一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体制备方法

摘要

本发明属于多克隆抗体制备技术领域，具体涉及分子克隆、抗体制备技术领域，具体涉及一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。本发明根据Genbank中Ptf1a基因设计具有高效扩增能力的特异性扩增Ptf1a基因的引物，制备出大小正确、纯度在85%左右的重组抗原蛋白，免疫日本大耳兔获得高效价抗血清，纯化得到浓度为10mg/ml，纯度为90%的特异性多克隆抗体，经WB检测与重组抗原在47kDa处有特异性识别，且条带单一，可以作为抗体用于WB检测鸡Ptf1a蛋白水平，为评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。

说明书

技术领域

本发明属于分子克隆、抗体制备技术领域，具体涉及一种鸡PTF1a（Pancreasassociated transcription factor 1a）基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。

背景技术

腺泡细胞来源于胰腺干细胞PTF1a的表达，PTF1a是bHLH转录因子，最初在胰腺祖细胞中表达，之后存在于腺泡中。缺乏PTF1a会导致腺泡细胞形成受阻，PTF1a基因突变小鼠的分析显示，PTF1a mRNA存在剂量阈值，该阈值使得胰腺的分化结果沿着指定的途径发育。PTF1a mRNA剂量的减少导致早期胰腺前体细胞增殖减少，外分泌细胞分化受损。

在斑马鱼中的研究表明，减少PTF1a表达会导致多能祖细胞分化形成内分泌部，而增加PTF1a表达使胰腺祖细胞分化形成腺泡的概率增加。因此，PTF1a可能具有双重作用，取决于其表达水平或活性。尽管在胰腺胚胎发育过程中积累了有关PTF1a功能和剂量的信息，但有关PTF1a在成熟胰腺中作用的认知仍然有限。PTF1a最初被发现是成熟腺泡细胞中淀粉酶和弹性蛋白酶等消化酶的转录调节因子。Krah等人研究表明成熟腺泡细胞中PTF1a的条件缺失导致导管化生，并使细胞对Kras转化高度敏感。最近的研究表明PTF1a在成熟腺泡中表达，诱导细胞周期抑制剂Cdkn1a（p21）的表达。因此，PTF1a的表达可能有助于改善成熟腺泡细胞的低增殖指数。但在家禽中，PTF1a基因鲜有报道。

因此，Ptf1a是评估胰腺腺泡细胞功能成熟的重要标志物，对家禽育种及饲料添加剂应用具有指导意义。转录因子Ptf1a在体内以蛋白质分子的形式影响胰腺外分泌发育和功能成熟，研究表明Ptf1a基因受miRNA转录后调控影响，应用RT-PCR法检测Ptf1a基因mRNA转录水平与组织中蛋白水平无相关性，需要使用抗体来检测其蛋白含量。当前市售Ptf1a抗体多为人，小鼠，大鼠等动物，且与鸡同源性较差无法使用。因此急需鸡源Ptf1a抗体来测定组织中转录因子水平，从而应用评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。

发明内容

针对目前在家禽研究领域中未有PTF1a基因相关研究的缺陷和问题，本发明提供一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体的制备及纯化方法。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种用于扩增鸡PTF1a基因的引物组，碱基序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.22所示。

本发明还提供一种鸡PTF1a基因重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.24。

本发明还提供一种鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：

步骤一、设计引物进行PCR扩增，以PET-B2M为载体，以NotI CpoI酶切位点进行载体与鸡PTF1a基因的连接得到重组质粒，并转化至感受态细胞中，将转化后的感受态细胞进行培养，选取阳性克隆抗体进行测序；

步骤二、将测序正确的阳性克隆接种于LB中扩大培养，挑选含重组质粒的单菌落进行培养，超声破碎菌体，离心收集上清和沉淀，获得包涵体蛋白；

步骤三、将将包涵体蛋白溶解、亲和纯化，测定重组蛋白纯度；

步骤四、将重组蛋白进行三次动物免疫，末次免疫后10d采集动物血清抗原，对抗原进行效价检测、抗体纯化并对抗原进行WB检测。

上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，步骤一中所用载体为pet-b2m，酶切位点为NotI CpoI，感受态细胞为TOP10，质粒提取试剂盒为Axygen，Pfu DNA polymerase为Life technology，T4 DNA连接酶为Fermentas。

上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，步骤一中PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环。

上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，所述抗体纯化是将获得的血清上样至预处理过的层析柱中，经洗杂、抗体洗脱、pH调节、样品浓缩、透析、层析柱洗涤进行纯化。

上述的鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，所述抗体洗脱使用0.1MPH3.0甘氨酸洗脱，收集洗脱物并用G250检测洗脱产物至不变蓝为止，反应60min。

本发明的有益效果：

1、本申请根据Genbank中Ptf1a基因CDS区序列设计具有高效扩增能力的特异性扩增Ptf1a基因的引物，制备出大小正确、纯度在85%左右的重组抗原蛋白，免疫日本大耳兔获得高效价抗血清，纯化得到浓度为10mg/ml，纯度为90%的特异性多克隆抗体，经WB检测与重组抗原在47kDa处有特异性识别，且条带单一，可以作为抗体用于WB检测鸡Ptf1a蛋白水平，为评估鸡胰腺外分泌发育情况，为鸡育种及功能性酶制剂添加提供参考。

2、PTF1A是成熟腺泡细胞中淀粉酶和弹性蛋白酶等消化酶的转录调节因子，对腺腺泡细胞增殖和外分泌部发育起着重要的作用。本发明得到了鸡PTF1A蛋白的多克隆抗体，为之后进一步研究家禽中PTF1A的功能打下了重要的基础。以PTF1A蛋白为标志物可检测饲料添加剂对鸡内源消化酶分泌的影响，并为酶制剂等饲料添加剂的开发使用提供理论支持。

附图说明

图1为本发明重组菌体蛋白经超声破损离心后SDS-PAGE检测电泳图；其中，泳道1为PTF1A-PET-B2M大小47KD的重组蛋白上清液；泳道2为PTF1A-PET-B2M大小47KD的重组蛋白沉淀；泳道3为Marker：116/66.2/45/35/25/18.4/14.5（kDa）。

图2为包涵体蛋白纯化以6M盐酸胍重悬、溶解、离心后上清液SDS-PAGE电泳检测图；其中，泳道1为Marker：116/66.2/45/35/25/18.4/14.5 （kDa）；泳道2为PTF1A-PET-B2M大小47KD经10倍稀释的纯化抗原。

图3为用稀释液将血清按 1:2000,1:4000,1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000......进行倍比稀释（空白血清同比稀释做阴性对照），ELISA反应后酶标仪测定450nm 处各孔k的吸光值检测图；其中，图3A兔子编号为G1343，血清滴度512K，OD抗血清/OD免前血≥2.1；图3B兔子编号为G1344，血清滴度1024K，OD抗血清/OD免前血≥2.1。

图4为兔G1343/G1344抗体纯化SDS-PAGE电泳检测图；其中，泳道1为兔G1344纯化抗体经4倍稀释；泳道2为兔G1343纯化抗体经4倍稀释；泳道M为Marker: 116/66.2/45/35/25/18.4/14.5 (kDa)，剂量为5ul，浓度为0.1mg/ml。

图5为纯化抗原与重组抗原Western blot检测图。其中，M泳道为Marker: 250/150/100/70/50/40/35/25/20/15 (kDa)；泳道1为重组蛋白PTF1A 50ng，免前抗体2ug/ml孵育；泳道2为重组蛋白PTF1A 50ng，抗体G1343 2ug/ml孵育；泳道3为重组蛋白PTF1A 50ng，抗体G1344 2ug/ml孵育。二抗为羊抗兔 IgG(H+L)-HRP（1:10000）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：本实施例提供一种鸡PTF1a基因多克隆抗体制备方法，该方法包括基因合成、抗原纯化、动物免疫、效价检测、抗体纯化和验证，具体如下。

一、合成鸡PTF1a基因

1、基因的扩增、与载体的酶切及连接

根据Genbank中Ptf1a基因CDS区序列设计具有高效扩增能力的特异性扩增Ptf1a基因的引物，引物序列如SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.22所示，即表1中的编号1-22，碱基序列具体见表1。

Ptf1a基因序列为：

ATGGAGACGGTGCTGCTGGAGCACTTCCCCGCGGGGCTGGACTCCTTCTCCTCGCCGCCCTACTTCGACGAGGAGGACTTCTTCCCCGAGCCGCCCCCGCGGGAGGCGCTGGGCGCCGACGGGCTGCCGGAGCCCGACGTGGACTTCCTCGGGCGGCAGCTGCACGAGTACTACCGCGACGGCGGGGACCCCGACGGCGGCTATTGCTGCGAGGCGGCGGCCGCCGCCTTCCCGCCGTCTCCCGCCTCGCCCGGCTTCGCCTACGAGTGCTGCGGGGCGGCGGGCGCGGGGCTGCTGTCGCCGGGGGGGCGGCTCCGGGCGCTGGGCTCGGCCAAGCGGCGGCGGCGGGAGCGTTCCGAGGCGGAGCTGCAGCAGCTGCGGCAGGCGGCCAACGTGCGGGAGCGCCGGCGGATGCAGTCCATCAACGACGCCTTCGAGGGGCTGCGCTCGCACATCCCCACGCTGCCCTACGAAAAGCGGCTCTCCAAGGTGGACACGCTGCGCCTCGCTATCGGCTACATCAACTTCCTCAGCGAGCTGGTGCGCTCCGACCTGCCGCTGCGCAACGCCGGCGGGGACGGCCCCAGCCAGCCCAAGAAAATCATCATCTGCCACCGCGGCACAAGATCTCCCTCCCCGAGCGACCCCGACTACGGCCTCCCCCCGCTGGCCGGCCACTCGCTGTCGTGGACTGACGAGAAGCAGCTCAAGGAGCAAAACGTCATCCGGACGGCCAAGGTGTGGACCCCCGAGGACCCGCGGAAGGCGAACGCCAAACCCTCGCTCAGCGACATCGAGAACGAACCCCCCCTCGGCTTCGTGCCGTGA（SEQ ID NO.23）。

应用50ng PET-B2M载体与150ngPtf1a基因，加2μl 10*T4 DNA Ligase buffer，1μl T4 DNA Ligase，补去离子水至20μl，16℃， 30min，进行PET-B2M载体与PTF1a基因的连接，得到PTF1A-PET-B2M。

、转化

a、将DNA片段加入到装有TOP10感受态细胞的管中（50 μl 感受态细胞需要 25ngDNA），体积不超过感受态细胞的 5%，轻轻旋转几次混匀内容物，冰浴 30min；

b、将离心管混合物放入加温至 42℃的循环水中，热激 90s，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 1～2 min；

c、每管加入 200μl SOC 液体培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将管转移到设置为 37℃ 的摇床上，220 rpm 培养 45 min，使细胞复苏并表达质粒编码的抗性标记基因；

d、将适当体积（每个 90 mm 平板达 200μl）已转化的感受态细胞转移到含有相应抗生素的 LB 培养基上；

e、倒置平板，于 37℃培养，12～16 小时后出现菌斑。

、测序检测

将阳性克隆送金开瑞测序平台测序验证。

（1）PCR扩增PTF1a片段的引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示，扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环。

质粒提取试剂盒为Axygen，Pfu DNA polymerase为Life technology，T4 DNA连接酶为Fermentas。

二、蛋白表达及纯化

1、蛋白大量表达及破菌检测

a、将测序鉴定正确的重组质粒转化表达宿主；挑选含重组质粒的单菌落至3 mLLB液体培养基（含抗生素）中，37℃震荡扩大培养至2000 mL，OD600约0.6，降低培养温度到30℃。

b、加入IPTG诱导剂至终浓度0.5 mM，30 ℃继续震荡培养4 h，8000 rpm离心3 min收集菌体，重悬于50 mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30 min。

c、超声破碎菌体，参数设置为功率200 W、工作3 s、暂停4 s、时间25-30min，16000rpm 4 ℃离心50 min，收集上清以及沉淀；超声破碎仪购自宁波新芝生物科技股份有限公司，型号为JY 92-IIN。重悬包涵体的盐酸胍抗原缓冲液购自国药集团化学试剂有限公司，型号30095563。

d、取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，电泳图见图1，图中，泳道1为PTF1A-PET-B2M大小47KD的重组蛋白上清液；泳道2为PTF1A-PET-B2M大小47KD的重组蛋白沉淀；泳道3为Marker：116/66.2/45/35/25/18.4/14.5 （kDa），剩余上清及沉淀置于4 ℃备用。

2、包涵体蛋白纯化

a、将沉淀以50 mL STET缓冲液重悬，加入DTT至终浓度1 mM，超声促进杂蛋白溶解，参数设置为功率200 W、工作3 s、暂停3 s、时间10 min，10000 rpm 4 ℃离心10 min，去上清；

b、重复以上步骤至上清透明；

c、沉淀以1XPBS重悬，超声，参数设置为功率200 W、工作3 s、暂停3 s、时间5 min，16000 rpm 4 ℃离心10 min，去上清；

d、以4 mL 6M盐酸胍重悬包涵体，加DTT至终浓度5 mM，220 rpm 37 ℃震荡3 h至包涵体全部溶解，10000 rpm 4 ℃离心10 min取上清；

3、蛋白亲和纯化

a、蛋白溶液用0.22 µm过滤器过滤备用，准备Ni-NTA柱，以1 mL/min的流速上样蛋白溶液；

b、以6M盐酸胍缓冲液（pH8.0）洗柱至流出液不含蛋白（G250检测液不变色）；

c、分别以含20 mM、60 mM、200 mM和500 mM咪唑的洗脱液洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；

d、以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20%乙醇封柱， 4 ℃超滤浓缩产物，取10ul进行SDS-PAGE电泳检测，电泳图见图2，其中，泳道1为Marker：116/66.2/45/35/25/18.4/14.5 （kDa）；泳道2为PTF1A-PET-B2M大小47KD经10倍稀释的纯化抗原。

三、动物免疫

选取两只4月龄日本大耳兔，兔子编号分别为G1343和G1344。用无菌真空采血管从耳静脉采集5mL免疫前血液，作为免疫开始前的对照。1周后，以纯化后的PTF1a-PET-B2M为抗原与弗氏完全佐剂（购自sigma公司，型号为SA-F5881-10X10ML）按1:1（v/v）比例混合，皮下注射1.0ml，浓度为0.5mg/ml。每2周注射一次纯化蛋白，共3次，末次免疫后10天采血。采集的血液在室温下保持约2小时，然后在20℃下以6000 rpm离心15分钟，分离血清，置于-20℃保存。

四、效价检测

1、抗原包被、洗涤、封闭

用包被液稀释抗原到 2ug/ml，100μL/孔加入96 孔酶标反应板中，4℃过夜包被，次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次，加 200μL/孔封闭液，37℃温育 2h，用洗涤液洗3次。

2、加待测样品（一抗）

加入抗血清（取血 4℃ 4000rmp 离心10min 取上清），用稀释液将血清按 1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000......进行倍比稀释（空白血清同比稀释做阴性对照），每孔 100ul，37℃孵育1h，用洗涤液洗 3 次。

3、加酶标抗抗体

加入 HRP 标记IgG二抗，100µl /孔，37℃孵育 40min。（羊抗小鼠-HRP 1：5000-1：10000，羊抗兔-HRP 1：5000-1：10000），用洗涤液洗 5 次后拍干；

4、显色、终止反应、比色

加新鲜配制的底物溶液 100μL/孔，37℃遮光放置 5-20min，加 50μL/孔终止液，颜色变黄，用酶标仪测定 450nm 处各孔的吸光值。

ELISA测定结果见图3，其中：A兔子编号为G1343，血清滴度512K，OD抗血清/OD免前血≥2.1；B兔子编号为G1344，血清滴度1024K，OD抗血清/OD免前血≥2.1。

可知，两只兔子血清效价超过1:50K，可以进行下一步纯化。

5、抗体纯化及WB验证

（1）抗体纯化

抗体纯化所用快速蛋白纯化系统，型号为AKTA Purifier UPC 100，GEHealthcare；

A、层析柱预处理：10倍柱床体积的去离子水冲洗3-5遍，流速1ml/min，10倍柱体积的0.02M PB+0.3M NaCl 冲洗3-5遍，流速1ml/min；

B、样品上样：取4ml动物免疫获得的抗血清，用0.02M PB 稀释后，0.22um滤器过滤后上柱，调整流速为5-7s/滴，0.02M PB冲洗至检测（G250不变蓝）无蛋白流出为止，流速2s/滴；

C、抗体洗脱H：0.1M pH=3.0甘氨酸以3-5s/滴过柱洗脱，收集洗脱物并用G250检测洗脱产物至不变蓝为止，饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性；

D、超滤浓缩与透析：10kDa超滤管，超滤浓缩至1-3ml左右，5L，0.01M pH=7.4 PBS透析过夜，第二天换液1次后再透析4-6h左右后跑SDS胶并测定抗体浓度后装入标记好EP管，保存于-20℃。纯化后SDS试验检测结果见图4，两支抗体纯化浓度为10mg/ml，纯度为90%以上。

（2）WB实验验证特异性

以2ug/ml比例稀释抗体与重组抗原WB杂交印记实验，验证抗体特异性，具体见图5的纯化抗原与重组抗原Western blot检测图；图中，M泳道为Marker: 250/150/100/70/50/40/35/25/20/15 (kDa)；泳道1为重组蛋白PTF1A 50ng，免前抗体2ug/ml孵育；泳道2为重组蛋白PTF1A 50ng，抗体G1343 2ug/ml孵育；泳道3为重组蛋白PTF1A 50ng，抗体G1344 2ug/ml孵育。二抗为羊抗兔 IgG(H+L)-HRP（1:10000）。

结果显示在约47kDa处有特异性识别，与预期信号相符，且条带单一。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鸡PTF1a基因重组蛋白、多克隆抗体制备方法

<141> 2021-03-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagacgg tgctgctgga gcacttcccc gcggggctgg actccttctc ctcgccgccc 60

tacttcgacg aggaggactt cttccccgag ccgcccccgc gggaggcgct gggcgccgac 120

gggctgccgg agcccgacgt ggacttcctc gggcggcagc tgcacgagta ctaccgcgac 180

ggcggggacc ccgacggcgg ctattgctgc gaggcggcgg ccgccgcctt cccgccgtct 240

cccgcctcgc ccggcttcgc ctacgagtgc tgcggggcgg cgggcgcggg gctgctgtcg 300

ccgggggggc ggctccgggc gctgggctcg gccaagcggc ggcggcggga gcgttccgag 360

gcggagctgc agcagctgcg gcaggcggcc aacgtgcggg agcgccggcg gatgcagtcc 420

atcaacgacg ccttcgaggg gctgcgctcg cacatcccca cgctgcccta cgaaaagcgg 480

ctctccaagg tggacacgct gcgcctcgct atcggctaca tcaacttcct cagcgagctg 540

gtgcgctccg acctgccgct gcgcaacgcc ggcggggacg gccccagcca gcccaagaaa 600

atcatcatct gccaccgcgg cacaagatct ccctccccga gcgaccccga ctacggcctc 660

cccccgctgg ccggccactc gctgtcgtgg actgacgaga agcagctcaa ggagcaaaac 720

gtcatccgga cggccaaggt gtggaccccc gaggacccgc ggaaggcgaa cgccaaaccc 780

tcgctcagcg acatcgagaa cgaacccccc ctcggcttcg tgccgtga 828

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Thr Val Leu Leu Glu His Phe Pro Ala Gly Leu Asp Ser Phe

1 5 10 15

Ser Ser Pro Pro Tyr Phe Asp Glu Glu Asp Phe Phe Pro Glu Pro Pro

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Leu Gly Ala Asp Gly Leu Pro Glu Pro Asp Val Asp

35 40 45

Phe Leu Gly Arg Gln Leu His Glu Tyr Tyr Arg Asp Gly Gly Asp Pro

50 55 60

Asp Gly Gly Tyr Cys Cys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Phe Pro Pro Ser

65 70 75 80

Pro Ala Ser Pro Gly Phe Ala Tyr Glu Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala

85 90 95

Gly Leu Leu Ser Pro Gly Gly Arg Leu Arg Ala Leu Gly Ser Ala Lys

100 105 110

Arg Arg Arg Arg Glu Arg Ser Glu Ala Glu Leu Gln Gln Leu Arg Gln

115 120 125

Ala Ala Asn Val Arg Glu Arg Arg Arg Met Gln Ser Ile Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Glu Gly Leu Arg Ser His Ile Pro Thr Leu Pro Tyr Glu Lys Arg

145 150 155 160

Leu Ser Lys Val Asp Thr Leu Arg Leu Ala Ile Gly Tyr Ile Asn Phe

165 170 175

Leu Ser Glu Leu Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu Arg Asn Ala Gly Gly

180 185 190

Asp Gly Pro Ser Gln Pro Lys Lys Ile Ile Ile Cys His Arg Gly Thr

195 200 205

Arg Ser Pro Ser Pro Ser Asp Pro Asp Tyr Gly Leu Pro Pro Leu Ala

210 215 220

Gly His Ser Leu Ser Trp Thr Asp Glu Lys Gln Leu Lys Glu Gln Asn

225 230 235 240

Val Ile Arg Thr Ala Lys Val Trp Thr Pro Glu Asp Pro Arg Lys Ala

245 250 255

Asn Ala Lys Pro Ser Leu Ser Asp Ile Glu Asn Glu Pro Pro Leu Gly

260 265 270

Phe Val Pro

275