多基因联合在制备预测AML预后试剂盒中的应用

摘要

本发明提供了多基因联合在制备预测AML预后试剂盒中的应用。所述的基因包括LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25，是基于本发明的发明人首次发现AML患者骨髓中LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的联合表达计算的风险分数与AML患者的预后相关。当风险分数比例高时，表明AML患者临床预后差的可能性较大。LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的联合表达计算的风险分数对于AML患者的预后判断具有重要的指导意义，本发明可为AML患者的危险分层及个性化管理提供更多的临床预后研究资料，在预测AML患者预后评价和危险分层及个性化管理方面具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及LOC541471/GDAP1/SOD1/STK25在制备预测AML预后试剂盒中的应用。

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一种异质性恶性疾病，预后差异很大，并与多种细胞遗传、分子和表观遗传异常有关。最近的研究表明，表观遗传变化在AML的发病机理中起着至关重要的作用。此外，长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作为表观遗传调控的参与者，在白血病发生过程中也占据着不可或缺的位置，并提供了重要的AML预后信息。LncRNA是一组长度超过200个核苷酸的非编码RNA，其编码蛋白质的能力有限或没有能力，占整个基因组转录本的80％以上。近年来，研究发现lncRNA在不同的癌症类型中异常表达，并且与不同的疾病进程密切相关。已经鉴定出许多lncRNA，例如HOTAIRM1，FOXP4-AS1和LOC646762，可作为AML的预后生物标志物。目前，基于细胞遗传学、基因突变可以将AML患者分为低、中和高危组，对管理AML患者和选择合适的治疗策略从而提高患者的临床结局具有重要意义。但是目前的危险分层也不能对所有患者都能进行分层，并根据这个危险分层进行相应的治疗后也不能让所有患者受益。据报道，AML患者的5年生存率不到50％，特别是60岁以上患者5年生存率不到20％。同时，40％到50％的病人属于中危组而无法进一步危险分层。因此需要探索更多的标志物来对AML进行危险分层及更好地进行精确及个性化管理。

发明内容

本发明是基于目前存在的技术问题而提出的新的解决方案。本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供多基因联合在制备预测AML预后试剂盒中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种预测AML预后的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

多基因联合在制备预测AML预后试剂盒中的应用，所述的基因包括LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25，是基于本发明的发明人首次发现AML患者骨髓中LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的表达情况与AML患者的预后相关。其中，LOC541471是一种非编码RNA，在GenBank中的登录号为NR_136162.1，GDAP1是指神经节苷脂诱导分化相关蛋白1基因，在GenBank中的登录号为NM_001040875.4，SOD1是指超氧化物歧化酶1基因，在GenBank中的登录号为NM_000454.5，STK25是指丝氨酸/苏氨酸激酶25基因，在GenBank中的登录号为NM_001271978.2。

所述的应用包括如下步骤：

S1、检测临床患者的骨髓中LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的基因表达量，结合内参基因18SrRNA的表达量，进行统计学分析，得到基因的表达水平；其中，所述的统计学分析方法为ΔΔCT法，基因的表达水平＝2^(-ΔΔCT)，ΔΔCT＝ΔCT

S2、由LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的基因表达水平计算风险分数，所述的风险分数＝0.034×(LOC541471的表达水平)+0.205×(GDAP1的表达水平)+0.007×(SOD1的表达水平)+0.049×(STK25的表达水平)；

S3、通过风险分数预测AML预后：

①当风险分数>1.9时，AML患者临床预后差的可能性较大；

②当风险分数为1.3～1.9时，AML患者临床预后差的可能性相对较大；

③当当风险分数<1.3时，AML患者临床预后好的可能性较大。

一种预测AML预后的试剂盒，包括用于扩增LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的引物；其中：

所述的用于扩增LOC541471的引物如下：

LOC541471(F):5'-ATGTCGGGAGAGGAAGTGGT-3'

LOC541471(R):5'-CTTCCCAGGAACTGTGCTGT-3'；

所述的用于扩增GDAP1的引物如下：

GDAP1(F):5'-ATGCGTTTGAACTCAACTGGA-3'

GDAP1(R):5'-TCAGGCATTAACCTGGGTGTT-3'；

所述的用于扩增SOD1的引物如下：

SOD1(F):5'-GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG-3'

SOD1(R):5'-CCACAAGCCAAACGACTTCC-3'

所述的用于扩增STK25的引物如下：

STK25(F):5'-CTCCGGGGATTTGCCAACC-3'

STK25(R):5'-TAGGTAGGAGCCAAAGTAGCG-3'

所述的试剂盒还包括如下用于扩增内参18SrRNA的引物:

18SrRNA(F):5'-CCTGCTGCCTTCCTTGGATGTG-3'

18SrRNA(R):5'-CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGA-3'

所述的试剂盒还包括用于分离骨髓单个核细胞的试剂、用于总RNA提取试剂、用于逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂、用于实时定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)试剂。

所述的用于分离骨髓单个核细胞的试剂优选为淋巴细胞分离液(Ficoll)。

所述的用于总RNA提取试剂优选为TRIZOL。

一种利用上述试剂盒非诊断检测LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25表达的方法，包括如下步骤：

(1)处理待测骨髓样本，得到单个核细胞；具体来说，将待测骨髓样本依据常规方法处理，分离得到单个核细胞；

(2)在步骤(1)得到的单个核细胞中加入TRIZOL试剂，混匀；

(3)加入氯仿，混匀后进行离心；

(4)吸取上层液体，加入异丙醇后离心去上清；

(5)乙醇洗涤，离心去上清，干燥，得到RNA样品；

(6)加入超净水混匀后，于紫外分光光度仪中加测样品A260/A280，得到纯度和含量；

(7)将步骤(6)得到的RNA逆转录成cDNA，加入超净水稀释；

(8)在步骤(7)得到的cDNA，根据所述的预测AML预后的试剂盒进行基因表达量检测；

所述的单个核细胞、TRIZOL试剂、氯仿的配比优选按5×10

步骤(3)中所述的离心的条件优选2-8℃、12000g，离心15-30分钟。

步骤(4)中所述的异丙醇的用量优选按上层液体：异丙醇＝体积比1～2:1～2计算；优选按1:1计算。

步骤(4)中所述的离心的条件优选2-8℃、12000g，离心10-20分钟。

步骤(5)中所述的乙醇洗涤，第一次优选用75％乙醇在-20℃条件下洗涤，第二次优选用100％乙醇在-20℃条件下洗涤，每次离心5-10分钟。

步骤(5)中所述的干燥优选为真空离心机干燥；条件优选为温度2～8℃、时间5～10分钟。

步骤(6)中所述的A260/A280优选为1.8～2.0，浓度优选为300～500微克/毫升。

步骤(7)中所述的逆转录通过RT-PCR实现；所述的RT-PCR体系优选为20微升，加入超净水优选为40微升。

步骤(8)中所述的检测体系优选为20微升。

所述的方法和应用为非诊断用途。

本发明的发明人首次对联合应用LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25预测AML患者的预后这一技术空白进行了研究探讨，以期提供更为有效的评价AML患者临床预后的实验室指标。因此本发明结合临床资料，创新地联合LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25对AML患者的预后进行预测，可为AML的危险分层及更好地进行精确及个性化管理提供更多的科学理论。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明人首次发现在AML中，LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的联合可作为AML患者的预后指标之一，对于AML患者的预后判断和危险分层的制定具有重要的指导意义。

2.本发明提供了LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的检测方法，通过该检测方法可将LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25定量统计，在预测AML患者临床预后方面具有广阔的前景，可为AML的危险分层及个性化管理提供更多的基础研究资料。

附图说明

图1是LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的联合对AML初发患者预后的影响分析图。

图2是患者的不同治疗方法对LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的联合预测AML患者预后的影响分析图。

图3是单独的LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的表达水平对AML初发患者预后的影响分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂信息具体如下：

Ficoll提取单个核细胞(购自GE Healthcare Life Sciences)；

TRIZOL提取RNA(购自Invitrogen)；

逆转录PCR试剂盒(购自Promega)；

实时定量PCR试剂盒(购自TIANGEN)。

实施例1

(1)在与患者签署知情同意书的前提下采骨髓。收集52例初发AML及12例健康成人骨髓样本，该部分研究方案已经获得本单位伦理委员会通过。同时收集AML患者生存时间和生存状态等临床资料(如表1所示)。

(2)分离骨髓中单个核细胞。取淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077)4mL加入15mL离心管内，将稀释后的抗凝骨髓标本混悬液平铺于分离液之上，以水平离心机于1500rpm离心15分钟。吸取中间单个核层转移至另一15mL离心管中，再加入适量1×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)，轻轻吹打，以1000rpm离心洗涤10分钟，弃上清，加入1×PBS液至2mL，混匀后计数，并用同样的方法洗涤两次，按5-10×10

(3)总RNA提取

3.1置于冰上，5分钟后，加入氯仿0.2毫升，充分混匀(15秒)后置冰上2-3分钟，低温高速(2-8℃，12000g)离心15-30分钟；

3.2小心吸取上层液体(约占总体积50％)移至1.5毫升新管中，加入0.5毫升异丙醇并混匀，冰上放置10分钟后低温高速离心10-20分钟；

3.3去上清并用1毫升75％乙醇(-20℃)洗涤两次(2-8℃，10000g)，每次均混匀30秒后，离心5-10分钟；

3.4去上清，再离心一次，去除剩余的乙醇；

3.5于低温真空离心机中干燥5-10分钟；

3.6加入超净水(Biotecx BL-5700)50微升(视情况可适当增加或减少)混匀。

3.7取2微升RNA溶液稀释至400微升，于紫外线分光光度仪中检测样品在A260nm波长的光密度估计样品的纯度和含量(1OD

3.8RNA样品加入0.1容积(5微升)的3M NaAC(醋酸钠)和2倍容积的乙醇(100微升)后，保存于-70℃备用。

(4)RT-PCR

4.1将500ng RNA，0.5μl oligo(dT)(0.5μg/反应)，0.5μl随机引物(0.5μg/反应)和不加RNase的双蒸馏水(ddH

4.2加入4.0微升GoScript

4.3混合后，将20微升样品在42℃孵育60分钟，然后在70℃灭活15分钟；

4.4加入80微升ddH

(5)qRT-PCR

5.1qRT-PCR的20微升体系配制为：Mix 10微升，0.5微升正向引物(10μM)，0.5微升反向引物(10μM)，1微升cDNA和8μl ddH

其中，所用引物的序列如下：

LOC541471(F):5'-ATGTCGGGAGAGGAAGTGGT-3'

LOC541471(R):5'-CTTCCCAGGAACTGTGCTGT-3'

GDAP1(F):5'-ATGCGTTTGAACTCAACTGGA-3'

GDAP1(R):5'-TCAGGCATTAACCTGGGTGTT-3'

SOD1(F):5'-GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG-3'

SOD1(R):5'-CCACAAGCCAAACGACTTCC-3'

STK25(F):5'-CTCCGGGGATTTGCCAACC-3'

STK25(R):5'-TAGGTAGGAGCCAAAGTAGCG-3'

内参引物:

18SrRNA(F):5'-CCTGCTGCCTTCCTTGGATGTG-3'

18SrRNA(R):5'-CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGA-3'

5.2qRT-PCR的程序设置如下：95℃15分钟，然后在95℃10s和60℃20s进行45个循环；

5.3基因表达量的展示为2^(-ΔΔCT)。

对qRT-PCR测定得到的基因表达量CT

ΔCT

ΔCT

ΔCT

ΔCT

ΔΔCT＝ΔCT

(6)将LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的表达情况结合AML患者临床预后资料进行分析(表1)，用R语言软件(4.0.2版,https://www.r-project.org/)中的“survival”语言包获取LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的多因素COX回归模型的系数，分别为0.034、0.205、0.007和0.049。然后，计算风险分数＝0.034×(LOC541471的表达水平)+0.205×(GDAP1的表达水平)+0.007×(SOD1的表达水平)+0.049×(STK25的表达水平)。用X-tile软件(3.6.1版,耶鲁大学)获取风险分数的最佳预后截断值1.3和1.9。当风险分数>1.9和风险分数为1.3～1.9时，AML患者的预后差(4年总体生存率分别为：24％：50％：67％，P＝0.001，图1)。为了进一步明确患者的不同治疗方法是否对该预测方法有影响，我们将AML患者的治疗方案与风险分数进行结合来绘制生存曲线，结果显示，AML患者的不同治疗方案不会对该预测方法产生影响(P<0.001,图2)。上述实验结果表明通过LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的联合在预测AML临床预后的评估中具有重要意义，其为临床AML的危险分层及个性化管理提供预后研究资料。

同时我们也分别将LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的表达情况结合AML患者临床预后资料进行分析。用X-tile软件(3.6.1版,耶鲁大学)获取LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25的最佳预后截断值，分别为8.11、12.64、26.11和118.60。当LOC541471的表达水平>8.11时，AML患者的预后差(4年总体生存率分别为：0％：59％，P<0.001，图3A)。当GDAP1的表达水平>12.64时，AML患者的预后差(4年总体生存率分别为：0％：56％，P<0.001，图3B)。当SOD1的表达水平>26.11时，AML患者的预后差(4年总体生存率分别为：0％：54％，P<0.001，图3C)。当STK25的表达水平>118.60时，AML患者的预后差(4年总体生存率分别为：0％：54％，P<0.001，图3D)。然而，LOC541471、GDAP1、SOD1或STK25的单独预测作用只能将一小部分的AML患者划分为高危的患者，比例分别为19％、15％、12％和12％。但是，联合LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25能够将患者更加合理地进行危险分层，低、中和高危患者的比例分别为48％、12％和40％。由以上结果可知，联合LOC541471、GDAP1、SOD1和STK25更能准确和合理地预测AML患者的预后。

表1 AML患者临床资料

注：HSCT:造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation).

从上述测得的基因表达水平虽然不能直接得出将来诊断结果和健康状况，但其作为中间结果，可以作为患者临床治疗方案制定的参考信息之一。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 多基因联合在制备预测AML预后试剂盒中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LOC541471 (F)

<400> 1

atgtcgggag aggaagtggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LOC541471 (R)

<400> 2

cttcccagga actgtgctgt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GDAP1 (F)

<400> 3

atgcgtttga actcaactgg a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GDAP1 (R)

<400> 4

tcaggcatta acctgggtgt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOD1 (F)

<400> 5

ggtgggccaa aggatgaaga g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOD1 (R)

<400> 6

ccacaagcca aacgacttcc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> STK25 (F)

<400> 7

ctccggggat ttgccaacc 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> STK25 (R)

<400> 8

taggtaggag ccaaagtagc g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18SrRNA (F)

<400> 9

cctgctgcct tccttggatg tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18SrRNA (R)

<400> 10

cggcggcttt ggtgactcta ga 22