ML365在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用

摘要

本发明首次公开了ML365在制备用于预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。发明人研究发现ML365可特异性得抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体活化，而对Niegericin诱导的NLRP3、AIM2、NLRC4炎症小体无影响。ML365作为TWIK2的特异性强效抑制剂，可以特异性抑制ATP激活，从而使得NLRP3炎症小体活化受阻，这可为未来NLRP3炎症小体相关疾病的药物开发提供理论基础，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及ML365在制备预防和治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

背景技术

炎症小体是天然免疫的核心组成部分(Schroder and Tschopp 2010；Broz andDixit 2016)。在众多炎症小体中，NLRP3炎症小体的临床相关性最为显著，因此受到广泛关注与研究。NLRP3炎症小体的独特性在于其可受各种类型病原相关分子模式(PAMPs)或损伤相关分子模式(DAMPs)信号活化，如ATP、晶体类分子(尿酸盐结晶MSU、二氧化硅、石棉和明矾等)、病原体分泌的毒素(Nigericin和Maitotoxin等)和神经退行性疾病相关的错误折叠蛋白 (β-淀粉样蛋白和α-突触核蛋白)等(Davis et al.2011；Heneka et al.2013；Gordonet al.2018)。 NLRP3炎症小体由感受蛋白NLRP3、接头蛋白ASC、效应蛋白pro-caspase-1组成(Zoete et al. 2014)。其活化包含启动(Priming)和激活(Activation)两个步骤，启动主要通过LPS等激动作用于细胞膜上的Toll样受体(TLR)，活化NF-κB信号通路，诱导NLRP3、IL-1β前体和IL-18前体表达；激活则是通过特定化合物(ATP等)、病原体或毒素(nigericin等)促进炎症小体复合物的组装，促使caspase-1前体进行自我切割形成有活性的caspase-1， caspase-1进而酶解切割底物IL-1β前体和IL-18前体形成具有生物活性的成熟形式IL-1β和 IL-18释放到细胞外，引起炎症反应，促进发热、免疫细胞的募集和激活以及次级细胞因子的产生；同时，活化的caspase-1切割GSDMD蛋白(Gasdermin D)，被切割后的GSDMD的 N端上膜形成孔道，水进入细胞使细胞膨胀破裂，细胞内容物释放到细胞外，引起细胞焦亡(KV et al.2019)。

适度的NLRP3炎症小体活化对清除微生物感染非常重要，然而，其异常激活与各种自身炎性或慢性炎症密切相关。目前已报道的与NLRP3相关的疾病有多种代谢性疾病，如脓毒症肺损伤、类风湿性关节炎、痛风、动脉粥样硬化和2型糖尿病等，以及神经退行性疾病，包括多发性硬化症、阿尔兹海默症和帕金森综合征等(Halle et al.2008；Strowig etal.2012； Heneka et al.2013；Barclay and Shinohara 2017；Gordon et al.2018；Martínez-García et al.2019； Danielski et al.2020)。

NLRP3炎症小体激活的过程非常复杂，调控其激活的机制仍在探索中。受到广泛认可得是，胞内钾离子外流是激活NLRP3炎症小体的必要、充分条件(Walev et al.1995；

K2P钾离子通道家族是最晚发现的钾离子通道家族，该家族通道在静息膜电位附近开放，介导背景漏钾电流，负责稳定细胞静息膜电位(Enyedi and Czirják 2010)。K2P通道包括6个亚家族，分别为TWIK、TASK、TREK、TALK、THIK和TRESK，共15个成员。K2P通道的拓扑结构不同于其他钾通道家族，通道由2个相同的亚单位(同源二聚体)或不同的亚单位(异源二聚体)聚集形成有功能的二聚体，每一个亚单位包含4个跨膜螺旋区(M1-M4)、 2个孔区(P1和P2)、胞外的帽子区(M1P1环)和胞质的N端、C端。最近研究报道K2P 通道家族成员TWIK2通道介导了巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化过程中的钾离子外流(Di et al.2018)，对NLRP3炎症小体活化至关重要。在小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中，编码TWIK2的mRNA水平是所有K2P通道中最高的，通过奎宁药理学抑制或基因敲除 TWIK2通道可以抑制BMDM细胞中NLRP3炎症小体的激活，具体表现为抑制caspase-1的激活、ATP诱发的IL-1β的释放以及凋亡相关斑点形成蛋白ASC的寡聚化。该研究认为在 ATP激活NLRP3炎症小体的过程中，TWIK2通道和P2X7受体协同作用介导钾离子外流， TWIK2通道缺失的情况下NLRP3炎症小体的活化显著受阻(Di Virgilio et al.2017)。

尽管最近的研究表明TWIK2通道在巨噬细胞中介导钾离子外流参与NLRP3炎症小体的活化。但是，很长时间以来，TWIK通道一直被认为是无功能的，因为TWIK通道在外源表达系统中呈现低功能性或无功能性表达(Patel et al.2000)。关于TWIK通道在外源表达系统中无功能主要有两个解释，一个是泛素化理论，认为TWIK通道在细胞表面表达，但通过泛素化沉默导致在转染细胞和本体细胞中通道活性丧失；另一个是核内体理论，认为TWIK通道从细胞表面组成性迅速撤回，通过发动蛋白依赖性的机制内化并传递到循环核内体隔室中，从而导致细胞膜上TWIK通道缺失或不足，检测不到TWIK电流，研究发现胞内C末端的重复异亮氨酸突变TWIK1-I293/294A可使通道稳定在细胞膜上而导致强电流(Rajan et al.2005；Lloyd et al.2011；Hwang et al.2014；Bobak et al.2017)。上述难点导致目前对TWIK的电生理特性和功能意义知之甚少，也尚未有TWIK通道的调节剂被报道(Lv etal.2019)。

综上所述，本领域对于发现TWIK2通道抑制剂而阻断NLRP3炎症小体以治疗相关炎症性疾病存在需求。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供ML365、其药学上可接受的盐或多晶型物在制备预防和/ 或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。

本发明第二个方面的目的，在于提供ML365、其药学上可接受的盐或多晶型物在制备炎症小体抑制剂中的应用。

本发明第三个方面的目的，在于提供ML365、其药学上可接受的盐或多晶型物在制备 NLRP3炎症小体异常激活疾病药物中的应用。

本发明第四个方面的目的，在于提供ML365、其药学上可接受的盐或多晶型物在制备钾离子通道抑制剂中的应用。

本发明第五个方面的目的，在于提供一种治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物。

本发明所采取的技术方案是：

ML365，化学名称，2-甲氧基-N-[3-[(3-甲基苯甲酰基)氨基]苯基]苯甲酰胺。在2010 年首次收录进PubChem，为人工合成化合物。该化合物分子式是C

本发明的第一个方面，提供化合物在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用，所述化合物为式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

进一步地，所述NLRP3炎症小体相关疾病包括腹膜炎、脓毒症肺损伤、II型糖尿病或高脂食物诱导的肥胖、帕金森综合征、阿尔兹海默症、多发性硬化症、肠炎、肝炎、硅肺、石棉肺、矽肺、白塞病和类风湿关节炎。

本发明的第二个方面，提供化合物在制备炎症小体抑制剂中的应用，所述化合物为式(I) 所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

进一步地，所述炎症小体包括NLRP3炎症小体。

本发明的第三个方面，提供化合物在制备NLRP3炎症小体异常激活疾病药物中的应用，所述化合物为式(I)所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

进一步地，所述NLRP3炎症小体异常激活疾病包括动脉粥样硬化、2型糖尿病或痛风。

本发明的部分实施例中验证了ML365可以作为TWIK2的特异性强效抑制剂，可以特异性抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体的活化，因此可以用于治疗NLRP3炎症小体异常激活疾病。

本发明的第四个方面，提供化合物在制备钾离子通道抑制剂中的应用，所述化合物为式 (I)所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

进一步地，所述钾离子通道包括双孔钾离子通道或TWIK2通道。

本发明的部分实施中验证了ML365是特异性的TWIK2通道的特异性选择抑制剂。

本发明的第五个方面，提供治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物，所述药物含有式(I) 所示化合物、其药学上可接受的盐或多晶型物；

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

更进一步地，所述NLRP3炎症小体相关疾病包括腹膜炎、脓毒症肺损伤、II型糖尿病或高脂食物诱导的肥胖、帕金森综合征、阿尔兹海默症、多发性硬化症、肠炎、肝炎、硅肺、石棉肺、矽肺、白塞病和类风湿关节炎。

本发明的有益效果是：

发明人通过电生理实验发现ML365是TWIK2通道的强效选择性抑制剂。ML365(10μM) 对TWIK2通道抑制作用的I/I

此外，通过体外研究实验发现，ML365可特异性地抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体的活化，而对Nigericin诱导的NLRP3炎症小体的活化、AIM2、NLRC4非经典炎症小体的活化无影响。这些结果与TWIK2通道在NLRP3炎症小体中的重要作用一致。

进一步，通过对ML365抑制NLRP3炎症小体作用的分子机制的研究发现，敲低TWIK2后，ML365抑制NLRP3炎症小体的活性显著下降，说明ML365通过阻断TWIK2通道从而抑制NLRP3炎症小体。

基于上述的有益结果，本发明为制备用于预防或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物提供了一个新的研发切入口，有望成为未来TWIK2通道抑制剂的先导化合物。这可为未来 NLRP3炎症小体相关疾病的药物开发提供理论基础。

附图说明

图1：THIK1通道亚克隆到pcDNA3.1(+)的质粒图谱。

图2：野生型TWIK2(wtTWIK2)和突变型TWIK2(muTWIK2)通道的电生理典型电流图(图2中A)及电流密度统计图(图2中B)。

图3：用于说明ML365等化合物对TWIK2通道的调控作用。A为本研究中使用的六种K2P通道调节剂的化学结构图；B为10μM ML365对muTWIK2作用前后的典型电流图；C 为K2P通道调节剂对muTWIK2通道影响的总结。

图4：用于说明ML365对TWIK2通道抑制作用的生理学特性。A为10μMML365对muTWIK2通道的作用的典型电流图；B为在不同电压下(-60～+80mV)ML365(10μM)对muTWIK2抑制作用的总结图；C为ML365抑制muTWIK2通道的剂量-效应曲线。

图5：野生型TWIK1(wtTWIK1)和突变型TWIK1(muTWIK1)通道的电生理典型电流图(图5中A)及电流密度统计图(图5中B)。

图6：用于说明ML365等化合物对TWIK1通道的作用。A为10μMML365对muTWIK1 作用前后的典型图；B为所检测的K2P通道调节剂对muTWIK1的作用的总结。

图7：用于说明20μM ML365对muTWIK1和THIK1通道的作用效果。A为20μM ML365 对muTWIK1作用效果的时间电流图；B为20μM ML365对THIK1作用效果的时间电流图； C为20μMML365对muTWIK1和THIK1通道的作用效果的总结图。

图8：用于说明ML365等化合物对THIK1通道的作用。A为对BMDM细胞、RAW264.7 细胞和BV-2细胞中的TWIK和THIK亚家族通道进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析的结果；B为为ML365(10μM)对THIK1作用前后的典型图；C为所检测的K2P通道调节剂对 THIK1的作用总结。

图9：用于说明ML365可特异性抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体的活化。A为用免疫印迹法(WB)检测BMDM细胞的细胞裂解液或上清液中，用不同浓度ML365在LPS与ATP 诱导下对NLRP3炎症小体活化的影响结果图；B、C为用酶联免疫吸附法(ELISA)检测BMDM 细胞的细胞上清液中，用不同浓度ML365在LPS与ATP诱导下对IL-1β和TNF-α生成的影响结果图；D为用免疫印迹法(WB)检测BMDM细胞的细胞裂解液或上清液中，用不同浓度ML365在LPS与Nigericin诱导下对NLRP3炎症小体活化的影响结果图；E、F为为用酶联免疫吸附法(ELISA)检测BMDM细胞的细胞上清液中，用不同浓度ML365在LPS与 Nigericin诱导下对IL-1β和TNF-α生成的影响结果图；G,H,I图为用ELISA检测ML365(5μM) 在AIM2,NLRC4和非经典炎症小体活化过程中对IL-1β分泌的影响。其中LPS+poly(dA:dT) 为AIM2炎症小体的刺激物；Pam3CSK4与转染的LPS(cLPS)诱导非经典炎症小体活化， Pam3CSK4与Flagellin诱导NLRC4炎症小体的活化。

图10：用于说明ML365抑制ATP诱导的NLRP3炎症小体活化(图10中A)，而对Nigericin 诱导的NLRP3炎症小体的活化无影响(图10中B)。

图11：用于说明敲低TWIK2可消除ML365对ATP诱导的NLRP3炎症小体激活的抑制作用。A为实时荧光定量PCR检测TWIK2通道敲低的结果；B为在敲低TWIK2前后的BMDM 细胞中，用免疫印迹法(WB)检测LPS与ATP诱导下，ML365(5μM)对NLRP3炎症小体活化作用的结果图；C为B对应的IL-1β生成的酶联免疫吸附(ELISA)结果图。

具体实施方式

ML365，化学名称，2-甲氧基-N-[3-[(3-甲基苯甲酰基)氨基]苯基]苯甲酰胺。在2010 年首次收录进PubChem，为人工合成化合物。该化合物分子式是C

ML335，CAS:1069498-96-9，1-[[4-(乙酰氨基)苯基]甲基]-4-(2-苯基乙基)-4-哌啶甲酸乙酯，其化学结构式如式(Ⅱ)所示：

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1THIK1质粒的构建

人源THIK1(Gene ID:56659)，根据Genebank所公布的人源THIK1基因序列，利用EditSeq 软件寻找其Open Read Frame(ORF)序列，在N端和C端分别引入HindIII和ApaI限制性内切酶酶切位点后，将该片段克隆到pcDNA3.1(+)载体中。THIK1质粒载体图谱见图1。

实施例2电生理实验发现ML365强效抑制TWIK2通道的实验

一、实验材料：

1.质粒：所用的质粒有人源TWIK1-WT、TWIK1-I293/294A/K274E和人源TWIK2-WT、TWIK2-Y308A/I289A/L290A，分别为人源TWIK1(Gene ID:3775)和TWIK2(Gene ID:9424) 的野生型通道及带有相应突变位点的功能性通道(能在异源表达系统中呈现电生理活性)，由法国Prof.Florian Lessage(Institut de PharmacologieMoléculaire et Cellulaire,France)所赠予。

2.对照药物：K2P通道调节剂包括DCPIB(Apexbio B6780，98％)，由美国ApexBio公司提供、奎宁由上海阿拉丁生化公司提供、氟西汀(陶术T0450，99.3％)，由上海陶素公司提供、ML335由美国MCE公司提供、TKDC由美国SPECS公司提供；

ML365：由美国MCE公司提供；

COS-7细胞：从ATCC(American type culture collection)购买；

0.25％胰酶：由美国Thermo fisher公司提供。

3.溶液：

(1)K2P通道全细胞膜片钳实验外液：KCl 2.5mM，MgCl

(2)K2P通道全细胞膜片钳实验内液：EGTA5mM，MgCl

(3)抗生素配制：50mg/mL卡那霉素(卡那霉素)0.5g，100mg/mL氨苄青霉素(氨苄青霉素钠盐)1g，将相应粉末溶于10mL高压灭菌的双蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃储存，使用前按1：1000加入培养基中；

(4)LB培养基配制：NaCl1g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，溶于100mL双蒸水中 (若配固体培养基则添加1.5％琼脂)，高压蒸汽灭菌，冷却至65℃左右，加入相应的抗生素，于4℃保存备用；

(5)50×TAE电泳液配制：Na

(6)WB用封闭缓冲液：脱脂奶粉2.5g，TBST50 mL，涡旋混匀，备用；

(7)WB用TBST缓冲液：TBS粉末1包，吐温201mL，加双蒸水至2L，备用；

(8)WB用转膜缓冲液：Tris-base 5.8g，甘氨酸2.9g，十二烷基硫酸钠0.37g，甲醇200 mL，加双蒸水至1L，备用；

(9)WB用电泳缓冲液：Tris-base 3.3g，甘氨酸18.8g，十二万基硫酸钠1g，加双蒸水至1L，备用；

(10)化合物溶液：将DCPIB、氟西汀、奎宁、ML335、TKDC和ML365分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成100mM或20mM母液，于-20℃保存备用。使用前取适量体积化合物母液配成目的浓度。

二、实验方法：

1.质粒提取：提前将所需耗材放入超净台中，打开紫外照射30min；往已高压灭菌的玻璃试管中加入5mL含对应抗生素(50μg/ml卡那霉素或100μg/mL氨苄青霉素)的LB液体培养基；用已高压灭菌的小枪头挑取相应质粒转化后的单克隆菌落，将枪头直接打入试管内，用铝箔纸包裹试管口；将试管放入37℃振荡摇床中，以250rpm的转速培养16-20h；将以上菌液转移至离心管内，10000xg、离心1min，倒掉上清，收集菌液沉淀；向离心管的菌液沉淀加入Solution I/RNase A 250μL，吹打至沉淀充分重悬；再向离心管中加入Solution II250 μL，轻轻翻转数次，静置2min至菌液澄清；再次向离心管内加入Solution III 350μL，立即温和翻转几次(避免形成局部沉淀)；13000xg、离心10min；把吸附柱放入2mL收集管中，将上述得到的上清转液移到吸附柱中，注意不要碰到沉淀，13000xg、离心1min，倒净收集管中废液。往吸附柱内加入HBC buffer 500μL，13000xg、离心1min，倒净收集管中废液；往吸附柱内加入Wash buffer 700μL，13000xg、离心1min；倒净收集管中废液，重复一次；将吸附柱放回收集管中，13000xg、离心2min甩干吸附柱。取一个新的离心管中，将吸附柱放入其中，往吸附柱中央加入50μL去离子水，室温静置2min，13000xg、离心1min；取离心管内洗脱液再次加入吸附柱内，室温静置2min，13000xg、离心1min；离心管内洗脱液为提取得到的质粒，用分光光度计测定质粒浓度和纯度。保存于-20℃备用；

2.细胞转染：当12孔板中的细胞融合度达到60-70％即可进行转染，利用Lipofectamine 2000将带绿色荧光蛋白标记的K2P通道质粒转染进COS-7细胞中；取两个1.5mL离心管，分别加入125uL的Opti-MEM培养基。向其中一个离心管加入10μL的lipofectamine2000试剂，向另一个离心管加入3000ng的待转染质粒，轻微涡旋混匀，室温放置5min。将稀释的质粒加入稀释的lipofectamine2000中，轻微涡旋混匀，室温放置5min；将待转染细胞的旧培养基吸走，加入新的完全培养基，将中的质粒-脂质复合物轻轻滴入到细胞培养基中，放回 37℃、含5％CO

3.全细胞膜片钳记录K2P通道电流：转染后24～48h，取接种了细胞的盖玻片，在荧光倒置显微镜下选取发绿色荧光的细胞进行电生理实验。依次给予药后，通过硬件Digidata 1550B数据采集系统和MultiClamp 700B膜片钳放大器及软件pClamp 10记录通道电流。数据采集频率为20kHz，数字滤波为2kHz。串联电阻补偿设定为60～80％。电极由硼硅酸盐玻璃毛细管通过电极拉制仪拉制而成，充满内液后电阻为2～5MΩ。收集数据。

4.数据分析与处理：

本实验使用Clampfit 10.6软件处理电生理数据，并进一步使用GraphPad Prism6软件分析数据。量效曲线通过希尔方程f＝1/[1+(C/EC

三、实验结果分析：

结果显示，ML365是TWIK2通道的强效抑制剂。在野生型TWIK2(wtTWIK2)的C末端引入三个突变(I289A/L290A/Y308A)的TWIK2突变体(muTWIK2)增加了其在细胞膜上表达，从而在转染细胞中产生可检测的电流。发明人在转染的COS-7细胞中，将这三种突变引入到wtTWIK2后会使电流增加约14倍(如图2结果所示)，这使得进一步筛选TWIK2调节剂成为可能。发明人随后检测了ML365等K2P通道调节剂对muTWIK2通道的影响。在所检测的化合物中，仅ML365对muTWIK2表现出较强的抑制作用(如图3结果所示)，在10μM 浓度下的I/I

该结果彰显出ML365特有的特异性、强效性、选择性。因此可为今后K2P通道的研究，特别是TWIK亚家族提供强有效的工具化合物，并有希望为未来TWIK2通道抑制剂的先导化合物提供结构骨架。

实施例3 ML365抑制NLRP3炎症小体抑制作用的体外研究实验

一、实验材料：

ML365：由美国MCE公司提供；

重组小鼠M-CSF：由美国MCE公司提供；

DMEM培养基：由美国Thermo fisher公司提供；

胎牛血清FBS：由美国Thermo fisher公司提供；

磷酸盐缓冲液PBS：由美国Thermo fisher公司提供；

Nigericin：由法国InvivoGen公司提供

ATP：由美国Sigma公司提供；

二甲基亚砜(DMSO)：由美国Sigma公司提供；

LPS：由美国Sigma公司提供；

OPTI–MEM：由美国Thermo fisher公司提供；

三氯甲烷(氯仿)：由上海阿拉丁生化公司；

甲醇：由上海麦克林公司提供；

MCC950：由美国MCE公司提供；

RIPA裂解液：由上海碧云天公司提供；

蛋白酶抑制剂混合物：由江苏凯基公司；

磷酸酶抑制剂混合物：由江苏凯基公司；

Western一抗稀释液：由上海碧云天公司；

BCA蛋白定量试剂盒：由美国Thermo fisher公司提供；

PAGE凝胶速制备试剂盒：由上海雅酶公司提供；

PVDF膜：由瑞士Roche公司提供；

十二烷基硫酸钠SDS：由上海麦克林公司提供；

甘氨酸：上海麦克林公司提供；

TBS缓冲液粉末：由武汉博士德公司提供；

吐温20：由美国Sigma公司提供；

脱脂奶粉：由上海翊圣公司提供；

ECL发光液：由广州捷倍斯公司提供；

蛋白Marker：由美国Thermo fisher公司提供；

抗IL-1β抗体：由美国R&D Systems公司提供；

抗caspase-1抗体：由美国AdipoGen life science公司提供；

抗β-actin抗体：由上海爱必信公司提供；

抗TWIK2抗体：由美国Santa Cruz公司提供；

Mouse IL-1βuncoated ELISA试剂盒：由美国Thermo fisher公司提供；

二、溶液：同实施例2。

三、实验方法：

1.BMDM细胞的提取：超净台提前紫外消毒30min，准备原代器械和2个中皿，分别装有酒精和PBS；取6～8周龄的C57BL/6小鼠，颈动脉放血处死并经75％乙醇浸泡消毒后，无菌条件下分离后肢的股骨和胫骨；用手术刀剔除肌肉和相连组织后，将股骨和胫骨浸泡于酒精中，后转移至PBS中漂洗，再转移至DMEM中；用手术刀将两端骨骺剪断，暴露骨髓腔，用1mL注射器吸取DMEM冲洗骨髓至骨髓腔内面发白后，用移液枪吹吸培养液多次以产生单细胞悬液；用70μM滤网将细胞悬液过滤至新培养皿中，并将过滤后的细胞悬液转移至离心管中，1500rpm、离心10min，弃上清；用BMDM细胞的完全培养基(DMEM+10％FBS+1％双抗+20ng/mlM-CSF)重悬细胞沉淀并充分吹匀，将细胞按适宜密度接种于6孔板中，放入细胞培养箱培养；每2～3天换一次液，7天后得到成熟的BMDM细胞；

2.NLRP3炎症小体的活化及化合物调控：待BMDM细胞成熟后，弃掉旧培养基，加入OPTI-MEM培养基，并加入LPS(5μg/mL)预激，处理过夜；加入DMSO或相应浓度的ML365 处理2h。加入NLRP3的激动剂激活炎症小体(ATP,5mM,1h；nigericin,10μM,30min)；收集上清和细胞，分别提取蛋白，用于免疫印迹分析；

3.蛋白质免疫印迹实验：

(1)沉淀法制备上清蛋白样品：将收集的细胞培养上清13000rpm离心10min后收集离心管内上清液于新的离心管中；按500μL上清+500μL甲醇+150μl氯仿，涡旋混匀后13000rpm离心10min，吸掉上层有机溶剂层，注意不要碰到中间的蛋白层；加入800μL甲醇，涡旋混匀后13000rpm离心10min，倒掉上清液体并将离心管管口倒扣在吸水纸上吸干残留液体；室温敞口静置10min左右，待蛋白沉淀干燥后，加入1×loading buffer(用RIPA稀释) 重悬，100℃煮5min，-20℃保存备用；

(2)细胞蛋白样品制备：吸去培养液，用冰PBS洗细胞2次，将PBS全部吸走，每孔加入60μL含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，在冰上裂解30min后，用细胞刮刀将细胞充分刮下来，收集到1.5ml离心管中，4℃振荡1h后，4℃、13000rpm离心15 min，转移上清液至另一新的离心管中；

(3)蛋白定量：根据样品数配工作液(A液：B液＝50:1)，吸取6μL蛋白样品用PBS 稀释5倍，96孔板每孔加200μL工作液和25μL稀释的蛋白样品混匀，用吹风筒吹走气泡， 37℃孵育30min后，用酶标仪在570nm测吸光度，计算蛋白样品浓度，计算归一到相同蛋白量所需的样品量、RIPA裂解液、5×loading buffer，加于离心管内混匀，100℃煮5min，-20℃保存备用；

(4)制胶：用上海雅酶公司的PAGE凝胶快速制备试剂盒制备聚丙烯酰胺凝胶；

(5)上样：先在电泳模块中把配制好的聚丙烯酰胺凝胶固定完毕，再将电泳模块按电极指示放入电泳槽中，往其中倒满电泳缓冲液，垂直向上拔掉梳子。在两侧的泳道中加入蛋白 Marker，然后在加样孔中按顺序加入10μL相应蛋白样品；

(6)电泳：先以80V的恒定电压电泳20min，再把电压调至120V电泳60min左右；

(7)电转膜：剪取适当大小的PVDF膜放入甲醇中浸泡1min以活化，备用。待电泳完毕后取出凝胶，先小心剥掉其中的一块玻璃板，去掉上层的浓缩胶，将下层的分离胶玻璃另一块玻璃板，按以下顺序安装电转膜装置：负极夹板—海绵垫—三层滤纸—分离胶—PVDF膜—三层滤纸—海绵垫—正极夹板。安装好后，将电转膜装置按电极指示放入电泳槽中，往电泳槽中倒满转膜缓冲液，并在电泳槽内放入一块大小合适的冰袋，盖好盖子。电泳槽周围堆满冰块以形成低温环境防止温度过高。设定电压为100V，时间90min进行转膜；

(8)封闭：转膜完毕后将PVDF膜取出浸泡于封闭缓冲液中，放至摇床上室温缓慢振荡 60min；

(9)敷育、清洗一抗：提前按所需抗体浓度配好一抗稀释液。将PVDF膜取出浸泡于TBST中漂洗2-3次以将封闭液洗净，再把PVDF膜紧密铺于含一抗稀释液的离心管内壁上，置于4℃翻滚敷育过夜；将PVDF膜浸泡于TBST中在摇床上振荡清洗6次，每次5min；

(10)敷育、清洗二抗：提前按所需抗体浓度配制二抗稀释液，将PVDF膜紧密铺于含二抗稀释液的离心管内壁上，室温翻滚敷育1h；将PVDF膜浸泡于TBST中在摇床上振荡清洗6次，每次5min；

(11)化学显影：配制ECL化学发光液，用吸水纸将PVDF膜吸去多余水分后把PVDF膜蛋白面向上平铺于多功能成像分析仪的黑色塑料板上，将ECL化学发光液均匀滴加在PVDF膜表面，去除气泡，然后放入多功能成像分析仪中进行扫描得到图片。

4.酶联免疫吸附试验(ELISA)：

(1)确定本次检测所需的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔，总数＝样品数+9；做双份检测时×2。用蒸馏水将PBS(10×)稀释10倍配成Coating Buffer(1×)，再将Capture Antibody(1:250)稀释于1×的Coating Buffer中，用于包被ELISA的酶标板孔，每孔加100μL，将板密封置于4℃孵育过夜；

(2)倒掉孔内液体，每孔加入250μL Wash Buffer洗3次，每次浸泡1min，将板倒扣对着吸水纸拍打数次以除去残留液体；

(3)用蒸馏水将Dilute Diluent Concentrate(5X)稀释成ELISA/ELISPOTDiluent(1X)，每孔加入ELISA/ELISPOT Diluent(1X)200μL，置于室温孵育1h；

(4)准备标准品(1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL、7.8125pg/mL，用蒸馏水稀释)；

(5)倒掉孔内液体，用Wash Buffer洗1次，每孔分别加100μL对应的细胞培养上清样品或标准品。酶标板加上封板膜，室温孵育2h；

(6)将Detection Antibody(250×)、Streptavidin-HRP(250×)分别用ELISA/ELISPOT Diluent(1X)稀释成工作液；

(7)按(2)中的步骤洗板5次，将准备好的Detection Antibody按每孔100uL依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜，室温孵育1h；

(8)按(2)中的步骤洗板5次，将准备好的Streptavidin-HRP按每孔100uL依次加入。酶标板加上封板膜，37℃反应30min；

(9)按(2)中的步骤洗板5次，每孔加入100uL的1X TMB显色液，室温孵育15min；

(10)每孔100uL的Stop Solution，此时蓝色立转黄色；

(11)用酶标仪在450nm波长处测定OD值；

(12)绘制标准曲线，计算样品浓度。

四、实验结果分析：

结果显示，ML365阻断ATP诱导的NLRP3炎症小体的激活。如图9结果所示，ML365 剂量依赖性地抑制了BMDMs中ATP诱导的NLRP3炎性小体的活化，免疫印迹(WB)结果表明细胞上清中成熟的IL-1β和caspase-1表达水平有所降低(如图9中A所示)；酶联免疫吸附(ELISA)结果表明IL-1β的释放量显著降低(如图9中B所示)。在相同的上清液中， ML365对TNF-α的表达几乎无影响(如图9中C所示)。相比之下，ML365(即使是10和20 μM)对尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的NLRP3炎症小体激活没有影响(如图9中D、E、F 所示)。ML365对ATP或Nigericin诱导的NLRP3炎性小体的活化的影响也在人THP-1巨噬细胞中得到证实(如图10结果所示)。发明人接下来研究了ML365对ATP诱导的NLRP3炎症小体活化的特异性。发明人检测了ML365对非经典炎症小体的影响。数据显示，ML365 不抑制非经典炎症小体的活化(如图9中G所示)。此外，ML365不抑制AIM2或NLRC4 炎症小体诱导的IL-1β的产生(如图9中H、I所示)。这些结果表明，ML365特异性地抑制了ATP诱导的NLRP3炎症小体，这与TWIK2通道在NLRP3炎症小体中的重要作用一致。

实施例4 ML365抑制NLRP3炎症小体的分子机制研究

一、实验材料：

Lipofectamine RNAiMAX:由美国Thermo Fisher公司提供

其他：同实施例3

二、实验方法：

1.BMDM细胞的提取：同实施例3

2.转染siRNA:将BMDM细胞铺于6孔板中(每孔2.5×10

3.NLRP3炎症小体的活化及化合物调控：同实施例3

三、实验结果分析：

结果表明，TWIK2的缺乏可阻断ML365对ATP诱导的NLRP3炎症小体活化的抑制。为了检测ML365是否通过阻断TWIK2通道而抑制NLRP3炎症小体的活化，发明人使用小干扰RNA(siRNA)敲低了TWIK2通道(图11中A)。敲低TWIK2显著降低了ATP激活的 BMDMs中IL-1β的产生(图11中B、C)。此外，发明人发现，通过敲低TWIK2，ML365 对ATP诱导的NLRP3炎症小体活化的抑制作用极大减弱(图11中B、C)。这一结果进一步证实了ML365通过抑制TWIK2通道来阻断ATP诱导的NLRP3炎性小体的活化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。