一种法匹拉韦光降解产物的分析检测方法

摘要

本发明提供了一种检测法匹拉韦样品中光降解产物的方法，其特征在于，采用HILIC色谱柱对法匹拉韦样品进行高效液相色谱分析。本发明与已有技术相比的积极效果在于，本发明中光降解产物能得到适当保留，且其与主成分及相关杂质分离程度良好。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种法匹拉韦光降解杂质的分析检测方法。

背景技术

法匹拉韦(Favipiravir，商品名AVIGAN)是一种核苷类广谱抗病毒药物，其作用机理至今尚未完全清楚，目前主要认为作用机制是该药口服吸收后被宿主细胞酶磷酸核糖转化为具有生物活性的法匹拉韦呋喃核糖基-5’-三磷酸肌醇(法匹拉韦RTP)，能与嘌呤竞争病毒RNA聚合酶，还可插入到病毒RNA链中，从而阻碍病毒RNA链的复制和转录。故从机理上可认为法匹拉韦对各类RNA病毒均具有潜在的抗病毒能力。

该药最早由日本富山化工制药有限公司开发，2014年3月在日本批准上市，用于治疗新型或复发流行性感冒。目前已有研究表明其针对其他多种RNA病毒，例如埃博拉病毒、出血热、布尼亚病毒等均有很好的抗病毒作用。2020年2月15日，法匹拉韦片在我国获批上市，适应症为治疗成人新型或再次流行流感，仅限于其他抗流感病毒药物治疗无效或效果不佳时使用，并获得《药物临床试验批件》以开展以新型冠状病毒肺炎(COVID-19)为适应症的临床研究，允许临床在现阶段小范围内给药治疗COVID-19。在全球范围内，日本、美国、意大利等多个国家也启动了法匹拉韦相关的临床试验。

法匹拉韦结构式如下所示：

可能的降解产物可通过破坏性试验和稳定性试验进行评估。我们在研发阶段进行强制降解研究时发现法匹拉韦在光照条件下含量会降低，但现有的HPLC方法检测杂质时无法观测到光降解产物。说明现有的杂质方法漏检了光降解产物，如没有方法可对其进行检测无疑会对产品的研发进度及质量控制产生影响。

发明内容

通过一系列的方法摸索，我们发现法匹拉韦的光降解杂质极性很强，在普通反向色谱中均没有保留，故本发明转而开发正相方法对其进行分析。亲水作用色谱模式属于一种正相色谱的变体，与其他分离模式相比，在分离极性和亲水性物质方面具有极大的优势，且可与多种检测器兼容，流动相配制简单，分析效率高，重现性佳。

因此本发明的目的在于提供一种法匹拉韦光降解产物的分析检测方法；

本发明采取的技术方案如下：

将法匹拉韦或法匹拉韦相关的制剂适量溶解于稀释液制备成供试品溶液，对供试品溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，其中色谱柱为HILIC色谱柱。

进一步的，所述HILIC色谱柱选自酰胺键合固定相或硅胶柱。优选柱温为15～40℃，进一步优选为30℃。

进一步的，所述高效液相色谱分析条件中流动相由有机溶剂-水混合组成，优选为乙腈-缓冲水溶液体系组成；进一步优选流动相中乙腈质量浓度范围选自40％-97％，更进一步优选为95％。所述流动相中缓冲水溶液体系选自甲酸胺缓冲盐体系、乙酸铵缓冲盐体系、甲酸水溶液体系或乙酸水溶液体系。缓冲水溶液体系的pH范围为2.0-3.0，优选为3.0。所述流动相流速范围为0.3-2mL/min，优选为0.5-1.0mL/min。

进一步的，所述方法中稀释液为乙腈或乙腈占比≥50％的乙腈和水的混合物，更进一步优选为100％乙腈。

进一步的，所述高效液相色谱的条件中，检测器选择二极管阵列检测器或紫外检测器，当选择二极管阵列检测器时，可选择波长190-400nm，波长扫描也可设置检测波长为230nm；选择紫外检测器时设置检测波长为230nm。

进一步的，所述高效液相色谱的条件中，检测进样量范围为5-80μL，优选为30μL。

进一步的，所述高效液相色谱的条件中，柱温：15～40℃

本发明优选的色谱检测方法如下：

(1)供试品溶液制备：将适量经光照破坏的法匹拉韦样品溶解于稀释液中以制备供试品溶液；

(2)测定方法：将步骤(1)中制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，并按照上述的色谱条件对供试品溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图。

进一步的所述步骤(1)中样品为法匹拉韦或法匹拉韦相关制剂或法匹拉韦与相关制剂辅料混合后的混合样品。

进一步的所述步骤(1)中光照破坏的条件为累积光照达到白光1.2×106Lux·hr、紫光200w·hr/m2。

本发明与已有技术相比的积极效果在于，本发明中光降解产物能得到适当保留，且其与主成分及相关杂质分离程度良好，分析时间短，检测高效且色谱条件能与多种检测器兼容。其与质谱兼容使得对光降解产物的鉴定成为可能，因而具有提供用于分析合成杂质的信息的可能。

附图说明

图1为对比实施例1中空白溶液HPLC检测结果图。

图2为对比实施例1中对照溶液HPLC检测结果图。

图3为对比实施例1中光照样品溶液HPLC检测结果图。

图4为230nm项下实施例1中空白溶液HPLC检测结果图。

图5为230nm项下实施例1中对照溶液HPLC检测结果图。

图6为230nm项下实施例1中光照样品溶液HPLC检测结果图。

图7为230nm项下实施例2中空白溶液HPLC检测结果图。

图8为230nm项下实施例2中对照溶液HPLC检测结果图。

图9为230nm项下实施例2中光照样品溶液HPLC检测结果图。

图10为230nm项下实施例3中空白溶液HPLC检测结果图。

图11为230nm项下实施例3中对照溶液HPLC检测结果图。

图12为230nm项下实施例3中光照样品溶液HPLC检测结果图。

图13为230nm项下实施例4中空白溶液HPLC检测结果图。

图14为230nm项下实施例4中对照溶液HPLC检测结果图。

图15为230nm项下实施例4中光照样品溶液HPLC检测结果图。

具体实施方式

光照样品信息：采用原料药与华海制剂处方辅料混合后的混合样品置于光照条件下照射，累积光照达到白光1.2×106Lux·hr、紫光200w·hr/m2。

对比实施例1

根据文献：刘葵葵，邓玉晓，封静，等.法匹拉韦中有关物质的HPLC法测定[J].中国药师，2018，21(4)：739-742所述检测方法。

色谱条件：

仪器：高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18，250mm*4.6mm，5.0μm

流动相：磷酸缓冲液(取磷酸二氢钾1.4g，加水至1000mL，用磷酸调节pH至4.0±0.05)-乙腈(90:10)

检测波长：238nm

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

进样量：20μL

稀释液：水

对照溶液：称取原料药适量至合适的容量瓶中，稀释液配制成每1mL中含0.2mg法匹拉韦的溶液。

光破坏样品溶液配制：称取光照样品适量至合适的容量瓶中，加乙腈配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液，再转移适量溶液至合适的量瓶中，加稀释液稀释成每1mL含0.2mg法匹拉韦的溶液。

按上述检测条件进行检测分析，空白溶液、对照溶液及光破坏样品溶液的进样结果分别见图1-3，可看出该方法光降解产物在溶剂峰处出峰。

实施例1

色谱条件：

仪器：高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器

色谱柱：Waters XBridge Amide，150mm*4.6mm，3.5μm(基于亚乙基桥杂化颗粒(BEH)的三键键合相酰胺基团)

流动相：乙腈：100mmol/L pH3.0甲酸铵水溶液＝95:5(v/v)

流速：0.8mL/min

进样体积：30μL

柱温：30℃

运行时间：30min

稀释液：乙腈

空白溶液配制：同稀释液。

对照溶液：称取原料药适量至合适的容量瓶中，稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

光破坏样品溶液配制：称取光照样品适量至合适的容量瓶中，加稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

按上述检测条件进行检测分析，空白溶液、对照溶液及光破坏样品溶液的进样结果分别见图4-6，可看出该方法中光降解产物有适当保留且分离良好。

实施例2

仪器：高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器

色谱柱：Luna 5μ HILIC 200A，250mm*4.6mm，5μm(超纯硅胶修饰交联二醇)

流动相：乙腈：100mmol/L pH3.0甲酸铵水溶液＝95:5(v/v)

流速：0.5mL/min

进样体积：30μL

柱温：30℃

运行时间：30min

稀释液：乙腈

空白溶液配制：同稀释液。

对照溶液：称取原料药适量至合适的容量瓶中，稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

光破坏样品溶液配制：称取光照样品适量至合适的容量瓶中，加稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

按上述检测条件进行检测分析，空白溶液、对照溶液及光破坏样品溶液的进样结果分别见图7-9，可看出该方法中光降解产物有适当保留且分离情况良好。

实施例3

仪器：高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器

色谱柱：ACE 5μm HILIC-N，250mm*4.6mm(超纯硅胶键合羟基)

流动相：乙腈：20mmol/L pH3.0甲酸铵水溶液＝95:5(v/v)

流速：0.8mL/min

进样体积：30μL

柱温：30℃

运行时间：30min

稀释液：乙腈

空白溶液配制：同稀释液。

对照溶液：称取原料药适量至合适的容量瓶中，稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

光破坏样品溶液配制：称取光照样品适量至合适的容量瓶中，加稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

按上述检测条件进行检测分析，空白溶液、对照溶液及光破坏样品溶液的进样结果分别见图10-12，可看出该方法中光降解产物有适当保留且分离情况良好。

实施例4

仪器：高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器

色谱柱：ACE 5μm HILIC-N，250mm*4.6mm(超纯硅胶键合羟基)

流动相：乙腈：pH3.0甲酸水溶液＝95:5(v/v)

流速：0.8mL/min

进样体积：30μL

柱温：30℃

运行时间：30min

稀释液：乙腈

空白溶液配制：同稀释液。

对照溶液：称取原料药适量至合适的容量瓶中，稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

光破坏样品溶液配制：称取光照样品适量至合适的容量瓶中，加稀释液配制成每1mL中含1mg法匹拉韦的溶液。

按上述检测条件进行检测分析，空白溶液、对照溶液及光破坏样品溶液的进样结果分别见图13-15，可看出该方法中光降解产物有适当保留且分离情况良好。

上述仅对本发明的优选实施例做了详细说明，本发明不限于上述实施例，任何对本发明的变换和变型都归属本发明的保护范围。