来自成年骨髓的贡献。

可以使用抗CD45、抗CD11c、抗F4/80和/或抗SIGLEC-F来鉴定小鼠AM。

可以使用抗CD45和/或抗CD11c来鉴定人AM。

如本文使用的，“增加”指与在所述富集（例如，GM-CSF、IL33、IL6和/或IL13）不存在下的M2/M1比率相比，M2/M1比率（M2极化）的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或甚至95%增加，如通过本领域众所周知的方法测定的（参见下述实施例节段）。

增加M2/M1巨噬细胞比率指M2极化。

如提到的，通过富集具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞，来执行本发明这个方面的方法。

本发明人已显示了，可以在体外获得肺嗜碱性粒细胞表型（参见下述实施例节段）。

如本文使用的，“肺嗜碱性粒细胞表型”指结构和/或功能表型。

根据一个具体实施方案，结构表型包含Fcera1

根据另外的或替代的实施方案，结构表型包含关键细胞因子和生长因子，例如

根据另外的或替代的实施方案，结构表型包含关键细胞因子和生长因子

根据另外的或替代的实施方案，结构表型包含肺嗜碱性粒细胞与血液循环的嗜碱性粒细胞不同的基因表达谱，其特征在于包括

“功能表型”指M2极化对巨噬细胞的作用。

根据一个具体实施方案，嗜碱性粒细胞是哺乳动物嗜碱性粒细胞。

根据一个具体实施方案，嗜碱性粒细胞是人嗜碱性粒细胞。

根据一个实施方案，富集是通过与GM-CSF和/或IL33接触。

根据一个实施方案，富集是通过与GM-CSF和IL33接触。

如本文使用的，“接触”或本文所述的方法可以在体内、离体或在体外执行。

根据一个具体实施方案，富集是在体外或离体实现的。

如本文使用的，“嗜碱性粒细胞”指称为粒细胞的特定类型的白细胞，其特征在于可以被碱性染料染色的大细胞质颗粒和双叶核，在外观上与肥大细胞（另一类粒细胞）相似。嗜碱性粒细胞是最不常见的粒细胞，仅占循环血液白细胞的0.5%，并且具有仅2-3天（在体内）的短寿命。嗜碱性粒细胞衍生自骨髓中的粒细胞-单核细胞祖先；而嗜碱性粒细胞前体和肥大细胞前体起于中间双能性嗜碱性粒细胞-肥大细胞前体（（Arinobu等人2005和Arinobu等人2009）。表1显示了与不同谱系细胞类型相关的标记物。

表1

数据来自Min等人2012 Immunol. 135，192-197。

嗜碱性粒细胞可以通过某些标记物的表达来鉴定，所述标记物在人和小鼠之间是一致的，参考表2。

表2

数据来自Schroeder 2009 Ad. Immunol. Adv Immunol. 101，123-161，Hida等人2009 Nat. Immunol. 10，214-222. 和Heneberg 2011 Cu. Pharm. Design 17，3753-3771。

根据一个具体实施方案，嗜碱性粒细胞是从骨髓或外周血中分离的。

根据一个具体实施方案，嗜碱性粒细胞如下产生：

（i）从骨髓中分离嗜碱性粒细胞。

（ii）在IL-3的存在下，从外周血分化嗜碱性粒细胞，以便获得分化的培养物；

（iii）从分化的培养物中分离cKIT群体。

根据示例性方案，收获骨髓（BM）祖细胞，并且以例如0.1 × 10

离体方法可以在组织培养物中完成，或者可能时，在封闭系统中例如通过单采血液成分术完成。

用分化因子处理骨髓培养物或循环嗜碱性粒细胞（外周血）培养物。培养可以在补充有以下时实现：用于细胞存活的IL-3（5-20 ng/ml，例如10 ng/ml）和M-CSF（5-20 ng/ml，例如10 ng/ml）；和/或用于朝向嗜碱性粒细胞的细胞活化的IL33（30-70 ng/ml，例如50ng/ml）和/或GM-CSF（30-70 ng/ml，例如50 ng/ml），所述嗜碱性粒细胞可以调控巨噬细胞的M2极化。通常，细胞活化执行48小时或更短时间，例如6-48小时、12-48小时、24-48小时、12-36小时、18-24小时，例如24小时（例如IL33+GM-CSF）。

如本文使用的，“在巨噬细胞附近”可以指嗜碱性粒细胞和巨噬细胞的共培养。可替代地，“在巨噬细胞附近”可以指这样富集，使得在体内存在有效量的具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞、或有效量的所述嗜碱性粒细胞的效应物，以便允许向M2巨噬细胞的极化。

具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞的效应物包括但不限于IL6、IL13和/或HGF（肝细胞生长因子）。

根据另一个方面，提供了增加M1/M2巨噬细胞比率的方法，该方法包括从巨噬细胞附近耗竭具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞或耗竭所述嗜碱性粒细胞的活性，从而增加M1/M2巨噬细胞比率。

增加M1/M2巨噬细胞比率也指M1极化。

如本文使用的，“增加”指与在所述耗竭不存在下的M1/M2比率相比，M1/M2比率（M1极化）的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或甚至95%增加，如通过本领域众所周知的方法测定的（参见下述实施例节段）。

可以通过本领域已知的任何方法来实现耗竭具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞，下文描述了一些方法。

根据一个实施方案，耗竭可以通过靶向嗜碱性粒细胞标记物的试剂来实现。

上文描述了此类标记物，例如Fcera1

根据一个具体实施方案，实现耗竭，以特异性地消除具有肺嗜碱性粒细胞表型的嗜碱性粒细胞，而不是其它细胞群体（其它细胞群体的耗竭不实现多于20%、15%、10%、5%、1%，每个值视为一个不同的实施方案）。

根据一个具体实施方案，此类试剂可以是抗体，例如抗Fcera1

抗体类型的选择将取决于设计抗体以引发的免疫效应物功能。

根据一个具体实施方案，抗体包含Fc结构域。

根据一个具体实施方案，抗体是裸抗体。

如本文使用的，术语“裸抗体”指不包含异源效应物部分，例如治疗部分的抗体。

根据具体实施方案，抗体包含通常用于杀死嗜碱性粒细胞，从而增加M1/M2巨噬细胞比率的异源效应物部分。效应物部分可以是蛋白质的或非蛋白质的；后者一般使用抗体和缀合配偶体上的官能团来生成。效应物部分可以是任何分子，包括小分子化学化合物和多肽。效应物部分的非限制性实例包括但不限于细胞因子、细胞毒性抗体、毒素、放射性同位素、化学治疗抗体、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗活性抗体。下文进一步提供关于异源治疗部分的另外描述。

抗体可以是单特异性的（能够识别一个表位或蛋白质）、双特异性的（能够结合两个表位或蛋白质）、或多特异性的（能够识别多个表位或蛋白质）。

根据一个具体实施方案，抗体是单特异性抗体。

根据一个具体实施方案，抗体是双特异性抗体。

双特异性抗体是能够特异性识别并结合至少两个不同表位的抗体。不同的表位可以在相同分子内或在不同分子上，使得双特异性抗体可以特异性识别并结合单个RTN4多肽上的两个不同表位以及两种不同多肽。可替代地，双特异性抗体可以结合例如RTN4和另一种效应分子，例如但不限于例如CD2、CD3、CD28、B7、CD64、CD32、CD16。产生双特异性抗体的方法是本领域已知的，并且公开于例如美国专利号4,474,893、5,959,084、US 7,235,641和7,183,076，美国公开号20080219980，以及国际公开号WO 2010/115589、WO2013150043和WO2012118903中，所述专利全部整体引入本文；并且包括例如化学交联（Brennan等人，Science 229,81（1985）；Raso等人，J. BioI. Chern. 272，27623（1997）），二硫键交换，杂交-杂交瘤（四源杂交瘤）的产生，通过转录和翻译以产生体现双特异性抗体的单条多肽链，或通过转录和翻译以产生多于一条多肽链，其可以共价缔合以产生双特异性抗体。考虑的双特异性抗体也可以完全通过化学合成进行制备。

还考虑的是具有多于两个效价的抗体。

根据其它具体实施方案，抗体是多特异性抗体。

根据一个具体实施方案，抗体是缀合物抗体（即，由两种共价结合的抗体组成的抗体）。

抗体可以是单克隆的或多克隆的。

根据一个具体实施方案，抗体是单克隆抗体。

根据一个具体实施方案，抗体是多克隆抗体。

产生多克隆抗体和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的（参见例如，Harlow和Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988，引入本文作为参考）。

根据本发明的一些实施方案的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解，或通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞（例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统）中表达编码该片段的DNA来制备。可以通过常规方法，通过完整抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生，以提供表示为F（ab'）2的5S片段。这种片段可以使用硫醇还原剂和任选地阻断基进一步切割，所述阻断基用于起因于二硫键的切割的巯基，以产生3.5S Fab'单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。这些方法例如由Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献进行描述，所述专利在此整体引入作为参考。还参见Porter，R. R. [Biochem. J. 73: 119-126（1959）]。也可以使用切割抗体的其它方法，例如重链的分离以形成单价轻链-重链片段，片段的进一步切割，或者其它酶促、化学或遗传技术，只要片段与由完整抗体识别的抗原结合。

Fv片段包含VH和VL链的缔合。如Inbar等人[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62（19720]中所述，这种缔合可以是非共价的。可替代地，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学制品如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。通过构建包含通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因，来制备这些单链抗原结合蛋白（sFv）。将结构基因插入表达载体内，随后将所述表达载体引入宿主细胞例如大肠杆菌内。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的连接肽的单条多肽链。用于产生scFv的方法例如通过[Whitlow和Filpula，Methods 2: 97-105（1991）；Bird等人，Science242:423-426（1988）；Pack等人，Bio/Technology 11:1271-77（1993）；和美国专利号4,946,778进行描述，所述参考文献在此整体引入作为参考。

抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区（CDR）的肽。CDR肽（“最小识别单位”）可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区，来制备此类基因。参见例如Larrick和Fry [Methods，2: 106-10（1991）]。

应了解，对于人疗法或诊断，优选使用人源化抗体。

根据具体实施方案，抗体是人源化抗体。非人（例如鼠）抗体的人源化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（例如Fv、Fab、Fab'、F（ab'）

用于使非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。一般地，人源化抗体具有从其为非人的来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化可以基本上按照Winter及同事的方法[Jones等人，Nature，321:522-525（1986）；Riechmann等人，Nature 332:323-327（1988）；Verhoeyen等人，Science，239:1534-1536（1988）]，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来执行。相应地，此类人源化抗体是嵌合抗体（美国专利号4,816,567），其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的某些FR残基被来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基取代。

根据另一个实施方案，耗竭是通过耗竭嗜碱性粒细胞的活性来实现的，以便阻止与巨噬细胞的信号通讯。

根据一个具体实施方案，此类活性是IL6、IL13和/或HGF的。

可以使用关于那些配体的抗体、或结合这些配体并阻止其功能的可溶性受体（也称为“诱饵”），来完成抑制这些分子中的任一种的活性。

通常，此类可溶性受体包含受体分子的细胞外部分，并且缺乏跨膜结构域和细胞质结构域。

HGF的受体是c-Met受体。

IL6的受体是白介素6受体（IL6R），也称为CD126。

IL13的受体是白介素13受体。

c-MET、IL6R和IL13R的小分子抑制剂是本领域众所周知的，并且一些已经在临床使用中。c-Met抑制剂的实例包括但不限于I类和II类ATP竞争性小分子c-Met抑制剂，例如JNJ-38877605、PF-04217903、XL880、福雷替尼和AMG458，以及ATP-非竞争性小分子c-Met抑制剂，例如Tivantinib（ARQ197）。IL6R抑制剂（例如抗体，托珠单抗、沙柳单抗）、IL6的小分子抑制剂的实例在引入本文作为参考的WO2013019690中教导。IL13R抑制剂的实例是ASLAN004。

为了确保对特异性组织的特异性（当需要时），试剂可以伴随着特异性递送媒介物，例如，针对组织标记物或以局部方式施用，例如对于肺活性，例如鼻内施用。施用模式在下文描述。

如本文使用的，“耗竭”指如通过FACS确定的，所需细胞的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多，甚至完全消除，无论所述所需细胞是肺表型的嗜碱性粒细胞还是M2巨噬细胞。

可以使用本领域已知的方法来确定RNA在本发明的一些实施方案的细胞中的表达水平。

可以使用本领域已知的方法，来确定在本发明的一些实施方案的培养物的细胞中表达的蛋白质的表达和/或活性水平。

在RIA的替代形式中，采用标记的底物和未标记的抗体结合蛋白。以不同的量添加含有未知量底物的样品。来自标记底物的沉淀计数的减少与所添加样品中的底物量成比例。

根据本发明的一些实施方案，还考虑了可通过本文所述的任何方法获得的离体或体外细胞或细胞群体。根据本发明的一些实施方案获得的细胞群体的特征在于：纯度水平高于在生理环境中发现的纯度水平（例如，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的细胞是目的细胞，例如嗜碱性粒细胞、或由其分化的细胞或巨噬细胞）。

如提到的，所述的任何方法都可以离体或在体内实现。

调节M1和M2巨噬细胞之间的平衡的能力允许将本文教导用于治疗。

因此，根据本发明的一个方面，提供了治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症的方法，该方法包括：

（a）在IL33和/或GM-SCF的存在下培养嗜碱性粒细胞；和

（b）在培养之后，向受试者施用治疗有效量的嗜碱性粒细胞，

从而治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据另一个方面，提供了通过在IL33和/或GM-SCF的存在下培养而生成的治疗有效量的嗜碱性粒细胞，其用于治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据另一个方面，提供了治疗有此需要的受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的选自IL6、IL13和HGF的信号传导分子，从而治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

根据另一个方面，提供了治疗有效量的选自IL6、IL13和HGF的信号传导分子，其用于治疗受试者中可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症。

如本文使用的，“受试者”指患有可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症、或者患有可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症的受试者。可替代地，受试者处于发展此类疾病或病症的风险中。

当施用嗜碱性粒细胞时，细胞可以是自体的、非自体的、同种异体的、同基因的或异种的（需要时，具有适当的免疫抑制）。

如本文使用的，“可以受益于增加M2/M1巨噬细胞比率的疾病或病症”，指可以通过抑制免疫系统而改善的疾病或病症（总体上的医学状况）。

这些通常包括但不限于炎症、自身免疫性或损伤。

如本文使用的，如本文使用的术语“炎性疾病”指对有害刺激的急性或慢性局部性或系统性应答，所述有害刺激如病原体、受损的细胞、身体损伤或刺激物，所述应答部分地由细胞因子、趋化因子或炎性细胞（例如巨噬细胞）的活性介导，并且在大多数情况下特征在于疼痛、发红、肿胀和组织功能的损害。炎性疾病可以选自：脓毒病，败血病，肺炎，败血性休克，全身性炎性反应综合征（SIRS），急性呼吸窘迫综合征（ARDS），急性肺损伤，吸入性肺炎，感染，胰腺炎，菌血症，腹膜炎，腹腔脓肿，由于外伤的炎症，由于手术的炎症，慢性炎性疾病，缺血，器官或组织的缺血再灌注损伤，由于疾病的组织损伤，由于化学疗法或放射疗法的组织损伤，以及对摄入、吸入、输注、注射或递送的物质的反应，肾小球肾炎，肠感染，机会性感染，以及用于经历大手术或透析的受试者，免疫受损的受试者，服用免疫抑制剂的受试者，患有HIV/AIDS的受试者，患有疑似心内膜炎的受试者，具有发烧的受试者，具有不明原因发烧的受试者，患有囊性纤维化的受试者，患有糖尿病的受试者，患有慢性肾功能衰竭的受试者，患有支气管扩张的受试者，患有慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、肺气肿或哮喘的受试者，患有发热性嗜中性粒细胞减少症的受试者，患有脑膜炎的受试者，患有败血性关节炎的受试者，患有尿路感染的受试者，患有坏死性筋膜炎的受试者，患有其它疑似A组链球菌感染的受试者，进行了脾切除术的受试者，患有复发或疑似肠球菌感染的受试者，与感染风险增加相关的其它医学和外科状况、革兰氏阳性脓毒病、革兰氏阴性脓毒病、培养物阴性脓毒病、真菌性脓毒病、脑膜炎球菌血症、泵后综合征、心脏眩晕综合征、中风、充血性心力衰竭、肝炎、会厌炎、大肠杆菌0157:H7、疟疾、气性坏疽、中毒性休克综合征、先兆子痫、子痫、HELP综合征、分枝杆菌结核病、卡氏肺囊虫病、肺炎、利什曼病、溶血性尿毒综合征/血栓性血小板减少性紫癜、登革出血热、盆腔炎性疾病、军团菌、莱姆病、甲型流感、EB病毒、脑炎、炎性疾病和自身免疫性包括类风湿关节炎、骨关节炎、进行性系统性硬化、系统性红斑狼疮、炎性肠病、特发性肺纤维化、结节病、超敏性肺炎、系统性血管炎、韦格纳氏肉芽肿病，包括心脏、肝、肺、肾、骨髓的移植，移植物抗宿主病，移植排斥，镰状细胞性贫血，肾病综合征，试剂例如OKT3的毒性，细胞因子疗法，隐热蛋白相关周期性综合征和肝硬化。

如本文使用的，“自身免疫性疾病”是起于且针对个体的自身组织的疾病或病症。自身免疫性疾病的实例包括但不限于艾迪生氏病、变态反应、斑秃、阿尔茨海默氏病、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征（休斯综合征）、关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、自身免疫性疾病（例如狼疮、RA、MS、格雷夫斯病等）、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、无精子症、白塞氏病、伯格氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、心血管疾病、乳糜泻/腹腔疾病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征（CFIDS）、慢性特发性多发性神经炎、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病（CIPD）、慢性复发性多发性神经病（格巴二氏综合征）、丘斯二氏综合征（CSS）、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病（CAD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、CREST综合征、克罗恩氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、糖尿病、盘状狼疮、湿疹、获得性大疱性表皮松解症、特发性混合性冷球蛋白血症、埃文斯综合征、眼球突出、纤维肌痛、古德帕斯彻氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、IgA肾病、免疫增生性疾病或病症（例如牛皮癣）、炎性肠病（IBD）包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、胰岛素依赖型糖尿病（IDDM）、间质性肺病、青少年糖尿病、青少年关节炎、青少年特发性关节炎（JIA）、川崎病、朗爱二氏肌无力综合征、扁平苔藓、狼疮、狼疮性肾炎、淋巴细胞性垂体炎、美尼尔氏病、米勒费雪综合征/急性播散性脑脊髓脊神经根病、混合性结缔组织病、多发性硬化（MS）、肌风湿病、肌痛性脑脊髓炎（ME）、重症肌无力、眼部炎症、落叶性天疱疮、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺综合征（惠特克氏综合征）、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化/自体免疫性胆管病、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、赖特氏综合征/反应性关节炎、再狭窄、风湿热、风湿性疾病、类风湿性关节炎、结节病、施密特氏综合征、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬皮病、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、甲状腺炎、1型糖尿病、2型糖尿病、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病。

如本文使用的，“可以受益于增加M1/M2巨噬细胞比率的疾病或病症”，指可以通过活化免疫系统而改善的疾病或病症（总体上的医学状况），例如通过促炎细胞因子的分泌所证明的。

这些通常包括但不限于癌症，例如转移性癌症，进行性纤维化疾病，例如特发性肺纤维化（IPF），肝纤维化，系统性硬化，变态反应和哮喘，动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏病，肺纤维化，肝纤维化。特别地，本发明的方法特别适合于治疗癌症。如本文使用的，术语“癌症”具有其在本领域中的一般含义，并且包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语癌症包括皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步涵盖原发性癌症和转移性癌症两者。可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。另外，癌症可以具体地具有下述组织学类型，但是它并不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体瘤；类癌瘤；恶性；细支气管肺泡状腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包围性硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂性腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞状癌；腺癌/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；睾丸母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦内罗氏瘤（brennertumor），恶性；叶状瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞性纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓样白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。在一些实施方案中，本发明的方法特别适合于治疗骨转移癌，其中所述转移癌是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、前列腺癌、腺癌、血细胞恶性肿瘤包括白血病和淋巴瘤；头颈癌；胃肠道癌，包括食道癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆道癌或胆囊癌；女性生殖道的恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌和宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤，骨肉瘤；以及皮肤癌，包括恶性黑色素瘤或鳞状细胞癌。

本发明的一些实施方案的细胞或试剂（例如，细胞因子、生长因子、抗体）可以本身或在药物组合物中施用于生物，在所述药物组合物中，它与合适的载体或赋形剂混合。

如本文使用的，“药物组合物”指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学组分，如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物的施用。

在本文中，术语“活性成分”指可负责生物效应的细胞或试剂（例如，细胞因子、生长因子、抗体）。

在下文中，短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体” 可以互换使用，并且指不对生物造成明显刺激，且不消除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂包括在这些短语下。

在本文中，术语“赋形剂”指加入药物组合物中，以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种类型的糖和淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

关于药物配制和施用的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，所述参考文献引入本文作为参考。

合适的施用途径可以例如包括经口，直肠，经粘膜，尤其是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接心室内、心内例如在右心室腔或左心室腔内、在普通冠状动脉内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

用于将药物递送到中枢神经系统（CNS）的常规方法包括：神经外科策略（例如，脑内注射或脑室内输注）；在开发BBB的内源性转运途径之一的尝试中，试剂的分子操纵（例如，产生嵌合融合蛋白，其包含与自身无法穿越BBB的试剂组合的，对于内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽）；设计为增加试剂的脂质溶解度的药理学策略（例如，水溶性试剂与脂质或胆固醇载体的缀合）；以及BBB的完整性通过高渗破坏（起因于甘露糖醇溶液输注到颈动脉内、或使用生物活性剂如血管紧张素肽）的瞬时破坏。然而，这些策略各自具有局限性，例如与侵入性手术操作相关的固有风险，由内源性转运系统固有的局限性施加的大小局限性，与嵌合分子的全身施用相关的潜在不期望的生物副作用，所述嵌合分子包含可能在CNS外部活跃的载体基序，以及在其中BBB被破坏的脑区域内的脑损伤的可能风险，这致使其成为次优的递送方法。

可替代地，可以例如经由将药物组合物直接注射到患者的组织区域内，以局部而非全身方式施用药物组合物。根据一个具体实施方案，局限性治疗是例如通过鼻内施用针对肺的。

肺部施用如本文所述的细胞或试剂。

肺部施用可以通过本领域技术人员已知的合适手段来完成。通常，肺部施用需要在吸入期间，将生物活性物质从递送装置分配到受试者的口腔内。例如，取决于使用的递送装置，经由吸入气溶胶或其它合适的制剂来施用包含细胞或试剂的组合物，所述气溶胶或其它合适的制剂得自水性或非水性溶液或悬浮液形式、或者固体或干粉形式的药物组合物。此类递送装置是本领域众所周知的，并且包括但不限于雾化器、计量吸入器和干粉吸入器、或任何其它适当的递送机构，其允许分配作为水性或非水性溶液或悬浮液、或者作为固体或干粉形式的药物组合物。用于经由肺部施用（包括定向递送至中央和/或外周肺区域）将细胞或试剂递送至受试者的方法，包括但不限于干粉吸入器（DPI）、计量吸入器（MDI）装置和雾化器。

术语“组织”指设计为执行一种或多种功能的由细胞组成的生物的部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。

本发明的一些实施方案的药物组合物可以通过本领域众所周知的工艺来制造，例如，借助于常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、水飞、乳化、包囊、包埋或冻干工艺。

因此，用于根据本发明的一些实施方案使用的药物组合物可以以常规方式进行配制，使用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理学上可接受的载体，其促进活性成分加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于选择的施用途径。

对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中进行配制，优选在生理学相容的缓冲液中，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用对于待渗透的屏障适当的渗透剂。此类渗透剂是本领域一般已知的。

对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体组合，来容易地配制药物组合物。此类载体使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆料、悬浮液等等，用于通过患者的经口摄取。用于经口使用的药物制剂可以通过以下进行制备：使用固体赋形剂，任选地研磨所得到的混合物，并且在需要时加入合适的助剂后，加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉蜀黍淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。需要时，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如海藻酸钠。

糖衣丸芯提供有合适的包衣。为此，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣丸包衣中，用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。

可以经口使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可以含有与填料如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮于合适的液体中，所述液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于经口施用的所有制剂应该为适合于选择的施用途径的剂量。

对于颊部施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于通过鼻吸入的施用，用于根据本发明的一些实施方案使用的活性成分，以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾呈现的形式方便地递送，其中使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可以配制用于分配器中的例如明胶的胶囊和药液筒，其含有化合物和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外施用，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在于例如安瓿或具有任选添加的防腐剂的多剂量容器中。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，并且可以含有配制试剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括以水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，可以将活性成分的悬浮液制备为适当地基于油或水的注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或者合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。

可替代地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前由合适的媒介物例如无菌、无热原的水基溶液构造。

本发明的一些实施方案的药物组合物也可以使用例如常规的栓剂基质，例如可可脂或其它甘油酯配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。

适用于本发明的一些实施方案的背景下的药物组合物包括这样的组合物，其中有效成分以有效达到预期目的的量包含。更具体而言，治疗有效量意指这样的活性成分（细胞或试剂（例如，细胞因子、生长因子、抗体））的量，其有效预防、减轻或改善病症（例如，如上所述）的症状，或者延长待治疗受试者的存活。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。

对于本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养测定进行估计。例如，可以在动物模型中制定剂量，以达到所需的浓度或滴度。此类信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。

本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过在体外、细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可以用于制定用于在人中使用的剂量范围。剂量可以根据采用的剂型和利用的施用途径而变。确切的制剂、施用途径和剂量可以由各个医生考虑到患者的状况加以选择。（参见例如，Fingl等人，1975，"The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第1章，第1页）。

剂量的量和间隔可以个别地调整，以提供活性成分的有效（例如，肺组织）水平，其足以诱导或抑制生物效应（最小有效浓度，MEC）。MEC对于每种制剂不同，但可以从体外数据进行估计。达到MEC必需的剂量取决于个体特征和施用途径。检测测定可以用于确定血浆浓度。

取决于待治疗状况的严重性和响应性，给药可以是单次施用或多次施用，其中治疗过程持续数天至数周，或者直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。

当然，待施用的组合物的量取决于待治疗的受试者、痛苦的严重性、施用方式、开处方医生的判断等。

需要时，本发明的一些实施方案的组合物可以存在于包装或分配器装置，例如FDA批准的试剂盒中，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包含金属箔或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可能伴随有施用说明书。包装或分配器也可以容纳有与容器相关的通告，所述通告为由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，所述通告反映了组合物的形式或者人或兽医学施用通过机构的批准。例如，此类通告可以是由美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration）批准用于处方药的标记，或者批准的产品插页。如上文进一步详述的，还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明的制剂的组合物，置于适当的容器中，并且标记用于治疗指示的状况。

术语“治疗”指抑制、预防或停止病理状态（疾病、病症或状况）的发展和/或引起病理状态的减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，各种方法和测定可以用于评价病理状态的发展，并且类似地，各种方法和测定可以用于评价病理状态的减轻、缓解或消退。

如本文使用的，术语“预防”指阻止疾病、病症或状况在受试者中发生，所述受试者可能处于疾病的风险中，但尚未被诊断为患有该疾病。

如本文使用的，短语“治疗方案”指治疗计划，其指定提供给有此需要的受试者（例如，诊断有病理状态的受试者）的治疗类型、治疗剂量、时间表和/或持续时间。所选择的治疗方案可以是预计导致最佳临床结果（例如，病理状态的完全治愈）的积极治疗方案，或者可以缓解病理状态的症状，但导致病理状态的不完全治愈的更温和的治疗方案。应了解，在某些情况下，更积极的治疗方案可能与受试者的一些不适或不良副作用（例如，对健康细胞或组织的损伤）相关。治疗的类型可以包括手术干预（例如摘除病灶，患病的细胞、组织或器官），细胞替代疗法，治疗药物（例如受体激动剂、拮抗剂、激素、化学治疗剂）以局部或全身模式的施用，暴露于使用外部来源（例如，外部光束）和/或内部来源（例如，近距离放射治疗）的放射疗法和/或其任何组合。取决于病理状态的严重性和选择的治疗类型，治疗的剂量、时间表和持续时间可以不同，并且本领域技术人员能够根据治疗的剂量、时间表和持续时间来调整治疗的类型。

如本文使用的，术语“约”指±10%。

术语“包含（comprises）”、“包含（comprising）”、“包括（includes）”、“包括（including）”、“具有”及其词形变化意指“包括但不限于”。

术语“由……组成”意指“包括并限于”。

术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变所请求保护的组合物、方法或结构的基础和新型特征的情况下。

如本文使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。

本申请自始至终，本发明的各个实施方案可以以范围形式呈现。应该理解，以范围形式的描述仅是为了方便和简洁起见，而不应该被解释为对本发明的范围的硬性限制。相应地，范围的描述应该被视为已具体地公开了所有可能的子范围、以及在该范围内的各个数值。例如，范围如从1到6的描述应该被视为已具体地公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及在该范围内的各个数目，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。

每当在本文中指示数值范围时，它意欲包括在指示范围内的任何引用数字（分数或整数）。短语“范围为第一指示数目至第二指示数目之间/范围在第一指示数目和第二指示数目之间”、以及“范围为第一指示数目到第二指示数目/范围从第一指示数目到第二指示数目”在本文中可互换使用，并且意欲包括第一指示数目和第二指示数目、以及其间的所有分数和整数。

如本文使用的，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的，或者从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文使用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转状况的进展，基本上改善状况的临床或美学症状，或者基本上预防状况的临床或美学症状的出现。

当提及特定的序列表时，此类提及应理解为还涵盖基本上对应于其互补序列的序列，如包括起因于例如测序错误、克隆错误或其它改变的微小序列变化，所述其它改变导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加，条件是此类变化的频率为小于50个核苷酸中的1个，可替代地小于100个核苷酸中的1个，可替代地小于200个核苷酸中的1个，可替代地小于500个核苷酸中的1个，可替代地小于1000个核苷酸中的1个，可替代地小于5,000个核苷酸中的1个，可替代地小于10,000个核苷酸中的1个。

应了解，为了清楚起见，在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特点，也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特点，也可以分开地或以任何合适的子组合或如本发明的任何其它所述实施方案中合适地提供。在各个实施方案的上下文中描述的某些特点，不应被视为那些实施方案的必要特点，除非该实施方案没有那些要素是不可操作的。

如上文描绘的以及如下文权利要求节段中请求保护的，本发明的各个实施方案和方面在下述实施例中找到实验支持。

实施例

现在参考下述实施例，其连同上文说明书一起，以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。

一般地，本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到详尽解释。参见例如，"Molecular Cloning:A laboratory Manual" Sambrook等人，（1989）；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel，R. M.编辑（1994）；Ausubel等人，"Current Protocols inMolecular Biology"，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland（1989）；Perbal，"APractical Guide to Molecular Cloning"，John Wiley & Sons，New York（1988）；Watson等人，"Recombinant DNA"，Scientific American Books，New York；Birren等人（编辑）"Genome Analysis: A Laboratory Manual Series"，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York（1998）；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法学；"Cell Biology: A Laboratory Handbook"，第I-III卷Cellis，J. E.编辑（1994）；"Culture of Animal Cells - A Manual of BasicTechnique" by Freshney，Wiley-Liss，N. Y.（1994），第三版；"Current Protocols inImmunology"第I-III卷Coligan J. E.编辑（1994）；Stites等人（编辑），"Basic andClinical Immunology"（第8版），Appleton & Lange，Norwalk，CT（1994）；Mishell和Shiigi（编辑），"Selected Methods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，NewYork（1980）；可用的免疫测定在专利和科学文献中得到广泛描述，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait，M. J.编辑（1984）；“Nucleic AcidHybridization" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑（1985）；"Transcription andTranslation" Hames，B. D.和Higgins S. J.编辑（1984）；"Animal Cell Culture"Freshney，R. I.编辑（1986）；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press,（1986）；"APractical Guide to Molecular Cloning" Perbal，B.,（1984），以及"Methods inEnzymology"第1-317卷，Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods AndApplications"，Academic Press，San Diego，CA（1990）；Marshak等人，"Strategies forProtein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHLPress（1996）；所有这些都引入作为参考，如同它在本文中充分阐述一样。本文件自始至终提供了其它一般参考文献。其中的程序被认为是本领域众所周知的，并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息都引入本文作为参考。

材料和方法

小鼠

使用性别和年龄匹配的Mcpt8-Cre

肿瘤细胞系

将B16F10鼠黑色素瘤细胞维持在DMEM中，所述DMEM补充有10% FCS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和1 mM 1-谷氨酰胺（Biological Industries）。细胞在37°C下在加湿5% CO2大气中进行培养。

肺解离和单细胞分选

对在E12.5、E16.5、E18.5和E19.5下的胚胎小鼠肺，在PN 1、6、7、10、16、30小时、2天和7天下的新生小鼠肺，以及成年小鼠肺（8-12周）执行单细胞实验。一般而言，胚胎实验对一窝的合并同胞肺执行（在E12.5下，合并6个肺，在E16.5、E18.5和E19.5下，合并3个肺，在PN时间点下，合并2个肺，并且对于成年肺，不合并样品）。通过放在冰冻的表面上，对胚胎实施安乐死，而PN和成年小鼠通过麻醉过量而处死。对于所有时间点，除了E12.5以外，在肺解剖之前，经由右心室注射冷PBS来灌注小鼠。从小鼠中解剖肺组织，并且使用肺解离试剂盒（Miltenyi Biotec），将一半组织匀浆化，同时使酶促温育适合单细胞方案，并且因此持续15分钟（对于8周成年小鼠，酶促消化持续20分钟）。如先前记录的（Treutlein等人，2014），解离肺的第二半，短暂地向细胞补充含有弹性蛋白酶（3U/ml，Worthington）和DNA酶（0.33 U/ml，Sigma-Adrich）的DMEM/F12培养基（Sigma-Aldrich），在37℃下伴随频繁搅动温育15分钟。接下来，将等体积的补充有10% FBS、1U/ml青霉素和1Uml链霉素的DMEM/F12（Biological Industries）加入单细胞悬浮液中。在解离之后，将同一肺的单细胞悬浮液合并，并且在400g、5分钟、4℃下离心。所有样品都通过70μm尼龙筛网过滤器过滤到冰冷的分选缓冲液（补充有0.2mM EDTA pH8和0.5% BSA的PBS）内。

对于肺解离方案的校准，衍生自成年小鼠肺的细胞补充有1）. 含有释放酶（Liberase）（50µg/ml，Sigma-Aldrich）和DNA酶（1µg/ml，Roche）的DMEM（BiologicalIndustries）；2）. 含有胶原酶IV（1mg/ml，Worthington）和分散酶（2.4U/ml，Sigma-Adrich）的PBSCa

外周血细胞的分离

外周血细胞用20μl肝素进行悬浮，并且用补充有0.2mM EDTA pH8和0.5% BSA的PBS进行洗涤。细胞用ficoll-Paque

肿瘤微环境解离

对于来自肿瘤微环境的嗜碱性粒细胞纯化，将1x10

脾解离

组织从8周龄雌性中收获，用accutase溶液（Sigma-Adrich）进行悬浮，并且通过GentleMacs组织匀浆器（Miltenyi Biotec）进行匀浆化，并且在37℃下伴随频繁搅动温育10分钟。将细胞洗涤，并且悬浮于红血细胞裂解缓冲液（Sigma-Aldrich）和DNA酶（0.33U/ml，Sigma-Adrich）中，在室温下温育3分钟，用冷PBS洗涤两次，通过40µm筛网过滤器，在400g、5分钟、4℃下离心，然后重悬浮于冰冷的分选缓冲液中。

肝解离

通过Seglen（Seglen，1973）的两步胶原酶灌注方法的修改，分离来自肝的嗜碱性粒细胞。根据制造商的说明书，用释放酶（20µg/ml；Roche Diagnostics）执行消化步骤。将肝切成小片，用PBS悬浮并且在30g、5分钟、4℃下离心。将上清液收集到新管中（以去除肝细胞），用PBS悬浮并且在30g、5分钟、4℃下离心（这个步骤重复两次）。在第二次洗涤之后，将上清液收集到新管中，在500g、5分钟、4℃下离心，然后重悬浮于冰冷的分选缓冲液中。

流式细胞术和分选

细胞群体用SORP-aria（BD Biosciences，San Jose，CA）或AriaFusion器械（BDBiosciences，San Jose，CA）进行分选。使用下述抗体对样品进行染色：eF780缀合的可固定的活力染料、eFluor450缀合的TER-119、APC缀合的CD45、FITC缀合的CD117（cKit）和PerCPCy5.5缀合的F4/80购自eBioscience，PerCP Cy5.5缀合的FCεRa1（MAR1）、APC-Cy7缀合的Ly6G、FITC缀合的CD3、PE-Cy7缀合的CD19、PE-Cy7缀合的CD31、APC-Cy7缀合的CD326、APC/Cy7缀合的TER-119、AF700缀合的CD45、太平洋蓝缀合的CD49b、PE缀合的Fcer1a、PE/Cy7缀合的CD117、FITC缀合的Ly6C、PE缀合的CD11c、BV605缀合的CD11b和BV605缀合的Ly-6C购自Biolegend，并且FITC缀合的CD11C购自BD-Pharmingen。

在分选之前，细胞用DAPI或可固定的活力染料进行染色，用于评估活/死细胞，然后通过40μm筛网过滤。在排除双峰、死细胞和红细胞后，对于整个免疫细胞群体的分选，样品就CD45

为了评估由肺嗜碱性粒细胞表达的受体的蛋白质水平，我们执行PE缀合的CD131（CSF2Rb，Miltenyi Biotec）、PE/Cy7缀合的IL-33R（Biolegend）和太平洋蓝缀合的CD49b（Biolegend）的细胞表面染色。为了评估由肺嗜碱性粒细胞表达的配体的细胞内蛋白质水平，使细胞与RPMI-1640一起在37℃下温育2小时，所述RPMI-1640补充有10% FCS、1mM 1-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素（Biological Industries）和GolgiStop（1:1000；对于IL-13，BD bioscience，San Jose，CA）、或布雷菲德菌素A溶液（对于IL-6，1:1000，Biolegend），以致使细胞内细胞因子的表达，并且防止其细胞外分泌。根据制造商的说明书（BD bioscience，San Jose，CA），使用Cytofix/Cytoperm试剂盒，将细胞洗涤，固定，渗透化处理，且就表面蛋白质和细胞内蛋白质进行染色。对于细胞内实验，使用下述抗体：PE-缀合的IL-6（Biolegend）、PE-缀合的IL-13（eBioscience）和匹配的同种型对照PE-缀合的大鼠IgG1（Biolegend）。使用BD FACSDIVA软件（BD Bioscience）和FlowJo软件（FlowJo，LLC）来分析细胞。

BM衍生的细胞培养物

BM祖先从C57BL/6 8周龄小鼠中收获，并且以0.5 × 10

对于BM嗜碱性粒细胞与肺衍生的单核细胞和未分化巨噬细胞的共培养，我们从PN30小时肺中分选CD45

MARS-seq文库制备

如先前所述（Jaitin等人，2014）制备单细胞文库。简言之，将来自分选到细胞捕获板内的细胞的mRNA进行条形码编码，并且转化成cDNA，并且使用自动化流水线合并。然后，将合并的样品通过T7体外转录进行线性扩增，然后将所得到的RNA片段化，并且在连接、RT和PCR期间，通过用池条形码和illumina序列给样品加上标签，转换成准备测序的文库。测试每个细胞池的文库质量，并且如较早描述的（Jaitin等人，2014）评价浓度。

肺驻留的嗜碱性粒细胞耗竭

对于新生小鼠肺中的嗜碱性粒细胞耗竭，我们基于先前的研究（Denzel等人，2008；Guilliams等人，2013）对方案进行校准。在出生之后10小时和15小时，分别用7µl 100μg抗Fcεr1α（MAR1；eBioscience）或IgG同种型对照（Armenian hamster，eBioscience），对小鼠进行i.n.注射。在出生之后30小时，从注射的新生小鼠中纯化肺，并且对CD45

吞噬作用测定

如较早描述的（Sharif等人，2014）执行吞噬作用测定。通过支气管肺泡灌洗（BAL）来分离AM。简言之，将小鼠的气管暴露，并且用无菌的18号venflon（BD Biosciences）进行插管，并且每次0.5ml滴注10ml的无菌盐水。使用Neubauer腔室，对回收的BAL流体（包含>95% AM）中的总细胞数进行计数。为了评价细菌的吞噬作用，将1–2.5 × 10

单分子荧光原位杂交（smFISH）

用PBS灌注7日龄的新生小鼠。将肺组织收获，并且在4℃下在4%多聚甲醛中固定3小时，在4℃下与在2%多聚甲醛中的30%蔗糖一起温育过夜，然后包埋在OCT中。将冷冻切片（6μm）用于杂交。如先前所述（Itzkovitz等人，2012，Stellaris Fish Probes # SMF-1082-5，SMF-1063-5，SMF 1065-5），来设计并构建探针文库。单分子FISH探针文库由48个长度20bp的探针组成。Il1rl1、Il33和Mcpt8探针的smFISH探针文库分别与Cy3、AF594和cy5偶联。杂交在30℃下执行过夜。在洗涤过程中添加用于核染色的DAPI染料。用配备有x60和x100油浸物镜的Nikon Ti-E倒置荧光显微镜、以及使用MetaMorph软件的Photometrics Pixis1024 CCD相机（Molecular Devices，Downington，PA），来拍摄图像。仅在细胞的DAPI染色内，对smFISH分子进行计数。

组织学和免疫组织化学

对于组织学检查，在指示的时间点获取石蜡包埋的肺切片。对于就proSP-C染色，将内源性过氧化物酶活性猝灭，并且用Antigen Unmasking Solution（VectorLaboratories，H-3300）回收抗原。阻断在驴血清中完成，载玻片然后用抗proSP-C（Abcam），随后用二级山羊抗兔IgG抗体（Vector Laboratories）进行染色，以及使用VectastainELITE试剂盒（Vector Laboratories）进行信号放大。对于F4/80染色，使用XIV型蛋白酶（SIGMA）回收抗原，随后为用兔血清的阻断，以及用大鼠抗小鼠F4/80 mAb（AbD Serotec）的染色。施加二级兔抗大鼠IgG Ab（Vector Laboratories），并且用Vectastain ELITE试剂盒（Vector Laboratories）放大信号。对于Mcpt8染色，使用抗GFP Ab（Abcam），随后为二级生物素化的兔抗山羊IgG Ab（Vector Laboratories）。对于检测，应用Peroxidase Substrate试剂盒（Vector）或Vector VIP Peroxidase Kit（Vector Laboratories）。细胞结构用苏木精或甲基绿进行复染，并且在Olympus FSX100 Microscope上拍摄照片。

对于整个叶分析，使用配备有Zeiss Axio Imager.Z1显微镜（Carl Zeiss Inc.，Jena，德国）的TissueFAXS成像系统（TissueGnostics GmbH），来扫描载玻片。使用PCOPixelFly相机（Zeiss）来拍摄图像。

组织清除

如较早描述的（Fuzik等人，2016）执行组织清除方案。简言之，在指示时间点下的肺用PBS灌注一次，并且其后用7.5%甲醛的PBS溶液进行灌注。将肺叶在室温下在7.5%甲醛的PBS溶液中固定过夜。在37°C下，使用CUBIC试剂1（25重量%尿素、25重量%

低水平处理和过滤

使用Illumina NextSeq 500，在58,585个读数/单细胞的中值测序深度下，对所有RNA-Seq文库（以等摩尔浓度合并）进行测序。如先前所述（Jaitin等人，2014），将序列映射到小鼠基因组（mm9），解复用且过滤，提取一组独特的分子标识符（UMI），其定义了单细胞中不同的转录物用于进一步处理。我们使用关于空MARS-seq孔的统计学（中值噪声2.7%；未显示），来估计数据中的虚假UMI水平。使用HISAT（版本0.1.6）（Kim等人，2015）来完成读数的映射；排除具有多重映射位置的读数。如果使用UCSC基因组浏览器用于参考，将读数映射到外显子，则将它们与基因相关联。在同一条链上共享基因组位置的不同基因的外显子，被视为具有连锁基因符号的单个基因。从分析中丢弃具有少于500个UMI的细胞。在过滤后，细胞含有2,483个独特分子/细胞的中值。所有下游分析都在R中执行。

数据处理和聚类

元细胞流水线（Giladi等人，2018）用于导出信息基因，并计算细胞间相似度，以计算K-nn图形覆盖率并导出细胞的内聚群（或元细胞）中的RNA分布，并且使用自举分析和关于重采样数据的图形覆盖率的计算来导出高度分离的聚类。在附图中描绘了该方法和下游分析的完整描述。除非另有说明，否则使用默认参数。

对于组合的免疫区室（CD45

为了将所得到的元细胞注释成细胞类型，我们使用了度量FP

表3

轨迹发现

为了推断轨迹并沿着发育伪时间比对细胞，我们使用公开的软件包Slingshot（Street等人，2017）。简言之，Slingshot是一种工具，其使用预先存在的聚类来推断谱系层次结构（基于最小生成树MST），并且在伪时间轨迹上比对每个聚类中的细胞。由于我们的数据很复杂，并且含有许多相连的组分和时间点，因此我们选择将Slingshot应用于互连细胞类型的子集，即E16.5单核细胞以及巨噬细胞II和III（数据集a）、以及成纤维细胞谱系（数据集b）。

对于数据集a，我们对具有

我们首先在E18.5天时观察到强AT1和AT2标记。这与祖先上皮细胞的消失平行。据此，我们假设在我们的发育队列中没有以高时间分辨率对精确的分支点进行采样，致使Slingshot对于这种特定情况无效。相反，我们检查了在E16.5天时的祖先上皮细胞是否可能已经朝向AT1或AT2引发。为了检测上皮祖先中的AT1 AT2引发，我们使用了公开的AT1和AT2的基因列表（Treutlein等人，2014），并且通过下述项计算了两个得分：

相互作用图

为了显现所有肺相互作用，我们使用公开的配体和受体对的数据集（Ramilowski等人，2015）。我们应用了宽松过滤，包括在至少一个元细胞中具有> 13个UMI的所有LR（针对元细胞大小进行标准化）。我们计算了对数转换的UMI（下采样至1000个UMI）之间的斯皮尔曼相关性，并且使用层次聚类来鉴定LR模块（具有K=15的cutree）。通过计算LR模块之间的斯皮尔曼相关性，并且连接具有ρ > 0.4的模块之间的边缘，我们构建了相互作用图形的支架，用Rgraphviz软件包生成图形。我们通过计算跨越具有ρ > 0.05的所有LR的平均

为了确定基质-基质的富集和免疫-免疫相互作用，我们对于每个LR确定它主要是在基质中还是在免疫区室中表达（log

对于图3E-H中的投影，如果细胞类型的表达比所有其它细胞中高出多于两倍，则它被确定为表达LR。

将细胞映射到肺聚类模型

给定现有的参考单细胞数据集和聚类模型、以及一组新的单细胞概况，我们对于每种新细胞提取对转化的标记物基因UMI具有最高的皮尔森相关性的K（K = 10）个参考细胞，如上所述。在这些K近邻上的聚类成员分布用于定义新的细胞参考聚类（通过多数投票）。

嗜碱性粒细胞概况分析、离体和共培养分析

我们使用MetaCell流水线来分析和过滤下述数据集：（a）肺和血液衍生的嗜碱性粒细胞（图4E-G）；（b）Il1rl1敲除和对照（图5G-H）；（c）离体生长的嗜碱性粒细胞（图5J-L，S5D）；以及（d）巨噬细胞和嗜碱性粒细胞的离体共培养物（图6L-M，S6J）。用默认设置来执行元细胞分析。在每个数据集中，我们通过选择针对中值具有

为了计算单细胞中基因的组合表达（图8E，K），我们计算了下述项：

TissueFAXS定量

TissueFAXS图像通过MATLAB（R2014b）进行处理。肺泡的分割通过定制流水线来执行。图像被转换为灰度，并且以15像素的磁盘大小进行增强、打开和关闭。通过强度阈值200来确定肺泡。丢弃大于300,000像素的区域。通过类似的流水线（磁盘大小 = 5像素）来执行核的分割，随后应用分水岭算法并检测局部最小值。将图像转换为L*A*B颜色空间，并且收集每个核的平均值。丢弃在切片边缘处的核。丢弃具有面积＜T

数据和软件可用性

所有报告的数据都被上载并存储在GEO，登录号GSE119228中。软件和自定义代码可通过请求获得。

实施例1

在发育过程中肺细胞类型的综合图

为了理解不同的免疫和非免疫细胞类型和状态对于肺发育和稳态的贡献，我们收集了沿着肺发育的关键时间点的单细胞概况。为了避免起源于细胞表面标记物或选择性组织解离程序的偏差，我们组合了宽泛的门控策略和容许的组织解离方案，导致位于肺中的免疫细胞和非免疫细胞的综合储库（未显示；方法）。我们对来自肺胚胎和出生后发育的多重时间点的细胞进行密集采样，并且执行与索引分选联接的大规模平行单细胞RNA-seq（MARS-seq）（Jaitin等人，2014）（图1A；且未显示）。我们收集了来自主要胚胎发育阶段的细胞：早期形态发生（E12.5）、小管期（E16.5）和囊状期（E18.5 - E19.5；晚期E）。我们进一步收集了来自紧在出生之后的出生后肺泡化期（出生后1、6、7和10小时；早期PN），出生后16和30小时（中期PN），以及出生后2天和7天的细胞（图1A）。为了构建肺细胞图，我们对来自17只小鼠的10,196个CD45

实施例2

肺区室化通过细胞动力学波而成形

在胚胎发生期间和出生之后不久，随着其成熟和突然暴露于空气中的氧，肺经历剧烈的环境变化。相应地，我们的分析显示了，元细胞组成在这些时间点下广泛不同（图2A）。在细胞类型水平上，在妊娠期间观察到免疫和非免疫组成中最突出的细胞动力学（图2B-C）。值得注意的是，由于组织解离方案可能影响细胞类型的丰度，因此它们只能被视为相对数量（未显示）。在最早的时间点（E12.5）下，免疫区室主要由巨噬细胞（CD45

根据先前的工作（Kopf等人，2015；Tan和Krasnow，2016），我们鉴定了三个不同的巨噬细胞子集，我们将其命名为巨噬细胞I-III。这些子集在发育过程中呈波浪状出现，其中巨噬细胞I在妊娠初期占优势，巨噬细胞II在出生前后达到顶点，而巨噬细胞III自从妊娠后期开始稳定增加，并且在PN第7天时变成大多数（图2D）。巨噬细胞I细胞在转录上不同于巨噬细胞子集II-III。值得注意的是，巨噬细胞子集II-III与E16.5单核细胞形成连续转录谱（图2E），提示了巨噬细胞II和III由胎儿肝单核细胞分化，而不是由可能具有卵黄囊起源的巨噬细胞子集I分化（Ginhoux，2014；Tan和Krasnow，2016）（图2E）。为了推断关于单核细胞和巨噬细胞子集的最可能分化轨迹，我们使用Slingshot用于伪时间推断（Street等人，2017），并且表征了从E18.5开始逐渐获取的巨噬细胞基因（晚期E，图2F）。Slingshot轨迹提示了巨噬细胞子集沿着发育时间点的线性过渡。在转录上，巨噬细胞I细胞表达高水平的

实施例3

肺嗜碱性粒细胞与免疫区室和非免疫区室广泛地相互作用

在多细胞生物中，组织功能随着异质细胞类型形成复杂的通讯网络而出现，所述通讯网络主要由配体与受体（LR）之间的相互作用介导（Zhou等人，2018）。在单个细胞图中检查LR对可以潜在地揭示影响组织命运的中央细胞组分（Camp等人，2017；Zhou等人，2018）。为了系统地绘制细胞之间的细胞相互作用，并揭示控制发育的潜在通讯因子，我们表征了所有肺细胞类型之间的LR对（图3A）。简言之，我们使用公开的将配体与其受体相联系的数据集（方法）（Ramilowski等人，2015），过滤了在至少一个元细胞中表达的所有LR，并且将每种配体或受体与其跨越所有细胞以及沿着发育时间点的表达谱相关联。

在发育的肺中，LR的模块主要按细胞类型聚类（未显示）。然而，对于某些LR，我们可以鉴定在发育过程中，在同一细胞类型中的表达水平的显著变化（未显示）。我们基于其关联结构来投影配体和受体，导致所有LR及其相互作用的图形表示，其突出显示了它们分离成细胞类型有关模块（图3B，方法）。肺LR图显示了免疫区室和非免疫区室的通讯模式之间的明确分离（图3C），其特征在于免疫区室（I）与自身之间、以及非免疫区室（NI）与自身之间的LR相互作用富集，以及区室之间的相互作用耗竭（I-I和NI-NI相互作用，p < 10

为了鉴定涉及区室之间和区室内的大量相互作用的重要的细胞通讯枢纽，我们检查了跨越不同细胞类型的LR表达模式（未显示）。根据非免疫区室，表达

实施例4

肺嗜碱性粒细胞的特征在于独特的空间定位和基因标记

鉴于嗜碱性粒细胞的丰富的相互作用概况（图3I），我们假设这些细胞可能通过响应肺线索和修饰微环境两者，在肺内的细胞通讯中具有中枢作用。为了鉴定肺嗜碱性粒细胞的空间定位，我们应用了Mcpt8

为了在分子水平表征肺嗜碱性粒细胞，我们寻求通过流式细胞术将其广泛分离。我们对数据中鉴定的嗜碱性粒细胞特异性标记物（CD45

值得注意的是，与其它肺免疫和非免疫细胞相比，配体

实施例5

IL33和GM-CSF印迹肺泡嗜碱性粒细胞的转录身份

由于肺驻留的嗜碱性粒细胞显示了独特的基因表达标记，因此我们分析了关于肺特异性信号的数据，所述信号可以充当肺嗜碱性粒细胞受体的分化线索（未显示）。

为了测试肺环境信号IL-33和GM-CSF是否直接负责诱导肺嗜碱性粒细胞表型，我们使用了体外系统，在其中我们在补充有这些细胞因子的培养基中培养骨髓（BM）衍生的嗜碱性粒细胞。我们在补充IL3的培养基中使BM衍生的细胞分化，通过cKit的阴性选择来分离嗜碱性粒细胞（BM-嗜碱性粒细胞），并且在单独的生长培养基（IL3）、或具有肺细胞因子环境的不同组合；GM-CSF和/或IL-33的存在下，将它们进行培养（图5I，8B-C）。我们发现IL-33和GM-CSF各自诱导特异性转录程序（图8D）。IL-33诱导了肺嗜碱性粒细胞基因标记的主要部分，包括配体

实施例6

肺嗜碱性粒细胞印迹具有肺泡巨噬细胞表型的幼稚巨噬细胞

关键的肺信号传导分子由嗜碱性粒细胞的表达促使我们探索其信号传导活性，以及在塑造其它肺驻留细胞的独特表型中的贡献。由于肺驻留的嗜碱性粒细胞高度表达三种重要的髓样生长因子

肺嗜碱性粒细胞对体内AM成熟的作用，使我们开始质疑肺嗜碱性粒细胞是否可以直接促进单核细胞或幼稚巨噬细胞朝向AM标记的转变。对于该假设，我们执行了体外共培养测定。在支持两种细胞类型（分别为M-CSF和IL-3）的生长培养基中，与或不与GM-CSF和IL-33的组合（引发嗜碱性粒细胞朝向肺嗜碱性粒细胞表型的环境信号传导），将BM衍生的幼稚巨噬细胞（BM-MΦ）单独或与BM嗜碱性粒细胞共培养（图9H，方法）。BM嗜碱性粒细胞与BM-MΦ的共培养在任何条件下都不改变先前表征的嗜碱性粒细胞表型（图9I）。然而，元细胞分析显示了，在与和不与嗜碱性粒细胞一起培养的BM-MΦ之间的明显区别（图6L）。重要的是，仅在肺环境引发的（GM-CSF + IL33）嗜碱性粒细胞的存在下生长的BM-MΦ，上调与AM相关的基因，包括抗炎（M2）模块（

尽管本发明已与其具体实施方案结合进行描述，但很明显，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，预期涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。

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参考文献