用于检测ACTN3基因型的引物探针组合产品

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于ACTN3基因型检测的引物探针组合产品。所述引物探针组合产品包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针。本发明提供的试剂盒用于ACTN3基因型检测，具有操作简单、快速的特点，为ACTN3基因型快速检测提供有效的技术手段，具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于ACTN3基因型检测的引物探针组合产品。

背景技术

ACTN3基因是一个研究得较为透彻的运动基因，针对运动员的统计发现，参加奥运会并取得顶级运动成绩的爆发力项目如短跑、举重等项目的运动员，ACTN3基因携带的比例远高于高水平耐力项目运动员，被认为是与短跑等爆发力运动相关的基因。ACTN3基因编码α辅肌动蛋白（α-actinin-3），钙蛋白在骨骼肌中起着结构作用，在肌肉收缩的过程中起一定作用。

rs1815739是该基因上一种常见的遗传变异，该基因16号外显子上单个碱基发生C→T的变化，使得577号氨基酸从精氨酸转变成终止密码子，阻止了功能性α-actinin-3蛋白的合成。不同的基因型在运动能力上有着明显的差异。CC型肌肉性能好，爆发力强，适合做短跑运动员。CT型复合型肌肉，爆发力一般，可能适合做短跑运动员。TT型肌肉爆发力弱，耐力强，适合做长跑运动员。

针对rs1815739进行基因分型，可以更好地指导运动员选拔，减少资源的浪费，获得最好的成绩。对rs1815739的快速分型，一方面有利于运动员的快速选拔，推荐我国体育事业的建设，另一方面对于普通市民，也可以起到更好地指导运动的效果，有利于全民健康的提升。

常规的SNP分型技术，包括AS-PCR、Taqman探针法、Sanger测序、质谱等，这些技术无一不需要复杂的仪器，使得SNP分型必须在有条件的中心实验室进行，大大限制技术的应用。恒温扩增技术对设备的要求较低，但目前的恒温扩增技术对单个碱基的区分效果不佳，并不适合应用于SNP检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一方面涉及引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1~4所示；

环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7~8所示，其中，两探针分别5’端第8、9位核苷酸为核糖核苷酸。

本发明的第二方面涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合产品。

本发明的第三方面涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于ACTN3基因型检测的试剂或试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1）本发明提供的试剂盒用于ACTN3基因型检测，具有操作简单、快速的特点，为ACTN3基因型快速检测提供有效的技术手段，具有重要意义。

2）本发明提供的试剂盒采用核糖核酸酶HII报告系统，与恒温扩增同步反应，在55~65℃条件下均可实现靶基因的有效扩增及检测，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，10-40min即可完成反应，检测结果准确、特异。

3）本发明方法中核糖核酸酶HII对探针和靶标序列具有高度特异性，只有扩增产物和探针序列完全互补探针才会被切断，从而产生报告信号，对单碱基变化的识别效果优于其他基于引物的识别方法，使结果的特异性、准确性大大提高。

4）检测所需反应条件简单，对硬件要求低，成本较低，对受试者无伤害，利于技术的广泛推广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中对不同探针的验证结果；

图2为本发明一个实施例中真实样本的检测结果；

图3为本发明一个实施例中试剂盒稳定性检测结果；

图4为本发明一个实施例中使用胶体金免疫层析卡报告的检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及引物探针组合产品，其包含F3和B3组成的外引物对和FIP和BIP组成的内引物对，以及环引物和探针；

F3、B3、FIP、BIP的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1~4所示；

环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5~6所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7~8所示，两探针分别5’端第8、9位核苷酸为核糖核苷酸。

FIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3端有与靶序列的F2c区互补的F2区并且在5端有与靶基因的F1c区相同的序列。

F3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因F3c区互补的F3区。

BIP是通过如此方式生成的引物，致使它在3'端有与靶序列B2c区互补的B2区并且在5端有与靶基因Blc区相同的序列。

B3是通过如此方式生成的引物，致使它有与靶基因B3c区互的B3区。

使用本发明引物组时，可加入一或两类环状引物（LF引物或LB引物）以便加速核酸扩增反应。设计这样的环状引物以使其退火至F1和F2之间的区域或B1和B2之间的区域，然后加入到LAMP反应系统。这样，这些引物与在核酸扩增过程中未使用的环状部分结合，以致利用所有的环状部分作为起点促进核酸反应，从而加速核酸扩增反应。

上述引物探针组合产品能够配合核糖核酸酶 HII实现对ACTN3基因型更加灵敏和特异性的诊断。

核糖核酸酶 HII（RNase HII）为核糖核酸内切酶，适用于在双链 DNA 内部切刻核糖核酸的 5´ 末端，产生 5´ 磷酸和 3´ 羟基末端。RNase HII可以特异性地识别DNA双链中的RNA碱基，并使RNA碱基5’方向连接DNA碱基的磷酸二酯键断裂，导致DNA双链在RNA碱基的5’方向产生了一个切口。在生物体内，通过该切割引发DNA修复，可去除双链DNA中的RNA碱基，确保遗传信息的准确性。本发明基于RNase HII对底物严格配对要求的特性，设计了一种单链探针，该探针内部嵌入了RNA碱基，并将RNase HII应用于扩增系统的报告体系中。由于RNase HII只能识别和切割双链，因此不会作用于单链的探针。在合适的温度下，当环境中存在与探针互补配对的单链DNA，探针会与之杂交，并被RNase HII在特定位置切断，被切断的探针熔解温度下降，无法保持与互补单链DNA稳定结合并解离出来，互补的单链可以结合新的探针开始新一轮循环，实现信号的扩大。整个过程中，通过RNase HII的切割，把与探针互补单链DNA的输入转化成探针断裂的输出，通过碱基的互补配对原则确保生成的产物的特异性，同时实现信号的放大，通过检测探针断裂的情况获得检测结果。

需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1~8所示的引物或探针具有大于80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰，以及引入碱基替代物，并且可根据标准技术制备。

术语“碱基替代物” 为不含有碱基，又连接核酸链上下游保持探针整体的完整性，也不妨碍核酸链杂交的结构。例如，当靶序列中出现不需要被检测的多态性位点，可以通过将探针对应位置的碱基以碱基替代物替换来实现简并分析。碱基替代物常用脱氧核苷酸间隔物（dSpacer）或C3间臂（Spacer）。碱基替代物的数量可以为1、2、3、4、5、6个。

术语“%同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，%同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。

对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST (Altschuletal., 1990、J Mol Biol 215:3, 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic AcidsRes25:17, 3389-402)确定百分比同一性。

引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。

碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。

此外，除特别强调的位点以外，如本领域技术人员所通常理解的，探针总体上由DNA碱基所组成。同理，引物也由DNA碱基所组成。

在一些实施方式中，探针的RNA碱基对应SNP位点碱基。

在一些实施方式中，探针的RNA碱基对应SNP位点相邻位置的碱基。

在一些实施方式中，还可以通过在探针的3’末端加入与靶标序列无关的核酸序列，实现3’末端的封闭。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自乙二醇、C9间臂（Spacer 9）、C18间臂（Spacer 18）、双脱氧间臂[1’,2’-Dideoxyribose (dSpacer)]、C3间臂（C3 Spacer）中的任一种。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自C3间臂。

在一些实施方式中，所述探针在核糖核苷酸两侧的DNA碱基分别标记有荧光基团和淬灭基团。

在一些实施方式中，所述探针的荧光基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。

在一些实施方式中，所述探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。

在一些实施方式中，针对不同等位型的探针标记激发/发射光波长相同或相近的荧光基团，不同的探针通过分管等物理间隔方式分别进行扩增和检测。

在一些实施方式中，针对不同等位型的探针标记不同激发/发射光波长的荧光基团，不同的探针在同一个液体体系中反应，通过荧光信号的差异区分样本的基因型。

在一些实施方式中，所述探针在核糖核苷酸两侧的DNA碱基分别标记有用于和蛋白作用的分子，所述分子选自生物素、地高辛以及FITC中的任一种。

本发明还涉及试剂盒，其含有如上所述的引物探针组合产品。

术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。

在一些实施方式中，所述试剂盒还含有如下成分中的至少一种：

核糖核酸酶 HII、样本裂解液、对照、恒温扩增反应所需试剂以及免疫层析检测卡。

根据反应温度不同，可以使用不同的RNase HII。在一些实施方式中，反应温度为50℃~70℃，优选55℃~65℃，使用嗜热的，如

在一些实施方式中，所述恒温扩增反应所需试剂含有如下成分中的至少一种：

具有链置换能力的DNA聚合酶、dNTPs、Mg

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

本发明中所采用的酶可以是野生型酶，也可以是经过序列优化的突变型酶（通常是酶活性增强，或者具有其他优选的性能，例如更好的热稳定性）。

各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后（在所述制造后物质通常作为粉末存在）被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供恒温反应所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始恒温反应过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。在一些实施方式中，所述恒温扩增反应所需试剂为冻干试剂。

在一些实施方式中，免疫层析检测卡的报告系统选自胶体金、乳胶、胶体铁、标记的荧光分子以及荧光量子点中的任一种。

在一些实施方式中，单个免疫层析检测卡针对单种等位型进行检测。

在一些实施方式中，单个免疫层析检测卡针对两种或以上的等位型进行检测。

根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述的引物探针组合产品在制备用于检测ACTN3基因型的诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还涉及如上所述的引物探针组合产品、或如上所述的试剂盒在检测ACTN3基因型中的用途。

在一些实施方式中，检测的温度为50℃~70℃，优选55℃~65℃，也可以选择60℃。

检测的温度可通过水浴提供。

在一些实施方式中，检测的时间为10~60分钟；例如15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、50分钟；优选30分钟。

这样的用途可以用于检测ACTN3基因型。

检测ACTN3基因型所用的样本优选为受试者的口腔标本（如口腔拭子等），非侵入性的采样可有效保护受试者。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1 一种ACTN3基因型荧光法检测试剂盒检测方法的建立

对ACTN3基因SNP位点rs1815739周边序列进行保守性的分析，进行引物及针对rs1815739的探针设计。设计的引物及探针如下：

A组：

引物F3：5’-TGTTGCCTGTGGTAAGTGG-3’ （SEQ ID NO：1）

引物B3：5’-GGGCTGAGGGTGATGTAGG-3’ （SEQ ID NO：2）

引物FIP：5’-TGCCTTGAACTGATCGTGCGCGGGACACCAGCTGACACT-3’ （SEQ ID NO：3）

引物BIP：5’-CCATCATGGGCATCCAGGGTATTGGTGGAGCAGGGCC-3’ （SEQ ID NO：4）

引物LF：5’-AGGCTCTGGGGACGACA-3’ （SEQ ID NO：5）

引物LB：5’-GAGATCCAGAAGATCTGCCAGA-3’ （SEQ ID NO：6）

引物探针C：5’-CGCTC[dT-BHQ1]C[rG]GT[dC-FAM]AGCC-3’ （SEQ ID NO：7）

引物探针T：5’-TCGCTC[dT-BHQ1]C[rA]GT[dC-FAM]AGCCT-3’ （SEQ ID NO：8）

引物探针C（17 base）：5’-TCGCTC[dT-BHQ1]C[rG]GT[dC-FAM]AGCCT-3’

引物探针C（13 base）：5’-GCTC[dT-BHQ1]C[rG]GT[dC-FAM]AGC-3’

引物探针T（19 base）：5’-CTCGCTC[dT-BHQ1]C[rA]GT[dC-FAM]AGCCTC-3’

引物探针T（15 base）：5’-CGCTC[dT-BHQ1]C[rA]GT[dC-FAM]AGCC-3’

引物组搭配不同长度的探针，分别对C、T等位型的质粒和空白（NF-H

结果如图1所示。不同探针对空白组检测均无非特异反应。对于不同长度探针，长探针会导致等位型区分能力降低，短探针的阳性信号则偏低。本发明后续的实施例，以引物及中等长度探针（C-15 base，T-17 base）配制反应体系。

检测方法的建立

本发明构建一种基于恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统的检测ACTN3基因型的试剂盒，包括样本裂解液，恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块，分别对应两种表位型的C对照和T对照，其中样本裂解液含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块中反应体系最优配比如表1所示，包含了本实施例所述的荧光标记探针及所述的引物；对照为含有ACTN3靶标基因质粒，C、T对照在rs1815739位点上的核苷酸分别为C和T。

表1 反应模块反应体系配比

所述反应体系的反应条件为：50-65℃下反应10-60min。

最佳反应条件为：63℃反应30min。

试剂盒的检测流程如下：

步骤一、样本处理。将15 μL样本裂解液和10 μL C对照/T对照/待检样本震荡混匀，室温静置5 min；

步骤二、将步骤一产物全部加入恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：63℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号，30min可完成检测；

步骤三、结果判定。

①C对照：C探针体系中有典型的扩增曲线出现，终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上；T探针体系中无扩增曲线出现，或终点荧光值低于起点荧光值的3倍；符合以上两点为有效结果；

②T对照：T探针体系中有典型的扩增曲线出现，终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上；C探针体系中无扩增曲线出现，或终点荧光值低于起点荧光值的3倍；符合以上两点为有效结果；

③被检样本：

a.若单一探针体系中终点荧光值高于等于起点荧光值3倍以上，判断为该等位型的纯合子；

b.若两探针体系中终点荧光值均高于等于起点荧光值3倍以上，判断为杂合子；

c.若两探针体系中终点荧光值均低于起点荧光值的3倍，判断为异常，重新检测或重新采样检测。

实施例2 ACTN3基因型荧光法检测试剂盒真实样本分析

使用试剂盒分析基因型已知的4例口腔拭子（CC型1例，TT型1例，CT型2例），检验试剂盒对真实样本的检测效果。

具体操作如下：

分别取4例的口腔拭子，以及C、T对照进行检测，记录结果。

结果如图2所示。C、T对照检测结果正常。4例样本的检测结果均与已知的基因型相吻合。表明试剂盒对真实口腔拭子样本的检测准确有效。

实施例3 ACTN3基因型荧光法检测试剂盒稳定性测试

液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。本试剂盒将包含恒温扩增体系及核糖核酸酶HII报告系统的荧光法反应模块在真空干燥成粉状试剂，冻干后的粉状试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易。本实施例对ACTN3基因型荧光检测试剂盒的稳定性进行验证。

具体操作如下：

将含有冻干试剂的八连管密封于含有干燥剂的铝箔袋中，保存于37℃恒温箱。分别于0天、30天、90天、180天，取冻干试剂进行测试。

分别取C对照、T对照进行检测，记录结果。

结果如图3所示。分别对保存了0天、30天、90天、180天的反应模块试剂冻干粉进行测试，本发明的试剂盒中试剂冻干后，在0天、30天、90天、180天的检测结果均为符合。表明本发明的试剂盒中试剂冻干后，在37℃中能稳定保存至少3个月。

实施例4 一种ACTN3基因型分型胶体金检测试剂盒检测方法的建立

胶体金、乳胶等免疫层析卡，通过肉眼可观测的颜色变化判定检测结果，较通过荧光进行判读的检测设备相比，省去了荧光激发和读数的模块，成本更低，也更适用于实验室外的检测场景。

本实施例构建以胶体金免疫层析卡为报告系统的检测试剂盒。

本实施例的试剂盒构成和实施例1基本一致，差异点为：（1）探针修饰从荧光标记调整为可被免疫层析卡识别的标记；（2）在实施例1试剂盒组成的基础上，增加用于扩增产物检测的胶体金免疫层析卡。

本实施例使用的探针序列：

引物探针C：5’-biotin-CGCTCTC[rG]GTCAGCC-digoxin-3’ （SEQ ID NO：7）

引物探针T：5’-biotin-TCGCTCTC[rA]GTCAGCCT-digoxin-3’ （SEQ ID NO：8）

使用的胶体金免疫层析卡分为3个区域：样本垫、NC膜、吸水垫。

样本垫上含有标记了地高辛抗体的纳米金颗粒。NC上按顺序分别是质控线（C线）和检测线（T线），C线上固定了链霉亲和素，T线上固定了羊抗鼠二抗，可以识别标金的地高辛抗体。

当样本中不存在与探针一致的等位型时，探针保持完整，形成金标地高辛抗体-探针-链霉亲和素复合物，所有的纳米金颗粒都被C线捕获，C线显色，T线不显色。当样本中存在与探针一致的等位型时，探针部分/全部被切断，金标地高辛抗体-探针-链霉亲和素复合物形成减少或无法形成，纳米金颗粒不能被C线完全捕获，无法捕获的纳米金颗粒继续流动继而被T线捕获，C线显色或不显色，T线显色。

检测流程如下：

步骤一、样本处理。将30 μL样本裂解液和20 μL 对照/待检样本震荡混匀，室温静置5 min；

步骤二、分别将25 μL步骤一产物加入C、T反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即反应；反应程序为：63℃ 30分钟；

步骤三、将每管步骤二的产物分别加到不同的胶体金层析卡的样本垫上，等待5min，观察结果；

步骤三、结果判定。

①C对照：C体系上样的检测卡：T线显色；T体系上样的检测卡：C线显色，T线不显色；

②T对照：C体系上样的检测卡：C线显色，T线不显色；T体系上样的检测卡：T线显色；

③被检样本：

a.若单一探针体系的检测卡T线显色，判断为该等位型的纯合子；

b.若两探针体系的检测卡T线均显色，判断为杂合子；

c.若任一体系中C、T线均不显色，或，两体系中T线均不显色，判断为异常，重新检测或重新采样检测。

针对3例基因型已知的口腔拭子样本进行检测，结果如图4所示，胶体金免疫层析卡的检测结果与已知基因型相吻合。表明系统的有效性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。