含有TSP1蛋白抑制剂作为活性成分的用于预防或治疗法布里病的药物组合物

摘要

本发明涉及用于预防或治疗法布里病的药物组合物，其含有TSP1蛋白抑制剂作为活性成分。特别地，在本发明的通过敲除来自法布里病患者的诱导多能干细胞中的TSP1基因而产生的血管内皮细胞中，已经证实了细胞形态的恢复、TSP1基因表达的降低、作为抗血管生成因子的TSP1蛋白和磷酸化SMAD蛋白表达水平的降低、以及作为血管生成因子的KDR蛋白和eNOS蛋白表达水平的增加，因此TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂可有效用于治疗法布里病。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于预防或治疗法布里病的药物组合物，其包含TSP1蛋白抑制剂作为活性成分。

背景技术

法布里病是一种由编码α-半乳糖苷酶的基因GLA突变引起的X基因相关的隐性遗传病。GLA基因是一种存在于人类第7外显子xq22.1位置的基因，编码一种由370个氨基酸组成的糖蛋白，该糖蛋白是由总共429个氨基酸组成的前体蛋白加工而成的(Schiffmann，R.Pharmacology&therapeutics 122，65-77(2009))。

到目前为止，已经报道了超过400个已知出现在GLA基因中的突变位点(http：//www.hgmd.cf.ac.uk)，而法布里病症状的严重程度因GLA基因中的突变位置而异。大多数突变根本没有表现出α-半乳糖苷酶的活性，但是一些错义突变表现出5-10％的残留酶活性。具有这些突变的患者没有表现出临床上重要的病理生理学(Clarke，J.T.Annals ofinternal medicine 146，425-433(2007))。

法布里病也显示了溶酶体酶的缺乏。众所周知，这种酶的缺乏是由于球形神经酰胺(Gb3，CD77)的过度积累造成的，球形神经酰胺是一种中性鞘糖脂，在伯基特淋巴瘤细胞中充当志贺毒素受体(Nudelman，E.等人，Science New York，N.Y 220，509-511(1983))。Gb3的积累出现在多种细胞中，如法布里病患者的血管细胞、心脏细胞、肾脏上皮细胞或神经元细胞。特别是，血管细胞中Gb3的积累导致系统性心血管功能障碍，如中风或心肌梗死。

在过去，据报道法布里病在117,000名男性中发生1例(Meikle，P.J.等人，Jama281，249-254(1999))。然而，近年来，发病率迅速上升，据报道，每3,100至3,700名男性儿童中就有1名出现这种情况(Spada，m.等人，American journal of human genetics 79，31-40(2006))。

重复酶替代疗法是治疗法布里病的唯一方法。特别地，通过将Fabrazyme(半乳糖苷酶β)(Eng，C.M.等人，The New England journal of medicine 345，9-16(2001))或Plagal(半乳糖苷酶α)(Schiffmann，R.等人，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 97，365-370(2000))作为α-半乳糖苷酶给药，消除了在法布里病患者的各种细胞类型中积累的Gb3。通过静脉注射给药的酶通过质膜上的甘露糖6-磷酸(M6P)受体进入细胞，并移动到溶酶体。这种治疗酶的给药在法布里病的治疗中起着关键作用。然而，重组酶如Fabrazyme或Replagal在血液中不稳定，并且有可能通过重复给药诱导过敏反应(Eng，C.M.等人，The New England journal of medicine345，9-16(2001)；Schiffmann,R.等人，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 97，365-370(2000)；Sakuraba,H.等人，Journal of human genetics 51，180-188(2006))。

在法布里病的研究和治疗剂的开发中，研究在诱导小鼠GLA基因敲除后内皮功能障碍中Gb3积累的作用是很常见的。在GLA敲除小鼠模型中，在主动脉内皮细胞的细胞质膜微囊中观察到Gb3的异常积累(Shu，L.&Shayman，J.A.The Journal of biologicalchemistry 282，20960-20967(2007))。据报道，这种Gb3的异常积累可导致GLA敲除的内皮细胞中钙通道功能的降低(Park，S.等人，Cardiovascular research 89，290-299(2010))。然而，由于GLA敲除小鼠中Gb3积累的程度与法布里病患者中的有些不同，GLA敲除小鼠模型具有局限性，因为它不能复制法布里病患者中诱导的各种并发症(Taguchi，Maruyama等人，Biochemical Journal 456，373-383(2013))。

另一方面，干细胞是处于预分化阶段的细胞，会分化为构成组织的每个细胞，并且可以从胚胎、胎儿和成人的每个组织中获得。干细胞是指具有自我增殖能力和多能性的细胞，所述自我增殖能力是指能够在未分化状态下无限增殖，所述多能性是指通过特异性分化刺激分化成各种组织细胞的潜力。干细胞通过分化(环境)的刺激分化成特定的细胞，与细胞分裂停止的已分化细胞不同，它们可以通过细胞分裂(自我更新)产生与自身相同的细胞，从而具有增殖(扩增)特征。干细胞也可以通过不同的环境或分化刺激分化为其他细胞，从而具有分化的可塑性。

包括诱导多能干细胞(iPSC)在内的人类多能干细胞(hPSCs)可以分化为多种细胞类型。诱导多能干细胞(iPSCs)可以在体外分化并用于治疗没有免疫排斥的疾病，或者作为理解和评估疾病早期机制的手段(Muotri，A.R.Epilepsy Behav 14Suppl 1：81-85(2009)；Marchetto，M.C.，B.Winner，等人，Hum Mol Genet 19(R1)：R71-76(2010))。

当来自患有各种遗传疾病的患者的iPSC直接分化成疾病相关的细胞类型时，它们表现出疾病特异性表型(Park，I.H.等人，Cell 134，877886(2008)；Tiscornia，G.等人，Nature medicine 17，1570-1576(2011))。这些疾病特异性iPSC可分化为疾病相关的细胞类型，因此可有效地用于确认疾病的特定机制或筛选治疗剂。

因此，本发明人认识到已被用作法布里病治疗剂的Fabrazyme的问题，并试图开发能够克服这些问题的患者特异性治疗剂。同时，本发明人建立了一个用于使用iPSC研究法布里病的干细胞模型，并确定TSP1(血小板反应蛋白1)蛋白是法布里病血管病变的原因。此外，本发明人通过证实来自法布里病患者的血管内皮细胞中细胞形态的恢复、TSP1(血小板反应蛋白1)基因表达的降低、作为抗血管生成因子的TSP1蛋白和磷酸化SMAD蛋白表达水平的降低、以及作为血管生成因子的KDR(激酶插入结构域受体)蛋白和eNOS(内皮一氧化氮合酶)蛋白表达水平的增加完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供TSP1蛋白抑制剂用于预防或治疗法布里病的用途。

为了实现上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗法布里病的药物组合物，其包含TSP1(血小板反应蛋白1)基因表达抑制剂或TSP1(血小板反应蛋白1)蛋白活性抑制剂作为活性成分。

本发明还提供了一种用于预防或改善法布里病的保健功能性食品，其包含TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂作为活性成分。

本发明还提供了一种用于法布里病的候选治疗剂的筛选方法，包括以下步骤：

1)用试验材料处理表达TSP1蛋白的细胞系；

2)测量TSP1蛋白在细胞系中的表达水平；以及

3)选择与未用试验材料处理的对照组相比，TSP1蛋白表达水平降低的试验材料。

本发明还提供了一种用于法布里病的候选治疗剂的筛选方法，包括以下步骤：

1)用试验材料处理TSP1蛋白；

2)测量TSP1蛋白的活性水平；以及

3)选择与未用试验材料处理的对照组相比，TSP1蛋白的活性水平降低的试验材料。

本发明还提供了一种蛋白质检测方法，用于提供诊断法布里病所需的信息，包括以下步骤：

1)测量来自受试者的样品中TSP1蛋白的表达水平；以及

2)将与对照组相比TSP1蛋白表达水平增加的受试者确定为有患法布里病风险的受试者。

本发明还提供了一种用于预防或治疗法布里病的药物组合物，其包含SB-431542作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善法布里病保健功能性食品，其包含SB-431542作为活性成分。

在本发明的通过敲除来自法布里病患者的诱导多能干细胞中的TSP1基因而产生的血管内皮细胞中，已经证实了细胞形态的恢复、TSP1基因表达的降低、作为抗血管生成因子的TSP1蛋白和磷酸化SMAD蛋白表达水平的降低以及作为血管生成因子的KDR蛋白和eNOS蛋白表达水平的增加，因此TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂可有效用于治疗法布里病。

附图说明

图1是显示干性标记物OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、Tra-1-81和Tra-1-60在诱导多能干细胞(FB-iPSCs)中的表达的图，所述诱导多能干细胞由4名患有法布里病的患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的细胞制备。

图2是显示从4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的细胞制备的FB-iPSC的染色体组型的图。

图3是显示从4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的细胞制备的FB-iPSC中的α半乳糖苷酶(GLA)活性的图。

图4是显示从4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的细胞制备的FB-iPSC中LC3蛋白的表达水平的图。

图5是显示由来自4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来的血管内皮细胞中LC3、Beclin 1和泛素蛋白的表达水平的图。

图6是显示由FB-iPSC分化成血管内皮细胞的方法的示意图。

图7是显示在血管内皮细胞中同时表达CD34和CD31的细胞的比例的图，所述血管内皮细胞由来自4名患有法布里病的患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来。

图8是显示KDR、CD31和VE-钙粘蛋白在血管内皮细胞中表达的分布以及CD31和CD105蛋白表达的FACS结果的图，所述血管内皮细胞由来自4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来。

图9是证实血管内皮细胞形态的图，所述血管内皮细胞由来自患有法布里病(Fab#1)患者的FB-iPSC分化而来。

图10是证实血管内皮细胞的管形成的图，所述血管内皮细胞由来自4名患有法布里病的患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme)。

图11是显示血管内皮细胞中GLA活性的图，所述血管内皮细胞由来自4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来。

图12是证实在血管内皮细胞中KDR蛋白表达的分布的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC分化而来。

图13是显示由来自4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来的血管内皮细胞中TSP1、KDR和eNOS蛋白的表达水平的图。

图14是显示血管内皮细胞中SMAD2蛋白的磷酸化水平的图，所述血管内皮细胞由来自4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSCs分化而来(agal：Fabrazyme)。

图15是显示在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，通过激活素A的处理，TSP1蛋白和血管生成相关蛋白的表达水平的变化的图(ACTA：激活素A)。

图16是证实在血管内皮细胞中TSP1蛋白表达的分布的图，所述血管内皮细胞由来自4名法布里病患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来。

图17是证实在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，通过LysoGb3蛋白处理的细胞形态变化的图。

图18a是显示在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，经LysoGb3蛋白处理1天后，TSP1、KDR和eNOS基因表达水平的变化的图。

图18b是显示在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，经LysoGb3蛋白处理3天后，TSP1、KDR和eNOS基因表达水平的变化的图。

图18c是显示在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，经LysoGb3蛋白处理5天后，TSP1、KDR和eNOS基因表达水平的变化的图。

图19显示了在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，通过LysoGb3蛋白处理的TSP1、KDR和eNOS蛋白表达水平的变化以及AKT蛋白磷酸化水平的变化的图。

图20是证实在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中，通过LysoGb3蛋白处理的TSP1蛋白表达分布的变化的图。

图21a是证实在由正常iPSC分化而来的血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的细胞形态变化的图。(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图21b是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的细胞形态变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC分化而来。(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)

图21c是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的细胞形态变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#2)的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图21d是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的细胞形态变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#3)的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图21e是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的细胞形态变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#4)的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图22是显示在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的TSP1、KDR和eNOS蛋白的表达水平的变化的图，所述血管内皮细胞由4名患有法布里病的患者(Fab#1、Fab#2、Fab#3和Fab#4)的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme、SB：SB-431542)。

图23a是证实在由正常iPSC细胞分化的血管内皮细胞中通过SB-431542的处理而引起的管形成变化的图(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图23b是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的管形成变化的图，所述血管内皮细胞由来自患有法布里病(Fab#1)的患者的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图23c是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的管形成变化的图，所述血管内皮细胞由来自患有法布里病(Fab#2)的患者的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图23d是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的管形成变化的图，所述血管内皮细胞由来自患有法布里病(Fab#3)的患者的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图23e是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542处理而引起的管形成变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病(Fab#4)的患者的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazyme，SB：SB-431542)。

图24a是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542或氯沙坦的处理而引起的细胞形态变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病的患者(Fab#1)的FB-iPSC分化而来。(FZ：Fabrazym，SB：SB-431542，Los：氯沙坦)。

图24b是证实在血管内皮细胞中通过SB-431542或氯沙坦的处理而引起的细胞形态变化的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病的患者(Fab#2)的FB-iPSC分化而来(FZ：Fabrazym，SB：SB-431542，Los：氯沙坦)。

图25是显示突变的GLA基因在来自患有法布里病(Fab#1)的患者的FB-iPSC中的位置的示意图。

图26是显示使用CRISPR/CAS9系统从来自法布里病的患者(Fab#1)的FB-iPSC制备同种型对照细胞系的方法的示意图。

图27是证实在从来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC制备的同种型对照细胞系中GLA基因的校正的图。

图28是显示在从来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC和由其分化而来的血管内皮细胞制备的同种型对照细胞系中GLA活性的图。

图29是显示在从同种型对照细胞系分化而来的血管内皮细胞中TSP1蛋白和血管生成相关蛋白的表达水平，以及SMAD蛋白的磷酸化水平的图，所述同种型对照细胞系由来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC制备。(agal：Fabrazyme)。

图30是证实在从同种型对照细胞系分化的而来血管内皮细胞中TSP1和VE-钙粘蛋白表达分布的图，所述同种型对照细胞系由来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC制备(agal：Fabrazyme)。

图31是证实从同种型对照细胞系分化而来的血管内皮细胞的管形成的图，所述同种型对照细胞系由来自法布里病(Fab#1)(agal：Fabrazyme)患者的FB-iPSC制备。

图32是显示使用CRISPR/CAS9系统从来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC制备TSP1基因敲除细胞系的方法的示意图。

图33是证实在通过测序方法从来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC制备的TSP1基因敲除细胞系中的TSP1基因的敲除的图。

图34是证实血管内皮细胞形态的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC分化而来，其中TSP1基因被敲除(agal：Fabrazyme)。

图35是显示在血管内皮细胞中TSP1基因的表达水平的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病(Fab#1)患者的FB-iPSC分化而来，其中TSP1基因被敲除。

图36是显示血管内皮细胞中TSP1、KDR和eNOS蛋白的表达水平和SMAD蛋白的磷酸化水平的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病患者(Fab#1)的FB-iPSC分化而来，其中TSP1基因被敲除(agal：Fabrazyme)。

图37是证实血管内皮细胞的管形成的图，所述血管内皮细胞由来自法布里病(Fab#1)患者的FB-iPSC分化而来，其中TSP1基因被敲除(agal：Fabrazyme)。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

本发明提供了一种药物组合物，其包含TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂作为用于预防或治疗法布里病的活性成分。

TSP1基因可以包括由本领域已知的任何序列组成的所有多核苷酸，并且可以包括不降低活性的具有一个或多个取代、插入、缺失及其组合的变体。该变体可以与本发明的TSP1基因序列具有80％、90％、95％、98％或更高的同源性。在本发明的一个实施方案中，TSP1基因可以是由SEQ ID.NO：1表示的核苷酸序列组成的多核苷酸。TSP1基因表达抑制剂可以包括本领域已知的任何材料，只要其抑制编码TSP1蛋白的基因的mRNA，并且可以通过各种方法制备，例如化学合成或体外转录合成。表达抑制剂可以包括选自由与构成TSP1基因的多核苷酸互补结合的反义核苷酸、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)和核酶组成的组中的任何一种或多种。

沃森-克里克碱基对模型中定义的反义核苷酸是指通过与DNA、未成熟mRNA或成熟mRNA的互补核苷酸序列结合(杂交)来干扰遗传信息从DNA到蛋白质的流动的序列。此外，由于反义核苷酸是单体单元的长链，因此可以容易地合成靶RNA序列的反义核苷酸。

所述siRNA指的是一种短双链RNA，其能够通过切割特定的mRNA来诱导RNA干扰。此外，siRNA不局限于双链RNA完全配对的区域，而可以包括由于错配(对应的核苷酸不互补)或凸出(没有对应于一条链的核苷酸)而导致链不配对的区域。siRNA末端结构可以具有平端或突出端，只要目标基因的表达可以被RNA干扰效应抑制，并且粘附末端结构可以是3’末端突出结构和5’末端突出结构。

所述shRNA是指产生强发夹弯的RNA序列，其可用于通过RNA干扰来沉默基因表达。此外，shRNA可以使用用于细胞导入的载体递送到细胞中，并且这种载体总是递送到子细胞中，使得基因沉默可以被遗传。shRNA发夹结构通过细胞内机制降解为siRNA，并结合到RNA诱导的沉默复合物，该复合物结合到对应于siRNA的mRNA以降解它。

所述核酶是指能够催化特异性RNA切割的酶RNA分子。核酶的分子序列和互补靶RNA的特异性杂交可以诱导核酸内切裂解。核酶可以包括负责切割一个或多个与靶RNA互补的序列或功能等价序列的已知序列。此外，核酶可以是锤头状核酶或Cech型核酶，即核糖核酸内切酶RNA，并且可以由修饰的寡核苷酸形成以提高安全性和靶向性。同时，核酶可以分布在体内表达目的基因的细胞中。可以使用在强组成型聚合酶III或聚合酶II启动子控制下编码核酶的DNA构建体，使得转染的细胞可以破坏内源性靶信使并产生足够量的核酶来抑制翻译。由于核酶具有催化活性，与其他反义分子不同，它可能必须在细胞中保持低浓度。

所述TSP1蛋白可以包括由本领域已知的任何序列组成的多肽。该多肽可以是在不影响蛋白功能的范围内，通过氨基酸残基的缺失、插入、取代或其组合而具有不同序列的氨基酸变体。不改变分子整体活性的蛋白质或肽中的氨基酸交换在本领域是已知的。在某些情况下，它可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化等来修饰。该变体可以与本发明的TSP1蛋白具有至少80％、90％或95％的同源性。在本发明的一个实施方案中，TSP1蛋白可以是由SEQ.ID.NO：2表示的氨基酸序列组成的多肽。

TSP1蛋白活性抑制剂可以包括由选自与构成TSP1蛋白的多肽互补结合的化合物、肽、肽模拟物、基质类似物、适配体以及抗体组成的组中的任何一种或多种。

肽和肽模拟物可以通过抑制TSP1蛋白与其他蛋白的结合来抑制TSP1蛋白的活性。肽模拟物可以是肽或非肽，并且可以由通过非肽键如psi键结合的氨基酸组成。不可水解的肽模拟物可以使用β-转角二肽核心(β-turn dipeptide core)、酮亚甲基伪肽(keto-methylene pseudopeptides)、氮杂卓(azepine)、苯二氮、β-氨基醇或取代的γ-内酰胺环作为主要残基来制备。

所述适配体是指单链核酸(DNA、RNA或修饰的核酸)，其自身具有稳定的三级结构，并且能够以高亲和力和特异性与靶分子结合。因为适配体可以结合有机物、肽、膜蛋白等，并阻断其功能，它可以被视为一种取代单一抗体的化学抗体。此外，适配体可以通过使用称为SELEX(指数富集的配体系统进化技术)的寡核苷酸文库分离以高亲和力和选择性结合特定化学分子或生物分子的寡聚体来获得。

所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。如果已知蛋白质的序列，可以使用本领域公知的技术容易地制备针对特定蛋白质的抗体。特别地，可以使用杂交瘤方法或噬菌体抗体库技术制备抗体。通常，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞可以通过将从用抗原蛋白注射的免疫学上合适的宿主动物(如小鼠)中分离的免疫细胞与癌细胞系融合来制备。这两组细胞的融合可以使用聚乙二醇等进行，并且产生抗体的细胞可以通过标准培养方法增殖。在通过使用有限稀释法亚克隆获得同质细胞群后，能够产生抗原特异性抗体的杂交瘤细胞可以通过体外或体内大量培养来制备。通过上述方法制备的抗体可以使用诸如凝胶电泳、透析、盐沉淀、离子交换层析和亲和层析等方法进行分离和纯化。

多克隆抗体可以通过将生物标记物蛋白或其片段作为免疫原注射到外部宿主中来制备。外部宿主可以是哺乳动物，如小鼠、大鼠、绵羊和兔子。当免疫原通过肌肉注射、腹腔注射或皮下注射时，可以与佐剂一起给药以增加抗原性。此后，定期从外部宿主收集血液，以获得显示出对抗原提高的滴度和特异性的血清，并且可以从中分离和纯化抗体。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人使用法布里病患者的细胞制备了诱导多能干细胞(FB-iPSC)，并证实了干细胞的特征(图1和2)、GLA活性的降低(图3)和溶酶体相关蛋白表达水平的增加(图4和5)。本发明人还制备了从FB-iPSC分化的血管内皮细胞(图6和7)，并证实了血管内皮细胞的特征(图8～10)、GLA活性的降低(图11)、KDR蛋白和eNOS蛋白表达水平的降低(图12和13)和TSP1蛋白表达水平的增加(图14～16)。

本发明人还证实了在从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中通过Gb3蛋白(图17～20)和SB-431542(图21～23)诱导血管病变，SB-431542是一种TGF-β抑制剂，对血管病变的治疗具有效果。然而，另一种TGF-β抑制剂氯沙坦的治疗效果无法得到证实(图24)。

此外，本发明人制备了FB-iPSC的同种型对照细胞系(图25～27)和由其分化的血管内皮细胞，并证实了GLA活性(图28)和血管病变(图29～31)的恢复。本发明人还制备了其中TSP1基因被敲除的FB-iPSC细胞系(图32和33)，并证实了血管病变的恢复(图34～37)。

因此，本发明的TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂可有效用于预防或治疗法布里病。

该药物组合物可以含有本发明的TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂作为活性成分，其浓度为组合物总重量的10～95重量％。此外，除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含一种或多种与活性成分具有相同或相似功能的有效成分。

本发明的药物组合物可以包含载体、稀释剂、赋形剂或至少两种通常用于生物制剂的材料的组合。药学上可接受的载体可以是能够在活体中不受限制地递送本发明的组合物的任何载体，其由默克索引(Merck Index，第13版，默克公司(Merck&Co.Inc.))中描述的化合物举例说明，例如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及包含一种或多种这些组分的混合物。如有必要，可额外添加抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等常规添加剂。

配制组合物时，其使用通常使用的稀释剂或赋形剂如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂来制备。

本发明的组合物可以配制成口服制剂或肠胃外制剂。用于口服给药的固体制剂是片剂、丸剂、散剂、颗粒剂和胶囊剂。这些固体制剂通过将一种或多种组合物与一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶等混合来制备。此外，可以向其中加入润滑剂，如硬脂酸镁和滑石。用于口服给药的液体制剂是混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂，并且上述制剂可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。

用于肠胃外给药的制剂是无菌水溶液、水不溶性赋形剂、混悬剂和乳剂。水不溶性赋形剂和混悬剂可包含丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯(ethylolate)等。

本发明的组合物可以通过口服或肠胃外给药，肠胃外给药可选自由皮肤外用或腹腔注射、直肠内注射、皮下注射、静脉注射、肌内注射和胸腔内注射组成的组。

该组合物可以按照药学有效量给药。有效量可以根据疾病类型、严重性、药物活性、患者对药物的敏感性、给药时间、给药途径、治疗持续时间、同时使用的药物等来确定。本发明的组合物可以单独给药或与其他治疗剂联合给药。在联合给药中，给药可以是顺序的或同时的。然而，为了达到期望的效果，包括在本发明药物组合物中的活性成分的量可以是0.001～10，000mg/㎏，特别是0.1～5g/kg。给药频率可以是每日一次或每日几次。

本发明还提供了一种保健功能性食品，其包含TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂作为用于预防或改善法布里病的活性成分。

TSP1基因和TSP1基因表达抑制剂可以具有如上所述的特征。例如，TSP1基因可以是由SEQ.ID.NO：1表示的核苷酸序列组成的多核苷酸。此外，表达抑制剂可以包括选自由与构成TSP1基因的多核苷酸互补结合的反义核苷酸、siRNA、shRNA和核酶组成的组中的任何一种或多种。

TSP1蛋白和TSP1蛋白活性抑制剂可以具有如上所述的特征。例如，TSP1蛋白可以是由SEQ.ID.NO：2表示的氨基酸序列组成的多肽。此外，活性抑制剂可以包括选自由与构成TSP1蛋白的多肽互补结合的化合物、肽、肽模拟物、基质类似物、适配体和抗体组成的组中的任何一种或多种。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人使用法布里病患者的细胞制备了诱导多能干细胞(FB-iPSC)，并证实了干细胞的特征(图1和2)、α-半乳糖苷酶(GLA)活性的降低(图3)和溶酶体相关蛋白表达水平的增加(图4和5)。本发明人还制备了从FB-iPSC分化的血管内皮细胞(图6和7)，并证实了血管内皮细胞的特征(图8～10)、GLA活性的降低(图11)、KDR蛋白和eNOS蛋白表达水平的降低(图12和13)和TSP1蛋白表达水平的增加(图14～16)。

本发明人还证实了在从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中通过Gb3蛋白(图17～20)和SB-431542(图21～23)诱导血管病变，SB-431542是一种TGF-β抑制剂，对血管病变的治疗具有效果。然而，另一种TGF-β抑制剂氯沙坦的治疗效果无法得到证实(图24)。

此外，本发明人制备了FB-iPSC的同种型对照细胞系(图25～27)和由其分化的血管内皮细胞，并证实了GLA活性(图28)和血管病变(图29～31)的恢复。本发明人还制备了其中TSP1基因被敲除的FB-iPSC细胞系(图32和33)，并证实了血管病变的恢复(图34～37)。

因此，本发明的TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂可有效用于预防或改善法布里病。

本发明的TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂可用作食品添加剂。在这种情况下，本发明的TSP1基因表达抑制剂或TSP1蛋白活性抑制剂可以根据常规方法添加，或者与其他食物成分混合添加。活性成分的量可以根据使用目的来调节。通常，本发明的活性成分优选以食品总重量的0.01～90重量份添加到保健功能性食品中。

此外，对保健功能性食品的形式和类型没有特别的限制。可以添加上述物质的保健功能性食品的形式可以是片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体和丸剂。

本发明的保健功能性食品可以另外包括各种香料或天然碳水化合物等，像其他常规保健食品一样。上述天然碳水化合物可以是单糖如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及葡萄糖醇如木糖醇(xilytole)、山梨醇和赤藓糖醇中的一种。此外，天然甜味剂如奇异果甜蛋白和甜叶菊提取物，以及合成甜味剂如糖精和阿斯巴甜可作为甜味剂。

除了上述成分，本发明的保健功能性食品可包括多种营养素、维生素、矿物质、香料、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精等。所有提到的成分可以单独或一起添加。这些成分的比例可以在0.01～0.1重量份/100重量份本发明组合物的范围内选择。

本发明还提供了使用TSP1蛋白筛选法布里病候选治疗剂的方法。

TSP1蛋白可以具有如上所述的特征。例如，TSP1蛋白可以是由SEQ.ID.NO：2表示的氨基酸序列组成的多肽。

具体而言，该方法可由以下步骤组成：

1)用试验材料处理表达TSP1蛋白的细胞系；

2)测量TSP1蛋白在细胞系中的表达水平；以及

3)选择与未用试验材料处理的对照相比，TSP1蛋白表达水平降低的试验材料。

步骤1)的试验材料可以是选自由肽、蛋白质、非肽化合物、活性化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆组成的组中的一种或多种物质。

步骤2)的蛋白质表达水平可以通过选自由酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、夹心酶免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、荧光免疫测定和流式细胞术(FACS)组成的组中的任何一种或多种方法来测量。

另一种方法可以由以下步骤组成：

1)用TSP1蛋白处理试验材料；

2)测量TSP1蛋白的活性水平；以及

3)选择与未用试验材料处理的对照相比，TSP1蛋白的活性水平降低的试验材料。

步骤1)的试验材料可以是选自由肽、蛋白质、非肽化合物、活性化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物和血浆组成的组中的一种或多种物质。

步骤2)的蛋白质活性水平可以通过选自由酶免疫分析、荧光免疫分析、SDS-PAGE、质谱和蛋白质芯片组成的组中的任何一种或多种方法来测量。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人证实了在从来自法布里病患者的FB-iPSC分化的血管内皮细胞中TSP1蛋白表达水平的增加(图14～16)，以及从其中TSP1基因被敲除的FB-iPSC细胞系分化的血管内皮细胞中血管病变的恢复(图34～37)。因此，测量TSP1蛋白的表达水平或活性的方法可以有效地用于筛选法布里病的候选治疗剂。

本发明还提供了一种蛋白质检测方法，用于提供使用TSP1蛋白质诊断法布里病所需的信息。

TSP1蛋白可以具有如上所述的特征。例如，TSP1蛋白可以是由SEQ.ID.NO：2表示的氨基酸序列组成的多肽。

具体而言，该方法可由以下步骤组成：

1)测量来自受试者的样品中TSP1蛋白的表达水平；以及

2)将与对照组相比TSP1蛋白表达水平增加的受试者确定为有患法布里病风险的受试者。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人证实了在从来自法布里病患者的FB-iPSC分化的血管内皮细胞中TSP1蛋白表达水平的增加(图14～16)，以及从其中TSP1基因被敲除的FB-iPSC细胞系分化的血管内皮细胞中血管病变的恢复(图34～37)。因此，测量TSP1蛋白表达水平的方法可以有效地用于提供诊断法布里病所必需的信息。

本发明还提供了包含TGF-β信号通路抑制剂SB-431542作为预防或治疗法布里病的活性成分的药物组合物。

“TGF(转化生长因子)β信号通路抑制剂”是指抑制由TGFβ介导的信号的物质。TGFβ是一种调节各种生理过程如细胞增殖、分化、凋亡、迁移、细胞外基质(ECM)产生、血管生成和体内发育的蛋白质。

TGFβ信号通路抑制剂可以是SB-431542，但是也可以无限制地使用任何能够抑制TGF信号的物质。在本发明中，SB-431542被用作TGFβ信号通路抑制剂，并且它可以由下面的式1表示。

式1

所述SB-431542可降低法布里病患者血管内皮细胞中TSP1蛋白的表达，并可增加KDR(激酶插入结构域受体)和eNOS(内皮一氧化氮合酶)蛋白的表达。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人证实了在从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中通过Gb3蛋白(图17～20)和SB-431542(图21～23)诱导了血管病变，SB-431542是一种TGF-β抑制剂，对血管病变的治疗具有效果。因此，本发明的SB-431542化合物可有效用于预防或治疗法布里病。

该药物组合物可以具有如上所述的特征。

此外，本发明提供了一种保健功能性食品，其包含TGF-β信号通路抑制剂SB-431542作为用于预防或改善法布里病的活性成分。

TGF-β信号通路抑制剂或SB-431542可具有如上所述特征。例如，SB-431542可以具有下式1的结构，可以降低法布里病患者血管内皮细胞中TSP1蛋白的表达，并且可以增加KDR和eNOS蛋白的表达。

式1

在本发明的一个优选实施方案中，本发明人证实了在从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中通过Gb3蛋白(图17～20)和SB-431542(图21～23)诱导了血管病变(图17～20)，SB-431542是一种TGF-β抑制剂，对血管病变的治疗具有效果。因此，本发明的SB-431542化合物可有效用于预防或改善法布里病。

该保健功能性食品可以具有如上所述的特征。

在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。

然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的内容不限于此。

为了研究法布里病，从法布里病患者中分离成纤维细胞，并通过以下方式诱导iPSC。

特别是，经峨山医疗中心(Asan Medical Center)(韩国首尔)的法布里病患者同意，对患者进行局部麻醉，然后通过使用钻取活组织检查进行皮肤组织活检来获得皮肤组织。4例法布里病患者的临床资料见下表1。所有实验都是在医院机构审查委员会的审查下进行的。

表1

从获得的皮肤组织中分离成纤维细胞，并在添加了10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素和1％非必需氨基酸的DMEM中培养。然后，使用本领域已知的异位表达技术，通过转导表达多能标记物OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的逆转录病毒，从成纤维细胞诱导FB-iPSC的发育(Takahashi，K等人，Cell 131(5)：861-872，2007)。将细胞培养3天，使用小鼠胎儿成纤维细胞作为培养饲养细胞进行传代培养，并在补充有20％KOSR(敲除血清替代物)、50单位/毫升青霉素-链霉素、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中长时间培养。此后，分离具有与干细胞相似的形态特征的集落，以构建FB-iPSC细胞系。

为了证实未分化的FB-iPSC是否表现出多能性，使用免疫染色法证实FB-iPSC中干性标记物的表达。

特别地，使用甲醛溶液固定实施例1中制备的FB-iPSC，并对其进行0.1％tritonX-100处理以使细胞膜可渗透。此后，用PBST(含吐温20的PBS)洗涤处理过的细胞三次，向其中加入4％的正常驴血清，然后在室温下封闭1小时。然后，作为第一抗体，抗OCT4抗体(1：300，R&D Systems，美国)、抗SOX2抗体(BD Transduction Laboratories，美国)、抗NANOG抗体(1：300，Cell signaling technology，美国)、抗SSEA-4抗体(1：300，R&D Systems公司，美国)、抗TRA-1-81抗体(1：300，Millipore公司，美国)或抗TRA-1-60抗体(1：300，Millipore公司，美国)对其进行处理并在4℃下反应，接着用PBST洗涤三次。洗涤后，用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594缀合的第二抗体抗体(Invitrogen，美国)处理，并在室温下反应1小时，然后用PBST洗涤6次。此时，在最后一次洗涤时，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行荧光染色。然后，通过在荧光显微镜(奥林巴斯，日本)或蔡司LSM510共聚焦显微镜(卡尔〃蔡司，德国)下观察染色的FB-iPSC来确认OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-81和TRA-1-60蛋白的表达。

结果，如图1所示，干细胞标记物OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、Tra-1-81和Tra-1-60蛋白在FB-iPSC中以正常细胞水平表达。从上述结果，证实了FB-iPSC具有与胚胎干细胞相同的多能性。

向GenDix(韩国)请求实施例1中制备的FB-iPSC的染色体组型，并且证实实施例1中制备的FB-iPSC具有正常的染色体组型。

如图2所示，FB-iPSC的正常染色体组型为46，XY。

在法布里病患者中，GLA活性应该出现接近于零，因此通过以下方法证实了FB-iPSC中的GLA活性。

特别地，将200μl含有100mM柠檬酸钠和200mM磷酸氢二钠的GLA分析缓冲液(pH4.6)加入到实施例1中制备的FB-iPSC的细胞沉淀中，随后用1秒破碎和1秒静止的程序超声处理总共10秒。此后，通过在4℃下以1300rpm离心30分钟获得细胞裂解物的上清液。然后，通过将30μl200mM N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAC)、6μl 50mM 4-MU-αD-吡喃半乳糖苷(4MUaGal)、14μl GLA分析缓冲液和10μl获得的细胞裂解物上清液混合来制备用于GLA分析的混合物。将制备的混合物加入96孔板，然后在37℃孵育1小时。培养完成后，通过向每个孔中加入含有200mM甘氨酸(pH 10.32)的GLA终止缓冲液来终止反应，并使用Victor平板读取器(Perkin Elmer，美国)在355和460nm的波长下确认荧光。

结果，如图3所示，与正常对照组不同，在FB-iPSC中没有显示GLA活性。

由于法布里病被归类为溶酶体贮积病，因此通过以下方法证实了每个FB-iPSC和法布里病患者样品中溶酶体相关蛋白的表达水平。

通过蛋白质印迹证实了溶酶体相关蛋白LC3在FB-iPSC中的表达水平。

特别地，在实施例1中制备的FB-iPSC用法布里病的治疗剂Fabrazyme和各种组合的饥饿培养基处理。将Pro-Prep溶液(Intron Biotechnology，韩国)加入每个样品中，在4℃下反应，然后以1300rpm离心10分钟，得到上清液。获得的上清液在丙烯酰胺凝胶上电泳并转移到硝酸纤维素膜上，然后用4％脱脂牛奶封闭。然后，抗LC3抗体(1：1000，Santacruz，美国)对其进行处理，并在4℃下反应24小时，然后用含有吐温-20的TBS洗涤三次。蛋白质表达水平由常规蛋白质印迹法证实。使用GAPDH作为对照来校正每种蛋白质的表达水平。

结果，如图4所示，尽管采用Fabrazyme处理FB-iPSC中LC3蛋白的表达水平高于正常细胞。

通过蛋白质印迹证实了在法布里病患者样品中与溶酶体信号系统相关的LC3、Beclin 1和泛素蛋白的表达水平。

特别地，从获得自实施例1的法布里病患者的皮肤组织中分离出血管内皮细胞，用Fabrazyme处理。然后，通过以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹来确认LC3、Beclin 1和泛素蛋白的表达水平。此时，使用抗LC3抗体(1：1000，Santacruz，美国)、抗Beclin 1抗体(1：500，Santacruz，美国)和抗泛素抗体(1：1000，Santacruz，美国)作为抗体。

结果，如图5所示，尽管采用Fabrazyme处理，LC3、Beclin 1和泛素蛋白在法布里病患者血管内皮细胞中的表达水平高于正常细胞。

从上述结果，证实了溶酶体在患有法布里病的患者中不能正常发挥功能，并且溶酶体贮积病的特征即使在治疗剂Fabrazyme处理后也不能恢复。

为了证实法布里病患者的血管病变，根据以下方法从FB-iPSC分化血管内皮细胞(图6)。

特别地，在实施例1中制备的FB-iPSC在无饲养层状态下培养3天。此后，用含有1％B27的RPMI-1640培养基交换培养基，向其中加入50ng/ml的激活素A和20ng/ml的BPM4作为生长因子，然后培养细胞2天以分化成中胚层细胞。用含有0.5％B27的RPMI-1640培养基交换培养基，向其中加入50ng/ml的血管内皮生长因子(VEGFA)和50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为生长因子，然后培养细胞2天以分化为血管祖细胞。通过使用CD34磁珠进行磁激活细胞分选(MACS)，从诱导的血管祖细胞中分离出能够分化为血管内皮细胞的CD34阳性细胞。分离的CD34阳性细胞在含有100ng/ml VEGF-A和100ng/ml bFGF作为生长因子的EGM-2培养基(Lonza，美国)中进一步培养2天，以分化为血管内皮细胞。

结果，如图7所示，从FB-iPSC诱导了血管内皮细胞的分化，并且产生了超过15％的表达CD34和CD31的细胞。

为了证实来自法布里病患者的血管内皮细胞是否正常分化，使用免疫染色来证实血管内皮细胞标记蛋白KDR(激酶插入结构域受体)、CD31和VE-钙粘蛋白(血管内皮钙粘蛋白)的表达。使用实施例2中制备的血管内皮细胞，以与实验例<1-1>中所述相同的方式进行实验。此时，抗KDR抗体(1：300，Cell Signaling Technologies，美国)、抗CD31抗体(1：300，Cell Signaling Technologies，美国)和抗VE-钙粘蛋白抗体(1：300，Abcam，英国)用作第一抗体。

同时，表达CD31和CD105的细胞在血管内皮细胞中的分布由FACS(荧光激活细胞分选仪)证实。特别地，用细胞消化液处理实施例2中制备的血管内皮细胞，并离心以获得细胞沉淀。将细胞沉淀重悬在含有2％胎牛血清的PBS(FACS缓冲液)中，并用孔径为40μm的过滤器过滤细胞。过滤的细胞用抗CD31抗体(1：200，Biologend，美国)和抗CD105抗体(1：200，Biologend，美国)作为FACS特异性抗体处理，并在4℃反应3分钟。反应完成后，细胞用FACS缓冲液洗涤5次，用FACS Caliber流式细胞仪(BD biosciences)证实细胞分布。

结果，如图8所示，血管内皮细胞标记物KDR、CD31和VE-钙粘蛋白在来自法布里病患者的血管内皮细胞中以在正常细胞中的水平表达，并且CD31和CD105蛋白的表达均匀分布。从上述结果，证实了血管内皮细胞正常地从FB-iPSC分化。

通过以下方法证实了来自法布里病患者的血管内皮细胞的形态学变化和血管生成。

首先，在实施例2中制备的血管内皮细胞培养13天的同时，用相差显微镜确认第9、11和13天的细胞形态。

另一方面，将70μl的基质胶(corning)储备溶液放入96孔板中并在37℃下硬化，然后向其中加入实施例2中制备的1x10

结果，如图9和10所示，与正常对照组不同，来自法布里病患者的血管内皮细胞随着培养的进行而扩散得更广，并变成异常的形状，并且在基质胶上没有观察到管的形成。根据上述结果，证实了来自法布里病患者的血管内皮细胞表现出血管病变。

通过以下方法证实了来自法布里病患者的血管内皮细胞中的GLA活性。使用实施例2中制备的血管内皮细胞，以与实验例2中所述相同的方式进行实验。

结果，如图11所示，与正常对照组不同，来自法布里病患者的血管内皮细胞没有显示任何GLA活性。

由于法布里病引起血管并发症，通过以下方法确认KDR蛋白的表达，以确认法布里病患者的血管病变。

免疫染色证实了KDR蛋白在由FB-iPSC分化的血管内皮细胞中的表达位点。使用实施例2中制备的血管内皮细胞，以与实验例<1-1>中所述相同的方式进行实验。此时，抗KDR抗体(1：300，Cell Signaling Technologies，美国)被用作第一抗体。

结果，如图12所示，证实了来自法布里病患者的血管内皮细胞中KDR蛋白的表达位点不同于正常对照组。

通过蛋白质印迹证实了在从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中与KDR蛋白信号系统相关的KDR、eNOS(内皮一氧化氮合酶)和TSP1(血小板反应蛋白1)的表达水平。

特别地，实施例2中制备的血管内皮细胞用Fabrazyme处理，并以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹。此时，使用抗KDR抗体(1：1000，Cell SignalingTechnologies，美国)、抗eNOS抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)和抗TSP1抗体(1：1000，Santacruz，美国)作为抗体。

结果，如图13所示，与正常对照组相比，来自法布里病患者的血管内皮细胞中KDR和eNOS蛋白的表达水平降低，并且与正常对照组相比，尽管采用Fabrazyme，TSP1蛋白的表达水平升高。从上述结果，证实了TSP1蛋白的表达水平因法布里病而增加，且不受Fabrazyme的抑制。

为了确定法布里病的血管相关并发症是否是由TSP1蛋白的过度表达引起的，TSP1蛋白的信号系统通过以下方法得到证实。

为了证实TGF-β蛋白的激活，使用蛋白质印迹法证实SMAD2蛋白的磷酸化，TGF-β蛋白是一种从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中TSP1蛋白的上游信号系统。

特别地，实施例2中制备的血管内皮细胞用Fabrazyme处理，并以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹。此时，使用抗SMAD2抗体(1：1000，Cell SignalingTechnologies，美国)和抗磷酸化-SMAD2抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)作为抗体。

结果，如图14所示，与正常对照组相比，尽管采用Fabrazyme处理，来自法布里病患者的血管内皮细胞中SMAD2蛋白的磷酸化水平增加。从上述结果，证实了TGF-β蛋白在从FB-iPSC分化的血管内皮细胞中被激活。

为了证实TGF-β的激活是否增加了TSP1蛋白的表达水平，使用蛋白质印迹法证实了包括TSP-1蛋白在内的相关蛋白的表达水平。

特别地，用激活素A处理从正常iPSC分化的血管内皮细胞以激活TGF-β，并以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹。此时，抗TSP1抗体(1：1000，Santacruz)，抗磷酸化-SMAD2抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)，抗SMAD2抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)，抗KDR抗体(1：1000，Cell SignalingTechnologies，美国)，抗eNOS抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)，抗bFGF抗体(1：1000，Bios，美国)，抗ANG2抗体(1：1000，Bios，美国)，以及抗vEGF抗体(1：1000，Santacruz，美国)用作抗体。

结果，如图15所示，激活素A增加了从正常iPSC分化的血管内皮细胞中TSP1蛋白的表达。从上述结果，证实了TSP1蛋白的表达水平通过激活TGF-β蛋白而增加。

免疫染色证实了TSP1蛋白在FB-iPSC分化的血管内皮细胞中的表达位置。使用实施例2中制备的血管内皮细胞，以与实验例<1-1>中所述相同的方式进行实验。抗TSP1抗体(1：200，Santacruz，美国)用作第一抗体。

结果，如图16所示，与正常对照组相比，来自法布里病患者的血管内皮细胞中TSP1蛋白的增加分布在整个细胞中。

法布里病患者细胞和器官中积累的Gb3蛋白是否诱导血管病变通过以下方法得到证实。

由Gb3蛋白引起的血管内皮细胞形态的变化通过以下方法证实。

特别地，用LysoGb3蛋白(MATREYA LLC，USA)处理从正常iPSC分化的血管内皮细胞9天，然后确认细胞的形态。

结果，如图17所示，通过Gb3蛋白处理，正常血管内皮细胞的形态改变为加宽形式，类似于从FB-iPSC分化的血管内皮细胞。

使用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)证实了由Gb3蛋白引起的血管病变相关基因表达水平的变化。

特别地，从正常的iPSC分化的血管内皮细胞用LysoGb3蛋白处理1、3或5天，并且使用easy-BLUE(Intron)从细胞中提取RNA。然后，以常规方式进行RT-PCR反应，以确认与血管病变相关的KDR、eNOS和TSP1(血小板反应蛋白1)基因的RNA表达水平。

结果，如图18a至18c所示，在LysoGb3蛋白处理后1天，KDR、eNOS和TSP1基因的RNA表达水平增加。RNA表达水平逐渐降低，并且在3天和5天后，KDR和eNOS基因的RNA表达水平比正常对照细胞中的更低，TSP1基因的RNA表达水平与正常对照细胞中的相似。

使用蛋白质印迹证实了由Gb3蛋白引起的血管病变相关蛋白表达水平的变化。特别地，用LysoGb3蛋白处理从正常iPSC分化的血管内皮细胞3、6或9天，并以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹。此时，使用抗TSP1抗体(1：1000，Santacruz，美国)、抗KDR抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)、抗eNOS抗体(1：1000，CellSignaling Technologies，美国)、抗AKT抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)和抗磷酸化-AKT抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)作为抗体。

结果，如图19所示，TSP1蛋白的表达水平由于LysoGb3蛋白处理而增加，KDR蛋白和eNOS蛋白的表达水平以及AKT蛋白的磷酸化水平降低。

免疫染色证实了TSP1蛋白在由FB-iPSC分化的血管内皮细胞中的表达位置。在用LysoGb3蛋白处理从正常iPSC分化的血管内皮细胞后，以与实验例<1-1>中所述相同的方式进行实验。抗TSP1抗体(1：200，Santacruz，美国)用作第一抗体。

结果，如图20所示，通过LysoGb3蛋白处理而增加的TSP1蛋白分布在整个细胞中。

从上述结果，证实了Gb3蛋白是引起法布里病患者血管病变的主要物质。

由TGF-β抑制剂SB431542引起的血管内皮细胞的形态学变化通过以下方法证实。

特别地，使用在实施例2中制备的血管内皮细胞上仅用Fabrazyme处理的对照组、仅用SB431542处理的实验组(Cayman Chemical，美国)和用Fabrazyme和SB431542处理的实验组，证实了细胞的形态。

结果，如图21a至21e所示，由FB-iPSC分化的血管内皮细胞的异常形态通过SB431542处理恢复到正常。

使用蛋白质印迹证实了SB431542引起的血管病变相关蛋白表达水平的变化。

特别地，使用在实施例2中制备的血管内皮细胞上仅用Fabrazyme处理的对照组和用Fabrazyme和SB431542处理的实验组，以与实验例<3-1>中描述的相同方式进行蛋白质印迹。此时，使用抗TSP1抗体(1：1000，Santacruz，美国)、抗KDR抗体(1：1000，Cell SignalingTechnologies，美国)和抗eNOS抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)作为抗体。

结果，如图22所示，通过SB431542处理，TSP1蛋白的表达水平降低，但是KDR蛋白和eNOS蛋白的表达水平增加。

特别地，使用在实施例2中制备的血管内皮细胞上仅用Fabrazyme处理的对照组、仅用SB431542处理的实验组和用Fabrazyme和SB431542处理的实验组，以与实验例<4-2>中所述相同的方式确认管的形成。

结果，如图23a至23e所示，通过SB431542处理的血管内皮细胞在基质胶上形成管状。

TGF-β抑制剂氯沙坦引起的血管内皮细胞形态学变化通过以下方法证实。

特别地，使用在实施例2中制备的血管内皮细胞上仅用Fabrazyme处理的对照组、用Fabrazyme和SB431542处理的实验组以及用Fabrazyme和氯沙坦(Cayman Chemical，美国)处理的实验组，确认了细胞的形态。

结果，如图24a和24b所示，由FB-iPSC分化的血管内皮细胞的异常形态通过SB431542处理恢复到正常，而氯沙坦没有影响。

从上述结果来看，SB431542显示出对法布里病患者的血管病变具有治疗作用，但氯沙坦的作用无法证实。

为了法布里病患者血管病变的客观实验，使用CRISPR/CAS9系统制备FB-iPSC同种型对照细胞系(图25和26)。

特别地，在实施例1中制备的FB-iPSC中，GLA基因的缺陷使用靶向下表2中所示序列的CRISPR/CA9系统通过常规方法来校正。使用对靶标具有更高插入/缺失频率(indelfrequency)(表3)的靶2制备编辑的细胞系，并从中提取DNA，随后对其测序。

表2

表3

结果，如图27所示，获得了具有校正的GLA基因的FB-iPSC的同种型对照细胞系。

通过以与实施例2中所述相同的方式分化实施例3中制备的FB-iPSC同种型对照细胞来制备血管内皮细胞。

在FB-iPSC同种型对照细胞系和由此分化的血管内皮细胞中是否恢复了GLA活性通过以下方法得到证实。使用实施例3中制备的FB-iPSC同种型对照细胞系和实施例4中制备的血管内皮细胞，以与实验例2中所述相同的方式进行实验。

结果，如图28所示，在FB-iPSC同种型对照细胞系和由其分化的血管内皮细胞中，GLA活性得以恢复。

通过蛋白质印迹证实从FB-iPSC同种型对照细胞分化的血管内皮细胞中血管病变相关蛋白的表达水平。使用实施例2中制备的血管内皮细胞和用GLA(Genzyme，美国)处理的实施例4中制备的血管内皮细胞，以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹。此时，使用抗TSP1抗体(1：1000，Santacruz，美国)、抗SMAD2抗体(1：1000，Cell SignalingTechnologies，美国)、抗磷酸化-SMAD2抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)、抗KDR抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)和抗eNOS抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)作为抗体。

结果，如图29所示，与FB-iPSC分化的血管内皮细胞相比，从FB-iPSC同种型对照细胞分化的血管内皮细胞中TSP1蛋白的表达水平和SMAD蛋白的磷酸化水平降低，并且KDR蛋白和eNOS蛋白的表达水平增加。

通过免疫染色证实了抗血管生成因子蛋白在从FB-iPSC同种型对照细胞分化的血管内皮细胞中的表达位置。

特别地，使用实施例2中制备的血管内皮细胞和用GLA处理的实施例4中制备的血管内皮细胞，以与实验例<1-1>中所述相同的方式进行实验。使用抗VE-钙粘蛋白抗体(1：300，Abcam，UK)和抗TSP1抗体(1：200，Santacruz，USA)作为第一抗体。

结果，如图30所示，与从FB-iPSC分化的血管内皮细胞相比，从FB-iPSC同种型对照细胞分化的血管内皮细胞中TSP1蛋白的分布减少。

从FB-iPSC同种型对照细胞分化的血管内皮细胞的血管生成通过以下方法证实。使用实施例2中制备的血管内皮细胞和用GLA处理的实施例4中制备的血管内皮细胞，以与实验例<4-2>中所述相同的方式进行实验。

结果，如图31所示，与从FB-iPSC分化的血管内皮细胞相比，从FB-iPSC同种型对照细胞分化的血管内皮细胞在基质胶上形成更好的管状。

从以上结果，证实了GLA基因的校正恢复了法布里病患者的血管病变。

使用CRISPR/CAS9系统构建了一种FB-iPSC细胞系，其中被认为是法布里病患者血管病变的原因的TSP1基因被敲除(图32)。

特别地，在实施例1中制备的FB-iPSC的TSP1基因使用靶向下表4中所示的序列的CRISPR/CA9系统通过常规方法敲除。使用对靶标具有更高的插入缺失(indel)频率(表5)的靶2制备敲除细胞系，并从中提取DNA，随后对其测序。

表4

表5

结果，如图33所示，获得了TSP1基因被敲除的FB-iPSC细胞系。

通过以与实施例2中所述相同的方式分化实施例5中制备的TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞来制备血管内皮细胞。

从TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞分化的血管内皮细胞的形态学变化通过以下方法证实。在实验中，使用实施例2中制备的血管内皮细胞和用GLA处理的实施例6中制备的血管内皮细胞来确认细胞形态。

结果，如图34所示，从FB-iPSC分化的血管内皮细胞显示出异常形态，而从TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞分化的血管内皮细胞显示出正常形态。

RT-PCR反应证实了在由TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞分化的血管内皮细胞中的TSP1基因的RNA表达水平。特别地，使用实施例2中制备的血管内皮细胞和实施例6中制备的血管内皮细胞，以与实验例<8-2>中所述相同的方式进行RT-PCR反应。

结果，如图35所示，与正常对照细胞和从FB-iPSC分化的血管内皮细胞相比，从TSP1基因敲除的FB-IPSc细胞分化的血管内皮细胞中TSP1基因的RNA表达水平降低。

通过蛋白质印迹证实从TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞分化的血管内皮细胞中血管病变相关蛋白的表达水平。特别地，使用实施例2中制备的血管内皮细胞和实施例6中制备的血管内皮细胞，以与实验例<3-1>中所述相同的方式进行蛋白质印迹。使用抗TSP1抗体(1：1000，美国Santacruz)、抗KDR抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)、抗eNOS抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)、抗磷酸化-SMAD2抗体(1：1000，Cell Signaling Technologies，美国)和抗SMAD2抗体(1：1000，Cell SignalingTechnologies，美国)作为抗体。

结果，如图36所示，与从FB-iPSC分化的血管内皮细胞相比，从TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞分化的血管内皮细胞中，TSP1蛋白的表达水平和SMAD蛋白的磷酸化水平降低，并且KDR和eNOS蛋白的表达水平增加。

从TSP1基因敲除的FB-iPSC细胞分化的血管内皮细胞的血管生成通过以下方法证实。使用实施例2中制备的血管内皮细胞和用GLA处理的实施例4中制备的血管内皮细胞，以与实验例<4-2>中所述相同的方式进行实验。

结果，如图37所示，与从FB-iPSC分化的血管内皮细胞相比，从TSP1基因敲除的FB-IPSc细胞分化的血管内皮细胞在基质胶上形成更好的管状。

从上述结果，证实了TSP1蛋白是引起法布里病患者血管病变的主要蛋白，抑制其表达可以治愈法布里病。

序列表

<110> 韩国科学技术院（Korea Advanced Institute of Science and Technology）

<120> 含有TSP1蛋白抑制剂作为活性成分的用于预防或治疗法布里病的药物组合物

<130> LAF210311P

<150> KR10-2018-0118430

<151> 2018-10-04

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7775

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agctggcctg cgagttcagg gctcctgtcg ctctccagga gcaacctcta ctccggacgc 60

acaggcattc cccgcgcccc tccagccctc gccgccctcg ccaccgctcc cggccgccgc 120

gctccggtac acacaggatc cctgctgggc accaacagct ccaccatggg gctggcctgg 180

ggactaggcg tcctgttcct gatgcatgtg tgtggcacca accgcattcc agagtctggc 240

ggagacaaca gcgtgtttga catctttgaa ctcaccgggg ccgcccgcaa ggggtctggg 300

cgccgactgg tgaagggccc cgacccttcc agcccagctt tccgcatcga ggatgccaac 360

ctgatccccc ctgtgcctga tgacaagttc caagacctgg tggatgctgt gcgggcagaa 420

aagggtttcc tccttctggc atccctgagg cagatgaaga agacccgggg cacgctgctg 480

gccctggagc ggaaagacca ctctggccag gtcttcagcg tggtgtccaa tggcaaggcg 540

ggcaccctgg acctcagcct gaccgtccaa ggaaagcagc acgtggtgtc tgtggaagaa 600

gctctcctgg caaccggcca gtggaagagc atcaccctgt ttgtgcagga agacagggcc 660

cagctgtaca tcgactgtga aaagatggag aatgctgagt tggacgtccc catccaaagc 720

gtcttcacca gagacctggc cagcatcgcc agactccgca tcgcaaaggg gggcgtcaat 780

gacaatttcc agggggtgct gcagaatgtg aggtttgtct ttggaaccac accagaagac 840

atcctcagga acaaaggctg ctccagctct accagtgtcc tcctcaccct tgacaacaac 900

gtggtgaatg gttccagccc tgccatccgc actaactaca ttggccacaa gacaaaggac 960

ttgcaagcca tctgcggcat ctcctgtgat gagctgtcca gcatggtcct ggaactcagg 1020

ggcctgcgca ccattgtgac cacgctgcag gacagcatcc gcaaagtgac tgaagagaac 1080

aaagagttgg ccaatgagct gaggcggcct cccctatgct atcacaacgg agttcagtac 1140

agaaataacg aggaatggac tgttgatagc tgcactgagt gtcactgtca gaactcagtt 1200

accatctgca aaaaggtgtc ctgccccatc atgccctgct ccaatgccac agttcctgat 1260

ggagaatgct gtcctcgctg ttggcccagc gactctgcgg acgatggctg gtctccatgg 1320

tccgagtgga cctcctgttc tacgagctgt ggcaatggaa ttcagcagcg cggccgctcc 1380

tgcgatagcc tcaacaaccg atgtgagggc tcctcggtcc agacacggac ctgccacatt 1440

caggagtgtg acaagagatt taaacaggat ggtggctgga gccactggtc cccgtggtca 1500

tcttgttctg tgacatgtgg tgatggtgtg atcacaagga tccggctctg caactctccc 1560

agcccccaga tgaacgggaa accctgtgaa ggcgaagcgc gggagaccaa agcctgcaag 1620

aaagacgcct gccccatcaa tggaggctgg ggtccttggt caccatggga catctgttct 1680

gtcacctgtg gaggaggggt acagaaacgt agtcgtctct gcaacaaccc cacaccccag 1740

tttggaggca aggactgcgt tggtgatgta acagaaaacc agatctgcaa caagcaggac 1800

tgtccaattg atggatgcct gtccaatccc tgctttgccg gcgtgaagtg tactagctac 1860

cctgatggca gctggaaatg tggtgcttgt ccccctggtt acagtggaaa tggcatccag 1920

tgcacagatg ttgatgagtg caaagaagtg cctgatgcct gcttcaacca caatggagag 1980

caccggtgtg agaacacgga ccccggctac aactgcctgc cctgcccccc acgcttcacc 2040

ggctcacagc ccttcggcca gggtgtcgaa catgccacgg ccaacaaaca ggtgtgcaag 2100

ccccgtaacc cctgcacgga tgggacccac gactgcaaca agaacgccaa gtgcaactac 2160

ctgggccact atagcgaccc catgtaccgc tgcgagtgca agcctggcta cgctggcaat 2220

ggcatcatct gcggggagga cacagacctg gatggctggc ccaatgagaa cctggtgtgc 2280

gtggccaatg cgacttacca ctgcaaaaag gataattgcc ccaaccttcc caactcaggg 2340

caggaagact atgacaagga tggaattggt gatgcctgtg atgatgacga tgacaatgat 2400

aaaattccag atgacaggga caactgtcca ttccattaca acccagctca gtatgactat 2460

gacagagatg atgtgggaga ccgctgtgac aactgtccct acaaccacaa cccagatcag 2520

gcagacacag acaacaatgg ggaaggagac gcctgtgctg cagacattga tggagacggt 2580

atcctcaatg aacgggacaa ctgccagtac gtctacaatg tggaccagag agacactgat 2640

atggatgggg ttggagatca gtgtgacaat tgccccttgg aacacaatcc ggatcagctg 2700

gactctgact cagaccgcat tggagatacc tgtgacaaca atcaggatat tgatgaagat 2760

ggccaccaga acaatctgga caactgtccc tatgtgccca atgccaacca ggctgaccat 2820

gacaaagatg gcaagggaga tgcctgtgac cacgatgatg acaacgatgg cattcctgat 2880

gacaaggaca actgcagact cgtgcccaat cccgaccaga aggactctga cggcgatggt 2940

cgaggtgatg cctgcaaaga tgattttgac catgacagtg tgccagacat cgatgacatc 3000

tgtcctgaga atgttgacat cagtgagacc gatttccgcc gattccagat gattcctctg 3060

gaccccaaag ggacatccca aaatgaccct aactgggttg tacgccatca gggtaaagaa 3120

ctcgtccaga ctgtcaactg tgatcctgga ctcgctgtag gttatgatga gtttaatgct 3180

gtggacttca gtggcacctt cttcatcaac accgaaaggg acgatgacta tgctggattt 3240

gtctttggct accagtccag cagccgcttt tatgttgtga tgtggaagca agtcacccag 3300

tcctactggg acaccaaccc cacgagggct cagggatact cgggcctttc tgtgaaagtt 3360

gtaaactcca ccacagggcc tggcgagcac ctgcggaacg ccctgtggca cacaggaaac 3420

acccctggcc aggtgcgcac cctgtggcat gaccctcgtc acataggctg gaaagatttc 3480

accgcctaca gatggcgtct cagccacagg ccaaagacgg gtttcattag agtggtgatg 3540

tatgaaggga agaaaatcat ggctgactca ggacccatct atgataaaac ctatgctggt 3600

ggtagactag ggttgtttgt cttctctcaa gaaatggtgt tcttctctga cctgaaatac 3660

gaatgtagag atccctaatc atcaaattgt tgattgaaag actgatcata aaccaatgct 3720

ggtattgcac cttctggaac tatgggcttg agaaaacccc caggatcact tctccttggc 3780

ttccttcttt tctgtgcttg catcagtgtg gactcctaga acgtgcgacc tgcctcaaga 3840

aaatgcagtt ttcaaaaaca gactcagcat tcagcctcca atgaataaga catcttccaa 3900

gcatataaac aattgctttg gtttcctttt gaaaaagcat ctacttgctt cagttgggaa 3960

ggtgcccatt ccactctgcc tttgtcacag agcagggtgc tattgtgagg ccatctctga 4020

gcagtggact caaaagcatt ttcaggcatg tcagagaagg gaggactcac tagaattagc 4080

aaacaaaacc accctgacat cctccttcag gaacacgggg agcagaggcc aaagcactaa 4140

ggggagggcg catacccgag acgattgtat gaagaaaata tggaggaact gttacatgtt 4200

cggtactaag tcattttcag gggattgaaa gactattgct ggatttcatg atgctgactg 4260

gcgttagctg attaacccat gtaaataggc acttaaatag aagcaggaaa gggagacaaa 4320

gactggcttc tggacttcct ccctgatccc cacccttact catcacctgc agtggccaga 4380

attagggaat cagaatcaaa ccagtgtaag gcagtgctgg ctgccattgc ctggtcacat 4440

tgaaattggt ggcttcattc tagatgtagc ttgtgcagat gtagcaggaa aataggaaaa 4500

cctaccatct cagtgagcac cagctgcctc ccaaaggagg ggcagccgtg cttatatttt 4560

tatggttaca atggcacaaa attattatca acctaactaa aacattcctt ttctcttttt 4620

tcctgaatta tcatggagtt ttctaattct ctcttttgga atgtagattt tttttaaatg 4680

ctttacgatg taaaatattt attttttact tattctggaa gatctggctg aaggattatt 4740

catggaacag gaagaagcgt aaagactatc catgtcatct ttgttgagag tcttcgtgac 4800

tgtaagattg taaatacaga ttatttatta actctgttct gcctggaaat ttaggcttca 4860

tacggaaagt gtttgagagc aagtagttga catttatcag caaatctctt gcaagaacag 4920

cacaaggaaa atcagtctaa taagctgctc tgccccttgt gctcagagtg gatgttatgg 4980

gattcttttt ttctctgttt tatcttttca agtggaatta gttggttatc catttgcaaa 5040

tgttttaaat tgcaaagaaa gccatgaggt cttcaatact gttttacccc atcccttgtg 5100

catatttcca gggagaagga aagcatatac acttttttct ttcatttttc caaaagagaa 5160

aaaaatgaca aaaggtgaaa cttacataca aatattacct catttgttgt gtgactgagt 5220

aaagaatttt tggatcaagc ggaaagagtt taagtgtcta acaaacttaa agctactgta 5280

gtacctaaaa agtcagtgtt gtacatagca taaaaactct gcagagaagt attcccaata 5340

aggaaatagc attgaaatgt taaatacaat ttctgaaagt tatgtttttt ttctatcatc 5400

tggtatacca ttgctttatt tttataaatt attttctcat tgccattgga atagatatct 5460

cagattgtgt agatatgcta tttaaataat ttatcaggaa atactgcctg tagagttagt 5520

atttctattt ttatataatg tttgcacact gaattgaaga attgttggtt ttttcttttt 5580

tttgttttgt tttttttttt tttttttttt gcttttgacc tcccattttt actatttgcc 5640

aatacctttt tctaggaatg tgcttttttt tgtacacatt tttatccatt ttacattcta 5700

aagcagtgta agttgtatat tactgtttct tatgtacaag gaacaacaat aaatcatatg 5760

gaaatttata tttatactta ctgtatccat gcttatttgt tctctactgg ctttatgtca 5820

tgaagtatat gcgtaaatac cattcataaa tcaatatagc atatacaaaa ataaattaca 5880

gtaagtcata gcaacattca cagtttgtat gtgattgaga aagactgagt tgctcaggcc 5940

taggcttaga atttgctgcg tttgtggaat aaaagaacaa aatgatacat tagcctgcca 6000

tatcaaaaac atataaaaga gaaattatcc ctaagtcaag ggcccccata agaataaaat 6060

ttcttattaa ggtcattaga tgtcattgaa tccttttcaa agtgcagtat gaaaacaaag 6120

ggaaaaacac tgaagcacac gcaactctca cagcgacatt ttctgaccca cgaatgatgc 6180

cttgggtggg caacacgatt gcatgttgtg gagacacttc ggaagtaaat gtggatgagg 6240

gaggagctgt ccttgcaatg ttgagccaag cattacagat acctcctctt gaagaaggaa 6300

taataagttt aatcaaaaaa gaagactaaa aaatgtaaaa tttggaagga atccataaat 6360

gcgtgtgtgt ctaaatacaa attatcatgt gaagaaaagg cccaagtgta ccaataagca 6420

gaccttgatt tttggatggg ctaattatga atgtggaata ctgaccagtt aatttccagt 6480

tttaatgaaa acagatcaaa gaagaaattt tatgagtagg ttaaaggtct ggctttgagg 6540

tctattaaac actagaaagg actggctggg tgagataaaa tcttccttgt tgattttcac 6600

tctcattcta taaatactca tctttctgag tagccatgat cacatacaaa tgtaaattgc 6660

caaatcattt tatagtacca aggtgaagaa gcaggaacta gaaagtgttg ataatagctg 6720

tggagttagg aaaactgatg tgaaggaaat aattctttga aatggcaaag aattaaatac 6780

catcattcat tatcagaaga gttcaacgtt tgaagtgctg ggagataatt ctaattcatt 6840

cttggatagt gaagcaaaac tgattgaaaa taccaagata agacagaaaa agtgactgga 6900

aagaggagct tttcttccag gcatgttcca gtttcaccct aagactgacc ttcaaataat 6960

caggttgtac tgaaataaag gacttgttaa aaattaaaat tatgtcatcg agatgatagc 7020

ttttttcctc ctccaacagt ttattgtcat gtgttgtggg agagctcgag tgaagagcaa 7080

taaactccag gtcttataag aatgtacata caataaaggt ggtgccagca gttttttttt 7140

ttctaaagag tcacatgtag aaaagcctcc agtattaagc tcctgaattc attccttaaa 7200

taaattggct ctctctctct tctataattt ctttttcttt ttatttttga gatgaagtct 7260

tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga cacaatctcg gctcactgca acctctgcct 7320

ccccggttca agcaattctc cctcctgcct cagcctccca agtagctggg actacaagcg 7380

cccgccacca agcctggcta attctgtatt tttagtaaag acggggtttc accttgttcc 7440

ggacaaacac taagccctaa agggaaatcc aaaataaaaa catctatttt taataacact 7500

ttctatctaa atcagggtga ctttttaaaa aaaatccgga agctttttgt tgaattacgt 7560

tacagactta gttaccagtc cttgttagag ttaccttcag ttgacatgct gtgaatggtc 7620

ccacctcttt tatggcagaa ttcattactt aaaataactc tattttcttc ccccttacct 7680

aaataacaga aaggctcact atgtcccaaa tatcattggc agaagcaaac tataaagtca 7740

taagcccttt gcagtgcaag tctagaaata atttt 7775

<210> 2

<211> 1170

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Gly Leu Ala Trp Gly Leu Gly Val Leu Phe Leu Met His Val Cys

1 5 10 15

Gly Thr Asn Arg Ile Pro Glu Ser Gly Gly Asp Asn Ser Val Phe Asp

20 25 30

Ile Phe Glu Leu Thr Gly Ala Ala Arg Lys Gly Ser Gly Arg Arg Leu

35 40 45

Val Lys Gly Pro Asp Pro Ser Ser Pro Ala Phe Arg Ile Glu Asp Ala

50 55 60

Asn Leu Ile Pro Pro Val Pro Asp Asp Lys Phe Gln Asp Leu Val Asp

65 70 75 80

Ala Val Arg Ala Glu Lys Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ser Leu Arg Gln

85 90 95

Met Lys Lys Thr Arg Gly Thr Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Asp His

100 105 110

Ser Gly Gln Val Phe Ser Val Val Ser Asn Gly Lys Ala Gly Thr Leu

115 120 125

Asp Leu Ser Leu Thr Val Gln Gly Lys Gln His Val Val Ser Val Glu

130 135 140

Glu Ala Leu Leu Ala Thr Gly Gln Trp Lys Ser Ile Thr Leu Phe Val

145 150 155 160

Gln Glu Asp Arg Ala Gln Leu Tyr Ile Asp Cys Glu Lys Met Glu Asn

165 170 175

Ala Glu Leu Asp Val Pro Ile Gln Ser Val Phe Thr Arg Asp Leu Ala

180 185 190

Ser Ile Ala Arg Leu Arg Ile Ala Lys Gly Gly Val Asn Asp Asn Phe

195 200 205

Gln Gly Val Leu Gln Asn Val Arg Phe Val Phe Gly Thr Thr Pro Glu

210 215 220

Asp Ile Leu Arg Asn Lys Gly Cys Ser Ser Ser Thr Ser Val Leu Leu

225 230 235 240

Thr Leu Asp Asn Asn Val Val Asn Gly Ser Ser Pro Ala Ile Arg Thr

245 250 255

Asn Tyr Ile Gly His Lys Thr Lys Asp Leu Gln Ala Ile Cys Gly Ile

260 265 270

Ser Cys Asp Glu Leu Ser Ser Met Val Leu Glu Leu Arg Gly Leu Arg

275 280 285

Thr Ile Val Thr Thr Leu Gln Asp Ser Ile Arg Lys Val Thr Glu Glu

290 295 300

Asn Lys Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg Arg Pro Pro Leu Cys Tyr His

305 310 315 320

Asn Gly Val Gln Tyr Arg Asn Asn Glu Glu Trp Thr Val Asp Ser Cys

325 330 335

Thr Glu Cys His Cys Gln Asn Ser Val Thr Ile Cys Lys Lys Val Ser

340 345 350

Cys Pro Ile Met Pro Cys Ser Asn Ala Thr Val Pro Asp Gly Glu Cys

355 360 365

Cys Pro Arg Cys Trp Pro Ser Asp Ser Ala Asp Asp Gly Trp Ser Pro

370 375 380

Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser Cys Gly Asn Gly Ile Gln

385 390 395 400

Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn Asn Arg Cys Glu Gly Ser

405 410 415

Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln Glu Cys Asp Lys Arg Phe

420 425 430

Lys Gln Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser

435 440 445

Val Thr Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys Asn Ser

450 455 460

Pro Ser Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly Glu Ala Arg Glu

465 470 475 480

Thr Lys Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Ile Asn Gly Gly Trp Gly

485 490 495

Pro Trp Ser Pro Trp Asp Ile Cys Ser Val Thr Cys Gly Gly Gly Val

500 505 510

Gln Lys Arg Ser Arg Leu Cys Asn Asn Pro Thr Pro Gln Phe Gly Gly

515 520 525

Lys Asp Cys Val Gly Asp Val Thr Glu Asn Gln Ile Cys Asn Lys Gln

530 535 540

Asp Cys Pro Ile Asp Gly Cys Leu Ser Asn Pro Cys Phe Ala Gly Val

545 550 555 560

Lys Cys Thr Ser Tyr Pro Asp Gly Ser Trp Lys Cys Gly Ala Cys Pro

565 570 575

Pro Gly Tyr Ser Gly Asn Gly Ile Gln Cys Thr Asp Val Asp Glu Cys

580 585 590

Lys Glu Val Pro Asp Ala Cys Phe Asn His Asn Gly Glu His Arg Cys

595 600 605

Glu Asn Thr Asp Pro Gly Tyr Asn Cys Leu Pro Cys Pro Pro Arg Phe

610 615 620

Thr Gly Ser Gln Pro Phe Gly Gln Gly Val Glu His Ala Thr Ala Asn

625 630 635 640

Lys Gln Val Cys Lys Pro Arg Asn Pro Cys Thr Asp Gly Thr His Asp

645 650 655

Cys Asn Lys Asn Ala Lys Cys Asn Tyr Leu Gly His Tyr Ser Asp Pro

660 665 670

Met Tyr Arg Cys Glu Cys Lys Pro Gly Tyr Ala Gly Asn Gly Ile Ile

675 680 685

Cys Gly Glu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Trp Pro Asn Glu Asn Leu Val

690 695 700

Cys Val Ala Asn Ala Thr Tyr His Cys Lys Lys Asp Asn Cys Pro Asn

705 710 715 720

Leu Pro Asn Ser Gly Gln Glu Asp Tyr Asp Lys Asp Gly Ile Gly Asp

725 730 735

Ala Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asp Lys Ile Pro Asp Asp Arg Asp

740 745 750

Asn Cys Pro Phe His Tyr Asn Pro Ala Gln Tyr Asp Tyr Asp Arg Asp

755 760 765

Asp Val Gly Asp Arg Cys Asp Asn Cys Pro Tyr Asn His Asn Pro Asp

770 775 780

Gln Ala Asp Thr Asp Asn Asn Gly Glu Gly Asp Ala Cys Ala Ala Asp

785 790 795 800

Ile Asp Gly Asp Gly Ile Leu Asn Glu Arg Asp Asn Cys Gln Tyr Val

805 810 815

Tyr Asn Val Asp Gln Arg Asp Thr Asp Met Asp Gly Val Gly Asp Gln

820 825 830

Cys Asp Asn Cys Pro Leu Glu His Asn Pro Asp Gln Leu Asp Ser Asp

835 840 845

Ser Asp Arg Ile Gly Asp Thr Cys Asp Asn Asn Gln Asp Ile Asp Glu

850 855 860

Asp Gly His Gln Asn Asn Leu Asp Asn Cys Pro Tyr Val Pro Asn Ala

865 870 875 880

Asn Gln Ala Asp His Asp Lys Asp Gly Lys Gly Asp Ala Cys Asp His

885 890 895

Asp Asp Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Asp Lys Asp Asn Cys Arg Leu

900 905 910

Val Pro Asn Pro Asp Gln Lys Asp Ser Asp Gly Asp Gly Arg Gly Asp

915 920 925

Ala Cys Lys Asp Asp Phe Asp His Asp Ser Val Pro Asp Ile Asp Asp

930 935 940

Ile Cys Pro Glu Asn Val Asp Ile Ser Glu Thr Asp Phe Arg Arg Phe

945 950 955 960

Gln Met Ile Pro Leu Asp Pro Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Pro Asn

965 970 975

Trp Val Val Arg His Gln Gly Lys Glu Leu Val Gln Thr Val Asn Cys

980 985 990

Asp Pro Gly Leu Ala Val Gly Tyr Asp Glu Phe Asn Ala Val Asp Phe

995 1000 1005

Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Thr Glu Arg Asp Asp Asp Tyr Ala Gly

1010 1015 1020

Phe Val Phe Gly Tyr Gln Ser Ser Ser Arg Phe Tyr Val Val Met Trp

1025 1030 1035 1040

Lys Gln Val Thr Gln Ser Tyr Trp Asp Thr Asn Pro Thr Arg Ala Gln

1045 1050 1055

Gly Tyr Ser Gly Leu Ser Val Lys Val Val Asn Ser Thr Thr Gly Pro

1060 1065 1070

Gly Glu His Leu Arg Asn Ala Leu Trp His Thr Gly Asn Thr Pro Gly

1075 1080 1085

Gln Val Arg Thr Leu Trp His Asp Pro Arg His Ile Gly Trp Lys Asp

1090 1095 1100

Phe Thr Ala Tyr Arg Trp Arg Leu Ser His Arg Pro Lys Thr Gly Phe

1105 1110 1115 1120

Ile Arg Val Val Met Tyr Glu Gly Lys Lys Ile Met Ala Asp Ser Gly

1125 1130 1135

Pro Ile Tyr Asp Lys Thr Tyr Ala Gly Gly Arg Leu Gly Leu Phe Val

1140 1145 1150

Phe Ser Gln Glu Met Val Phe Phe Ser Asp Leu Lys Tyr Glu Cys Arg

1155 1160 1165

Asp Pro

1170

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<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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