一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法

摘要

本发明涉及类器官培养技术领域，具体公开了一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法。本发明的培养方法包括以下步骤：S1.解冻未经处理的肿瘤类器官以产生细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入至基础培养基中混匀离心，除上清液，得肿瘤类器官混合物；S2.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，重悬后将类器官混合物接种至含有y27632的类器官培养基中进行培养；S3.当肿瘤类器官混合物第一次换液后，吸除类器官培养基，然后加入含有Nutlin3A的培养基进行持续培养。本发明培养方法成本价格低，无需进行测序，在肿瘤类器官培养早期节省了检测成本，又实现了精准简化地培养肿瘤类器官。

说明书

技术领域

本发明涉及类器官培养技术领域，尤其是涉及一种基于P53突变筛选肿瘤 类器官的培养方法。

背景技术

目前，随着靶向药物研究的持续深入，多种靶向特定致癌基因的药物不断 进入临床，给广大患者带来了福音。然而，由于癌症的本质是受多基因突变影 响的疾病，患者肿瘤会随着疾病的进展而不断演化，导致形成患者间的肿瘤异 质性和同一肿瘤内的异质性。癌症异质性给靶向精准治疗增加了不确定性，同 时也是导致癌症药物治疗耐药性的重要原因之一。为此，拓展针对癌症异质性 的精准医疗具有重要的现实意义，而肿瘤类器官技术的兴起则为此提供了全新 的更加有效的应用平台。

类器官是将具有成体干细胞潜能的细胞或组织在体外进行3D培养而成的 三维微观结构。基于患者肿瘤组织的类器官培养被称为肿瘤类器官培养。肿瘤 类器官具备自主生长及更新的能力，并且可以保留肿瘤组织特点和一定的遗传 稳定性，因此与传统二维培养的肿瘤细胞系相比，肿瘤类器官具有更高的临床 相关性和个体多样性，是目前最接近临床状况的体外肿瘤疾病模型。在技术应 用上，肿瘤类器官疾病模型不仅在癌症的精准医疗上可用于指导患者用药的选 择，同时在抗癌药物研发中，基于保有患者癌症异质性的标本库的建立，肿瘤 类器官模型可更有效的评估临床前或临床试验中的先导化合物针对特定类型癌 症的药效。肿瘤类器官已成为肿瘤基础研究中既模拟肿瘤生长的“环境”又具有患 者特异性(优于实验动物模型)的最佳疾病模型，为临床研究和治疗中“有测序无 靶点，有靶点无药物，有药物无疗效”的困境带来了曙光。正因为肿瘤类器官能 够保留原始肿瘤的性质，从而通过对肿瘤类器官的药物测试，可为肿瘤来源的 病人选取考虑其癌症异质性的治疗方案，由此促进了癌症精准治疗的进一步研 究和发展。然而，肿瘤类器官的培养技术面临着一些未知和挑战。挑战之一， 肿瘤组织中往往混杂着正常组织，如选择的培养基不正确，随着传代培养，源 自正常组织的类器官会逐渐替代肿瘤类器官，导致所培养的肿瘤类器官群体逐 渐丧失肿瘤特性，使得针对肿瘤类器官的药敏测试得出非患者实际肿瘤状况的 实验数据，对临床用药产生误导，以致延误患者选择精准有效药物的时间。

目前，多种方法已经用于应对上述挑战。以肿瘤肿瘤类器官为例，基于肿 瘤类器官在物理特性、细胞特性、肿瘤特有基因突变方面同正常类器官的区别， 研究者采用过四种对肿瘤类器官进行特异性筛选的培养方法，但这些方法均存 在着操作繁琐或对实验室要求很高等明显限制因素。第一种方法是在培养过程 中人工操作处理，即在显微镜下使用工具剔除无“癌症类器官特征”、表型“正常” 的类器官，该方法可行性低、错误率高；第二种方法是利用流式细胞仪将肿瘤 组织细胞中的癌症干细胞分选提取，利用筛选出的高纯度的特定肿瘤细胞进行 类器官培养，该方法不仅对硬件要求高，同时也存在所选特定癌细胞无法反映 患者主要肿瘤性质的风险；第三种方法是根据已知的患者测序结果，调整培养基成分，筛选显示特定的癌症相关突变表型的类器官，该方法的问题是患者测 序结果的获得往往滞后于肿瘤类器官的起始培养时间；第四种方法是通过对培 养获取的肿瘤类器官进行测序来确定是否有与患者癌症相关的突变，该方法存 在成本高和效率低的问题。

P53基因是一种应激反应性肿瘤抑制基因，该基因编码一种分子量为53kDa 的蛋白质，对细胞周期和凋亡起关键性作用，能够抑制并杀灭肿瘤细胞，与癌 症的发生发展紧密相连，大约50％的人类癌症中存在P53突变。临床研究证实 肿瘤中95.1％的P53点突变主要发生在高度保守的175、245、248、249、273 和282位点。由P53基因编码的蛋白质是一种转录因子，控制着细胞周期的启 动，从细胞分裂初始这个蛋白就起着决定性作用了。如果这个细胞受损，又不 能得到修复，则P53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡中死去。有 P53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。

临床研究和治疗中选择靶向药物的主要依据是肿瘤基因测序，肿瘤类器官 培养方法虽然能够精准模拟体内肿瘤微环境，在稳定的传代后获得类器官模型， 但并不能提前检测P53基因突变，因此需要借助基因测序来确定类器官是否存 在P53突变。但是基因测序成本昂贵，操作较为复杂，且需要较大的样本量。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种基于P53突变 筛选肿瘤类器官的培养方法，肿瘤类器官培养方法可以精准模拟相关微环境， 从而提前确认肿瘤类器官P53基因是否发生突变，本发明的培养方法不需要基 因测序来确定类器官是否存在P53突变，极大的降低了实验及检测成本，且操 作也简单，不需要很大的样本量，同时又实现了精准地培养肿瘤类器官。

本发明的第一目的是提供了一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法， 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.解冻未经处理的肿瘤类器官以产生细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入至基 础培养基中混匀离心，除上清液，得肿瘤类器官混合物；

S2.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，重悬后将肿瘤类器官混合物接种至 含y27632的类器官培养基中进行培养；

S3.当肿瘤类器官混合物第一次换液时，吸除培养基，然后加入含有Nutlin3A 的类器官培养基进行持续培养。

本发明首次在肿瘤类器官培养方法中加入Nutlin3A，提前检测肿瘤类器官 P53基因是否发生突变，由试验例一和试验例二可知，当肿瘤类器官中P53基因 没有发生突变时，则表现为肿瘤类器官发生凋亡现象，当肿瘤类器官中P53基 因发生突变时，则表现为肿瘤类器官生长状况良好，说明本发明培养方法可以 筛选出肿瘤类器官是否发生了P53突变，不需要基因测序来确定类器官是否存 在P53突变，同时又实现了精准地培养肿瘤类器官；极大的降低了实验成本， 且操作也简单，不需要很大的样本量；本发明的培养方法具有高准确性、高灵 敏性的技术优势，培养结果稳定，具有明显优势。

其中，在培养过程中加入y27632，其作用是防止类器官生长初期由于细胞 较为零散导致的失巢效应，辅助类器官的培养。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述步骤S1中的基础培养基的 成分包括体积分数为97％的Advanced DMEM/F12、体积分数为1％的Glutamax、 体积分数为1％的HEPES和体积分数为1％的Penicillin-Streptomycin。

在本发明的技术方案中，将步骤S1中的细胞悬浮液加入至基础培养基中， 促进细胞的生长，添加Glutamax取代L-谷氨酰胺，为类器官提供重要的能量来 源，可以有效维持类器官的生长活率，促进生长，进而可提高其生产效力。

添加HEPES是一种优良的缓冲剂，能够防止保存液pH波动对细胞生长不 利的影响，可以促进类器官的生长。当类器官不再在CO

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述Glutamax的摩尔浓度为2 mM。

当基础培养基中Glutamax的摩尔浓度为2mM时，促进类器官的生长状况， 减少类器官发生解离的现象。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述HEPES在基础培养基中的 摩尔浓度为10mM。

当HEPES在基础培养基中的摩尔浓度为10mM，可以达到稳定维持类器官 体系的pH值，避免HEPES浓度过低时缓冲能力不高，HEPES浓度过高时对细 胞有害等情况。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述步骤S2中的类器官培养基 包含以下成分：

Advanced DEME/F12、Glutamax、HEPES、Penicillin-Streptomycin、B27、 N2、N-乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、[Leu15]-gastrin I human、EGF、FGF10、 HGF、Forskolin、A83-01和Rspondin-1human。

本发明的类器官培养基以各类生长因子的组合刺激细胞的相关增殖通路， 持续诱导细胞生长，从而形成可长期扩增并维持的类器官。

B27、N2、N-乙酰-半胱氨酸和Nicotinamide作为类器官生长的必要补剂；[Leu15]-gastrin I human和Forskolin可以维持长时间的类器官活性；EGF、FGF10 和HGF可以促进类器官的生长。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述步骤S2中的类器官培养基 中y27632的摩尔浓度为5-10μM。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述步骤S3 Nutlin3A在类器官 培养基中的摩尔浓度为3.125-50μM。

在本发明的技术方案中，Nutlin3A在类器官培养基中的摩尔浓度为 3.125-50μM，可以提前检测肿瘤类器官P53基因是否发生突变，极大的降低了 实验成本。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述步骤S3 Nutlin3A在类器官 培养基中的摩尔浓度为50μM。

当Nutlin3A在类器官培养基中的摩尔浓度为50μM时，使得野生型P53的 类器官全部致死，存活情况差，反而可以很好的筛选肿瘤类器官P53基因是否 发生突变，无需进行测序，在肿瘤类器官培养早期节省了检测成本，又实现了 精准简化地培养肿瘤类器官。

作为本发明所述培养方法的优选实施方式，所述步骤S3中加入含有 Nutlin3A的类器官培养基进行再次培养1-5天。

本发明的第二目的是提供了上述培养方法在筛选具有P53突变的肿瘤类器 官上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，成本价格 优势明显，无需进行测序，并且在肿瘤类器官早期检测方面的灵敏度更高；

2、本发明提供了一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，具有高准 确性、高灵敏性的技术优势，培养结果稳定，实现了精准地培养肿瘤类器官， 具有明显优势。

附图说明

图1为本发明中实施例1-5的培养方法测试野生型P53的肿瘤类器官的存活 情况图；

图2为本发明中实施例1和对比例1的培养方法筛选具有P53突变的肿瘤 类器官试验图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，基础培养基中成分的来源与型号如下表1所示。

表1

在以下实施例中，Nutlin3A来源于广州糖姆式生命科学有限公司，型号为675576-98-4。

类器官培养基中成分的来源与型号如下表2所示。

表2

在实施例1-5中，使用DMSO溶液溶解Nutlin3A粉末，配制成浓度为100mM 的Nutlin3A溶液，保存于-80℃。

基础培养基的成分由体积分数为97％的Advanced DMEM/F12、体积分数为 1％的Glutamax、体积分数为1％的HEPES和体积分数为1％的 Penicillin-Streptomycin构成。

在实施例1-5中，肿瘤类器官来源于厦大附属中山医院的肝癌组织。

实施例1

一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.提前预热24孔板、基础培养基、PBS缓冲液、含y27632的类器官培养 基，提前预冷Matrigel基质，将实验所需耗材提前紫外灭菌30分钟；

S2.分装10ml基础培养基于15ml离心管中，将未经处理的肿瘤类器官在 37℃水浴解冻以产生细胞悬浮液，将0.5ml细胞悬浮液加入到上述10ml基础培 养基中，吹打混匀；将离心管置于0℃、333g条件下离心5分钟，吸除上清， 得肿瘤类器官混合物；

S3.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，以每孔40μl细胞悬液接种入24孔 板内；基质胶凝固后，每孔加入500μl预热的含y27632(摩尔浓度为10μM) 的类器官培养基，周围各孔加入900μl预冷的PBS缓冲液，将24孔板置于细胞 培养箱内培养，每3-4天换一次液；

S4.当肿瘤类器官混合物第一次换液时，吸除培养基，然后加入500μl含有 摩尔浓度为50μM Nutlin3A溶液的类器官培养基进行持续培养。

实施例2

一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.提前预热24孔板、基础培养基、PBS缓冲液、含y27632的类器官培养 基，提前预冷Matrigel基质，将实验所需耗材提前紫外灭菌30分钟；

S2.分装10ml基础培养基于15ml离心管中，将未经处理的肿瘤类器官在 37℃水浴解冻以产生细胞悬浮液，将0.5ml细胞悬浮液加入到上述10ml基础培 养基中，吹打混匀；将离心管置于0℃、333g条件下离心5分钟，吸除上清， 得肿瘤类器官混合物；

S3.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，以每孔40μl细胞悬液接种入24孔 板内；基质胶凝固后，每孔加入500μl预热的含y27632(摩尔浓度为10μM) 的类器官培养基进行培养，周围各孔加入900μl预冷的PBS缓冲液，将24孔板 置于细胞培养箱内培养，每3-4天换一次液；

S4.当肿瘤类器官混合物第一次换液时，吸除培养基，然后加入500μl含有 质量浓度为25μM Nutlin3A溶液的类器官培养基进行持续培养。

实施例3

一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.提前预热24孔板、基础培养基、PBS缓冲液、含y27632的类器官培养 基，提前预冷Matrigel基质，将实验所需耗材提前紫外灭菌30分钟；

S2.分装10ml基础培养基于15ml离心管中，将未经处理的肿瘤类器官在 37℃水浴解冻以产生细胞悬浮液，将0.5ml细胞悬浮液加入到上述10ml基础培 养基中，吹打混匀；将离心管置于0℃、333g条件下离心5分钟，吸除上清， 得肿瘤类器官混合物；

S3.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，以每孔40μl细胞悬液接种入24孔 板内；基质胶凝固后，每孔加入500μl预热的含y27632(摩尔浓度为10μM) 的类器官培养基进行培养，周围各孔加入900μl预冷的PBS缓冲液，将24孔板 置于细胞培养箱内培养，每3-4天换一次液；

S4.当肿瘤类器官混合物第一次换液时，吸除培养基，然后加入500μl含有 摩尔浓度为12.5μM Nutlin3A溶液的类器官培养基进行持续培养。

实施例4

一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.提前预热24孔板、基础培养基、PBS缓冲液、含y27632的类器官培养 基，提前预冷Matrigel基质，将实验所需耗材提前紫外灭菌30分钟；

S2.分装10ml基础培养基于15ml离心管中，将未经处理的肿瘤类器官在 37℃水浴解冻以产生细胞悬浮液，将0.5ml细胞悬浮液加入到上述10ml基础培 养基中，吹打混匀；将离心管置于0℃、333g条件下离心5分钟，吸除上清， 得肿瘤类器官混合物；

S3.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，以每孔40μl细胞悬液接种入24孔 板内；基质胶凝固后，每孔加入500μl预热的含y27632(摩尔浓度为10μM) 的类器官培养基进行培养，周围各孔加入900μl预冷的PBS缓冲液，将24孔板 置于细胞培养箱内培养，每3-4天换一次液；

S4.当肿瘤类器官混合物第一次换液时，吸除培养基，然后加入500μl含有 摩尔浓度为6.25μM Nutlin3A溶液的类器官培养基进行持续培养。

实施例5

一种基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：

S1.提前预热24孔板、基础培养基、PBS缓冲液、含y27632的类器官培养 基，提前预冷Matrigel基质，将实验所需耗材提前紫外灭菌30分钟；

S2.分装10ml基础培养基于15ml离心管中，将未经处理的肿瘤类器官在 37℃水浴解冻以产生细胞悬浮液，将0.5ml细胞悬浮液加入到上述10ml基础培 养基中，吹打混匀；将离心管置于0℃、333g条件下离心5分钟，吸除上清， 得肿瘤类器官混合物；

S3.加入基质胶重悬肿瘤类器官混合物，以每孔40μl细胞悬液接种入24孔 板内；基质胶凝固后，每孔加入500μl预热的含y27632(摩尔浓度为10μM) 的类器官培养基进行培养，周围各孔加入900μl预冷的PBS缓冲液，将24孔板 置于细胞培养箱内培养，每3-4天换一次液；

S4.当肿瘤类器官混合物第一次换液时，吸除培养基，然后加入500μl含有 摩尔浓度为3.125μM Nutlin3A溶液的类器官培养基进行持续培养。

对比例1

与实施例1相比，步骤S4中不含有Nutlin3A溶液，其余参数和培养方法与 实施例1相同。

试验例一、测试野生型P53的类器官的存活情况

采用实施例1-5的基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法观察5天，每天 观察类器官的存活情况，结果见图1所示。

从图1可知，当Nutlin3A溶液的摩尔浓度分别为50μM、25μM、12.5μM、 6.25μM、3.125μM时，观察到野生型P53的类器官会发生凋亡现象，尤其当 Nutlin3A溶液的摩尔浓度为50μM时，野生型P53的类器官凋亡较其他质量浓 度多。

依据Nutlin3a的作用原理，不含P53突变的类器官在有Nutlin3a存在的情 况下应当会发生凋亡，但Nutlin3a在浓度较低的情况下可能无法杀死所有不含 P53突变的类器官，同时如若Nutlin3a浓度过高，同样有可能将含有P53突变的 类器官杀死。在实验中，本发明使用不含有P53突变的类器官进行培养，试图 测试出能将不含P53突变的类器官彻底杀死的最低浓度，在图1中，通过梯度 测试显示了50uM是最佳浓度，50uM以下的浓度会导致不含P53突变的类器官 死亡不彻底。

试验例二、筛选具有P53突变的肿瘤类器官试验

材料：具有野生型P53基因的类器官和具有突变P53基因的肿瘤类器官。

方法：采用实施例1的培养方法分别培养上述有野生型P53基因的类器官 和具有突变P53基因的肿瘤类器官，作为实验组一和实验组二。采用对比例1 的方法分别培养上述有野生型P53基因的类器官和具有突变P53基因的肿瘤类 器官，作为对照组一和对照组二，每天观察不同条件下的类器官的存活情况， 结果见图2。

结果显示：具有野生型P53基因的类器官和具有突变P53基因的肿瘤类器 官采用含有50μM Nutlin3A溶液处理5天后，发现野生型P53基因的类器官发 生凋亡，具有突变P53基因的肿瘤类器官的生长状况良好，说明本发明的培养 方法具有筛选具有P53突变的肿瘤类器官的效果。

在图2的四张图中：

左上角(图A)：无P53突变的类器官在无Nutlin3a筛选的情况下的生长情 况正常；

左下角(图B)：无P53突变的类器官在有50ug/ml Nutlin3a筛选的情况下， 全部凋亡；

右上角(图C)：有P53突变的类器官在无Nutlin3a筛选的情况下的生长情 况正常；

右下角(图D)：有P53突变的类器官在有50ug/ml Nutlin3a筛选的情况下， 部分无P53突变的类器官凋亡，保有P53突变的肿瘤类器官生长正常。

由此的实验结论：50uM Nutlin3a的培养条件能够将无P53突变的类器官全 部杀死，同时能维持有P53突变的肿瘤类器官的正常生长，以保证肿瘤类器官 癌症特性的保持。

本发明提供的基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，成本价格优势明 显，无需进行测序，在肿瘤类器官培养早期节省了检测成本，又实现了精准简 化地培养肿瘤类器官。

本发明提供的基于P53突变筛选肿瘤类器官的培养方法，具有高准确性、 高灵敏性的技术优势，筛选结果稳定，具有明显优势。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。