基于Taqman探针和染料相结合的液滴数字PCR用于PIK3CA基因E545K三种基因型的检测

摘要

目的:针对目前实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)和液滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)只能检测已知突变位点的不足，尝试建立一种基于Taqman探针和染料相结合的ddPCR方法用于检测未知突变序列，并应用该方法检测PIK3CA基因E545K突变位点的三种基因型（野生型、杂合突变型和纯合突变型）。
　　方法:本研究属于方法学研究，即先建立方法，然后与已有方法进行统计学分析比较，确定方法的可靠性。
　　1.选择包含PIK3CA基因的野生型（MCF-7细胞）和杂合突变型（H460细胞）细胞系以及合成包含PIK3CA基因的纯合突变型双链DNA，针对PIK3CA基因E545K突变位点设计合成特异性引物及一对野生型(FAM标记)和突变型（VIC标记）探针。
　　2.提取各细胞系的核酸，PCR扩增后测序扩增产物，确定各细胞系包含的PIK3CA基因E545K位点的基因型。
　　3.实时定量PCR检测引物和探针的特异性，初步建立基于Taqman探针和DNA结合染料(EvaGreen)联合使用的qPCR反应体系，并优化反应体系，使三种基因型纯样本之间的qPCR终荧光信号值差别最大，从而便于对三种基因型纯样本进行鉴别区分。
　　4.理论上qPCR反应体系可以直接应用于ddPCR，但在实际实验中需要对体系的某些条件进行微调，然后以qPCR反应体系为基础，应用ddPCR建立和优化双探针法（野生型+突变型）与野生型探针联合EvaGreen染料的方法，用于PIK3CA基因E545K突变位点三种基因型的检测，确保能够从ddPCR结果图中清晰的区分不同基因型的液滴团。
　　5.应用上述两种ddPCR方法对同时含有三种基因型的混合样本进行定量检测，分别得到三种基因型的拷贝数，对三组数据分别做配对样本均数的t检验，通过P值判断两种检测方法所得到的结果的差异是否具有统计学差异，验证方法的可靠性。
　　结果:1.由染料法qPCR优化体系及PCR循环条件，得到最佳退火温度为62℃，此时体系扩增效率（amplification efficiency，E）E=0.9181。良好的扩增效率可降低ddPCR中各液滴之间因扩增效率不同导致的荧光信号差异和结果的不准确。
　　2.采用qPCR双探针体系分别检测三种基因型纯样本，由扩增曲线可知探针特异性良好。
　　3.初步建立了联合使用野生型探针和EvaGreen染料的qPCR体系，分别对等拷贝数的三种基因型纯样本进行扩增检测，优化后各样本间野生型探针(VIC)信号差值最大。
　　4.基于ddPCR建立的双探针法体系，经优化可用于检测同时含有三种基因型的混合样本，包含不同基因型的液滴团可清晰区分。
　　5.基于ddPCR建立的联合使用野生型探针和EvaGreen染料的体系，优化后也可检测同时包含三种基因型的混合样本，各基因型对应的液滴团清晰可分。
　　6.应用ddPCR的双探针法和联合使用野生型探针和EvaGreen染料两种方法分别对同一组含有三种基因型的混合样本进行检测，分别得到三种基因型的拷贝数，分别对三组样本数据进行配对样本均数的t检验。野生型组:P=0.954＞0.05;杂合突变型组:P=0.451＞0.05;纯合突变型组:P=0.308＞0.05，说明两种检测方法差异无统计学意义。
　　结论:成功建立了基于ddPCR联合使用TaqMan探针和染料检测PIK3CA基因E545K突变位点三种基因型的方法。该方法只使用野生型探针，可检测与此野生型探针序列不匹配的任何SNP或其他类型的突变，打破了普通双探针法只能对突变型探针所设计的己知突变位点进行检测的局限，有望降低多突变位点检测的成本，并用于突变的筛查。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 细胞株及合成样本DNA

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂

1．4 主要溶液配制

1．5 引物探针设计合成

2．实验方法

2．1 细胞培养及收集

2．2 基因组DNA的提取

2．3 超声裂解基因组DNA

2．4 PCR扩增及产物纯化、测序

2．5 qPCR体系的建立

2．6 ddPCR体系的建立

2．7 双探针法ddPCR与联合使用TaqMan探针和染料法ddPCR的比较

结果

1．基因组DNA超声断裂效果

2．PCR扩增及产物纯化、测序

3．qPCR

3．1 最适退火温度及溶解曲线分析

3．2 扩增效率分析

3．3 探针特异性分析

3．4 比较相同拷贝数的三种样本在相同单探针和染料实时定量PCR体系下荧光信号的差异

4．ddPCR

4．1 基于双探针法ddPCR检测PIK3CA基因E545K突变位点的野生型、纯合突变型及杂合突变型基因

4．2 基于联合使用TaqMan探针和染料法ddPCR检测PIK3CA基因ES4SK位点的野生型、纯和突变型及杂合突变型基因

4．3 双探针法ddPCR与联合使用TaqMan探针和染料法ddPCR的比较

讨论

结论

参考文献

综述 浅谈液滴数字PCR的研究进展

致谢