用免疫刺激性缀合物治疗疾病的方法和组合物

摘要

公开了用于减轻与免疫刺激性缀合物的施用相关的毒性，特别用于减轻与此类缀合物的静脉内施用相关的毒性的方法和缀合物。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月12日提交的美国临时申请第62/730,499号、2019年2月26日提交的美国临时申请第62/810,816号和2019年3月12日提交的美国临时申请第62/816,992号的优先权，其各自出于任何目的通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本申请涉及免疫刺激性缀合物以及施用免疫刺激性缀合物的方法。

背景技术

在美国，死亡的主要原因之一是癌症。常规的癌症治疗方法，如化学疗法、手术或放射疗法，往往对癌症具有高毒性和/或非特异性，从而导致有限的功效和有害的副作用。免疫系统有潜力成为对抗癌症的强有力的特定工具。这种观察导致了免疫治疗作为临床试验的药物候选物的发展。免疫治疗剂可以通过加强特异性免疫应答而起作用，并且具有成为强有力的抗癌治疗的潜力。与化学疗法一样，免疫治疗剂的施用可能在患者中引起副作用。这些副作用可能不同于用常规的癌症治疗方法相关的那些，并且需要不同的方法或技术来管理患者。

通过引用并入本文

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地表示为通过引用并入。

发明概述

本公开内容提供了用于管理与施用免疫刺激性缀合物相关的毒性的方法和组合物。

附图简述

在所附权利要求中具体阐述了本公开内容的新颖特征。通过参考阐述了说明性方面的以下详细描述，将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，在说明性方面中利用了本公开内容的原理以及附图：

图1A-图1D显示了用HER2-TLR7 IV给药的野生型小鼠表现出过敏反应的临床体征(1A,1D)，而T细胞和B细胞缺陷型SCID小鼠(1B,1D)和B细胞缺陷型J

图2显示了在用HER2-TLR7进行IV给药之前用B细胞耗损的抗体预处理小鼠降低了过敏反应的临床体征。

图3的A-图3的B显示了用HER2-TLR7 IV给药的野生型(3A)和肥大细胞缺陷型(3B)小鼠表现出过敏反应的临床体征。

图4显示了在每周第二剂量的HER2-TLR7之前小鼠中各种效应细胞的耗损对观察到的直肠温度的影响。

图5A-图5B显示了IV或SC施用裸HER2 mAb和HER2-TLR7后抗药物抗体(ADA)(5A)和IgG1抗体(5B)的水平。

图6A-图6B显示了在小鼠中SC和IV施用5mg/kg后(6A)以及在小鼠中SC施用50mg/kg后(6B)HER2-TLR7的药代动力学研究的血浆水平结果。

图7显示了在IV给药HER2-TLR7之前施用的血小板活化因子(PAF)抑制剂和抗组胺药，但不是地塞米松，减轻了毒性。

图8显示了在IV给药HER2-TLR7之后施用的肾上腺素减轻了毒性。

图9显示了当与单独的HER2 mAb相比时，在小鼠中SC给药HER2-TLR7之后的改善的存活。

图10显示了通过皮下注射施用4个剂量的6mg/kg或12mg/kg的HER2-TLR8的食蟹猴的药效学特征。

图11A-图11D显示了与用抗HER2 mAb和PBS对照处理的小鼠相比在重复剂量皮下给药HER2-TLR7之后小鼠中的肿瘤生长减慢(11A，HER2 mAb；11B，HER2-TLR7；11C，PBS)以及用HER2-TLR处理的小鼠与对照相比显示出显著的存活优势(11D)。

图12A-图12B显示了用结肠癌细胞激发的初始小鼠和用皮下HER2-TLR7预处理的小鼠的肿瘤体积结果(12A，初始小鼠对比5mg/kg预处理的小鼠；12B，初始小鼠对比20mg/kg预处理的小鼠)，证明了用结肠癌细胞再激发的小鼠受到保护。

图13显示了用HER2-阴性CT26细胞激发的小鼠(与初始小鼠相比，用50mg/kg SCHER2-TLR7预处理的小鼠)的肿瘤体积结果，证明了再激发的小鼠免于HER2-阴性CT26肿瘤细胞的生长。

图14A-图14B显示了HER2-TLR7和TLR7有效载荷在HER2-阳性细胞存在下诱导来自小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的TNF-α产生，而TLR7有效载荷而不是HER2-TLR7在HER2-阴性细胞存在下刺激了TNF-α产生(14A,BMDM+SK-BR-3；14B,BMDM+MDA-MG-468)。

图15A-图15D显示了用单剂量的HER2-TLR7处理之后48小时，HER2+CT26荷瘤小鼠中升高的细胞因子、趋化因子和免疫细胞的浸润/活化(15A，IFNγ；15B，IL-1α；15C，MCP-1；15D，MIP1α)。

图16A-图16F显示了在用三剂量的HER2-TLR7的第三个剂量处理之后48小时，HER2+CT26荷瘤小鼠中升高的细胞因子、趋化因子和免疫细胞的浸润/活化(16A，IFNγ；16B，IL-6；16C，MCP-1；16D，IP-10；16E，CXCL1；16F，CXCL2)。

图17A-图17G显示了在单剂量的HER2-TLR7之后48小时或三剂量的HER2-TLR7的第三个剂量之后48小时，扩增的AH-1+肿瘤抗原细胞群(17A)、巨噬细胞M1/M2比例增加(17B)、AH-1响应性CD8+T细胞扩增(17C)、升高的肿瘤细胞表面PD-L1表达(17D、17E)和升高的嗜中性粒细胞浸润(17F，17G)。

定义

根据以下详述，本公开内容的另外的方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中示出和描述了本公开内容的示例性方面。如将理解的，本公开内容能够具有其它和不同的方面，并且其若干细节能够在各个方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，这些描述在本质上被认为是说明性的，而不是限制性的。

如本文所用，在多核苷酸、肽、多肽或蛋白质序列与另一多核苷酸、肽、多肽或蛋白质序列比较的上下文中，“％同一性”或“相同的”是指那些序列的同一性。同一性以第一序列与第二序列的序列同一性的百分比表示。相对于参考多核苷酸序列的序列同一性百分比(％)是与序列比对之后与参考多核苷酸序列中的核苷酸相同的候选序列中的核苷酸的百分比。相对于参考氨基酸序列的序列同一性百分比(％)是在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大的序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，序列中与参考氨基酸序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。

如本文所用，天然L-对映异构体氨基酸的缩写是常规的并且可以如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；甲硫氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。除非另有说明，否则X可以表示任何氨基酸。

如本文所用，“抗原”是指可以在宿主中引发免疫应答的抗原物质。抗原可以是肽、多肽、蛋白质、多糖、脂质或糖脂，其可以被抗体或其它抗原结合结构域识别。免疫细胞暴露于一种或多种这些抗原可引发快速的细胞分裂和分化反应，导致暴露的T细胞和B细胞克隆的形成。B细胞可以分化成浆细胞，浆细胞继而可以产生选择性结合抗原的抗体。

如本文所用，“肿瘤抗原”是指存在于癌细胞上的抗原物质，其可以被抗体或抗原结合结构域识别，并且与正常(非癌)细胞相比优先存在于癌细胞上。

如本文所用，“肿瘤相关抗原”是与正常(非癌)细胞的细胞外环境相比优先存在于癌细胞的细胞外环境中的抗原物质。

如本文所用，“实体瘤抗原”是指存在于实体瘤的癌细胞上的抗原物质，其可以被抗体或抗原结合结构域识别，并且与正常(非癌)细胞相比优先存在于癌细胞上。实体瘤包括脑癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、头颈癌、骨癌、皮肤癌、间皮瘤、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫癌和宫颈癌/子宫内膜癌。实体瘤包括肉瘤和癌。

如本文所用，术语“抗体”是指特异性结合特定抗原或对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。术语抗体包括，例如，多克隆的、单克隆的、基因工程化的及其抗原结合片段。抗体可以是，例如，鼠的、嵌合的、人源化的、异源缀合物、双特异性抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体。抗原结合片段可以包括例如Fab、Fab′、F(ab′)

如本文所用，“抗体构建体”是指包括至少一个抗原结合结构域和Fc结构域的构建体，如蛋白质。

如本文所用，“抗原结合结构域”是指来自抗体或来自非抗体的结合结构域，其能够特异性结合抗原。当在给定缀合物或抗体构建体中存在多于一个抗原结合结构域(例如，第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域、第三抗原结合结构域等)时，可以对抗原结合结构域进行编号。同一缀合物或构建体中的不同抗原结合结构域可以结合靶向相同抗原或不同抗原(例如，第一抗原结合结构域能够特异性结合第一肿瘤抗原，第二抗原结合结构域能够特异性结合第二肿瘤抗原)。

如本文所用，“Fc结构域”是指来自抗体的Fc部分的结构域或来自能够特异性结合Fc受体(如Fcγ受体或FcRn受体)的非抗体分子的结构域。来自抗体的Fc结构域可以是例如C

如本文所用，关于与抗原相互作用的抗原结合结构域的“识别”和“特异性结合”是指与抗原结合结构域与不同抗原相互作用(即，非特异性结合)相比，抗原结合结构域与抗原之间的特异性缔合或特异性结合。在一些实施方案中，识别或特异性结合抗原的抗原结合结构域具有<<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如10

如本文所用，“基本上类似的结合亲和力”意指与参考分子的结合亲和力相比差异小于30％、或小于20％、或小于10％的结合亲和力，其中比较针对相同靶标的两个不同分子之间的结合亲和力。

如本文所用，“Fc无效”是指对任何Fcγ受体表现出弱结合至没有结合的Fc结构域。在一些实施方案中，Fc无效结构域或区表现出对Fcγ受体的结合亲和力降低(例如，Kd的增加)至少1000倍。

如本文所用，“髓样细胞”是指树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、骨髓衍生性抑制细胞(MDSC)。

如本文所用，“抗原呈递细胞”或“APC”是指可以以生产方式将抗原呈递给T-或B-细胞，从而导致对所述抗原具有特异性的T-或B-细胞克隆的活化和/或扩增的细胞。非限制性示例性APC包括树突细胞，巨噬细胞，单核细胞和B细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞、巨噬细胞或单核细胞。

如本文所用，“免疫刺激性化合物”是直接或间接活化或刺激免疫细胞(如髓样细胞或APC)的化合物或其它分子。

如本文所用，“髓样细胞激动剂”是指活化或刺激髓样细胞的免疫应答的化合物。

如本文所用，术语“B细胞耗损剂”是指当施用于对象时引起对象中B细胞数量减少的试剂。在一些实施方案中，B细胞耗损剂结合B细胞表面分子，诸如例如CD20、CD22或CD19。在一些实施方案中，B细胞耗损剂抑制B细胞存活因子，例如BLyS或APRIL。B细胞耗损剂包括但不限于抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗BLyS抗体、TACI-Ig、BR3-Fc和抗BR3抗体。非限制性示例性B细胞耗损剂包括利妥昔单抗、奥克珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗、依帕珠单抗、MEDI-51(抗CD19抗体)、贝利木单抗、BR3-Fc,AMG-623和阿塞西普。

如本文所用，术语“缀合物”是指任选地通过连接子与至少一种免疫刺激性化合物连接的抗体构建体。

如本文所用，“免疫刺激性缀合物”是指通过体外或体内测定确定的活化或刺激免疫系统或其部分的缀合物。

如本文所用，“免疫细胞”是指T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或抗原呈递细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞或NKT细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方案中，免疫细胞不是抗原呈递细胞。

如本文所用，术语“最大耐受剂量”或MTD是指不引起不可接受的副作用的药物或治疗的最高剂量。

术语“盐”或“药学上可接受的盐”是指是指衍生自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子的盐。药学上可接受的酸加成盐可以用无机酸和有机酸形成。可以衍生盐的无机酸包括，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生盐的有机酸包括，例如，乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。药学上可接受的碱加成盐可以用无机碱和有机碱形成。可以衍生盐的无机碱包括，例如，钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等。可以衍生盐的有机碱包括，例如，伯胺，仲胺和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代的胺，环胺，碱性离子交换树脂等，特别是如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。在一些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐选自铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。

术语“C

术语“C

“亚烷基”是指将分子的其余部分与仅由碳和氢组成的基团连接，不含不饱和性以及优选具有一至十二个碳原子的二价烃链，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基等。亚烷基链通过单键连接到分子的其余部分并且通过单键连接到基团。亚烷基链与分子的其余部分以及与基团的连接点分别通过末端碳。在其它实施方案中，亚烷基包含一至五个碳原子(即，C

“亚烯基”是指将分子的其余部分与仅由碳和氢组成的基团连接，含有至少一个碳-碳双键以及优选具有二至十二个碳原子的二价烃链。亚烯基链通过单键连接到分子的其余部分并且通过单键连接到基团。亚烯基链与分子的其余部分以及与基团的连接点分别通过末端碳。在其它实施方案中，亚烯基包含二至五个碳原子(即，C

“亚炔基”是指将分子的其余部分与仅由碳和氢组成的基团连接，含有至少一个碳-碳叁键以及优选具有二至十二个碳原子的二价烃链。亚炔基链通过单键连接到分子的其余部分并且通过单键连接到基团。亚炔基链与分子的其余部分以及与基团的连接点分别通过末端碳。在其它实施方案中，亚炔基包含二至五个碳原子(即，C

“亚杂烷基”是指在链中包含至少一个杂原子，不含不饱和度以及优选具有一至十二个碳原子和一至六个杂原子，例如-O-、-NH-、-S-的二价烃链。亚杂烷基链通过单键连接到分子的其余部分并且通过单键连接到基团。亚杂烷基链与分子的其余部分以及与基团的连接点是通过链的末端原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含一至五个碳原子和一至三个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含一至四个碳原子和一至三个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含一至三个碳原子和一至两个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含一至两个碳原子和一至两个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含一个碳原子和一至两个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含五至八个碳原子和一至四个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含二至五个碳原子和一至三个杂原子。在其它实施方案中，亚杂烷基包含三至五个碳原子和一至三个杂原子。除非在说明书中另外明确说明，否则亚杂烷基链任选地被一个或多个取代基如本文所述的那些取代基取代。

本文使用的术语“碳环”是指饱和、不饱和或芳香族环，其中所述环的每个原子是碳。碳环包括3至10元单环、6至12元双环和6至12元桥环。双环碳环的每个环可选自饱和、不饱和和芳香族环。在示例性实施方案中，芳香族环例如苯基可以与饱和或不饱和的环例如环己烷、环戊烷或环己烯稠合。在化合价允许时，双环碳环包括饱和、不饱和和芳香族双环的任何组合。双环碳环包括环大小的任意组合，如4-5稠环系统、5-5稠环系统、5-6稠环系统、6-6稠环系统、5-7稠环系统、6-7稠环环系统、5-8稠环系统和6-8稠环系统。示例性的碳环包括环戊基、环己基、环己烯基、金刚烷基、苯基、茚满基和萘基。术语“不饱和碳环”是指具有至少一个不饱和度并且不包括芳香族碳环的碳环。不饱和碳环的实例包括环己二烯、环己烯和环戊烯。

本文使用的术语“杂环”是指包含一个或多个杂原子的饱和、不饱和或芳香族环。示例性杂原子包括N、O、Si、P、B和S原子。杂环包括3至10元单环、6至12元双环和6至12元桥环。在化合价允许时，双环杂环包括饱和、不饱和和芳香族双环的任何组合。在示例性实施方案中，芳香族环(例如吡啶基)可以与饱和或不饱和环(例如环己烷、环戊烷、吗啉、哌啶或环己烯)稠合。双环杂环包括环大小的任何组合，如4-5稠环系统、5-5稠环系统、5-6稠环系统、6-6稠环系统、5-7稠环系统、6-7稠环系统、5-8稠环系统和6-8稠环系统。术语“不饱和杂环”是指具有至少一个不饱和度并且不包括芳香族杂环的杂环。不饱和杂环的实例包括二氢吡咯、二氢呋喃、噁唑啉、吡唑啉和二氢吡啶。

术语“杂芳基”包括芳香族单环结构，优选5至7元环，更优选5至6元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选1至4个杂原子，更优选1个或2个杂原子。术语“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环环系，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，其中至少一个环是杂芳香族的，例如其它环可以是芳香族或非芳香族的碳环或杂环的。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。

术语“取代的”是指在一个或多个碳或者可取代的杂原子(例如结构的-NH-)上具有替代氢的取代基的部分。应理解，“取代”或“被……取代”包括隐含的条件，即此类取代与取代的原子和取代基的允许化合价一致，并且该取代产生稳定的化合物，即不会如通过重排、环化、消除等自发地经历转化的化合物。在某些实施方案中，取代的是指具有替代同一碳原子上的两个氢原子的取代基的部分，如用氧代、亚氨基或硫基取代单个碳上的两个氢原子。如本文所用，术语“取代的”考虑了包括有机化合物的所有可允许的取代基。在宽泛的方面，可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状的、支链和非支链的、碳环和杂环的、芳香族和非芳香族取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个以及可以是相同或不同的。为了本公开内容的目的，杂原子例如氮可以具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价的本文所述的有机化合物的任何允许的取代基。

在一些实施方案中，取代基可以包括本文所述的任何取代基，例如：卤素、羟基、氧代(＝O)、硫基(＝S)、氰基(-CN)、硝基(-NO

本领域技术人员将理解，如果合适，取代基本身可以是取代的。除非特别说明为“未取代的”，否则本文对化学部分的提及应理解为包括取代的变型。例如，提及“杂芳基”基团或部分隐含地包括取代和未取代的变型。

具有碳-碳双键或碳-氮双键的化学实体可以以Z-或E-形式(或顺式-或反式-形式)存在。此外，一些化学实体可以以各种互变异构形式存在。除非另有说明，否则本文所述的化学实体也旨在包括所有Z-、E-和互变异构形式。

“互变异构体”是指其中质子从分子的一个原子转移到同一分子的另一个原子是可能的分子。在某些实施方案中，本文呈现的化合物以互变异构体存在。在可能发生互变异构化的情况下，将存在互变异构体的化学平衡。互变异构体的确切比例取决于几个因素，包括物理状态、温度、溶剂和pH。互变异构平衡的一些实例包括：

本文所用的短语“静脉内施用”和“静脉内施用的”是指将缀合物注射或输注到对象的静脉中。

本文所用的短语“静脉内缓慢输注”和“IV缓慢输注”是指导致约4小时或更长的Tmax的静脉内输注。

短语“皮下施用”、“皮下施用的”等是指将缀合物施用至对象的皮下组织。为清楚起见，皮下施用不同于瘤内注射到位于皮下组织的肿瘤或癌性病变中。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触、而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

本文使用的短语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。根据施用途径，每种载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且对对象无害。

短语“靶向部分”是指相对于其它非靶分子对靶分子具有选择性亲和力的结构。靶向部分与靶分子结合。靶向部分可以包括例如抗体、肽、配体、受体或其结合部分。靶生物分子可以是细胞的生物受体或其它结构，如肿瘤抗原。靶向部分通常对特定细胞表面抗原具有特异性，以便将免疫刺激性化合物靶向靶细胞或疾病部位。

“小分子”是分子量小于1500、或100、或900、或750、或600、或500道尔顿的有机化合物。在一些实施方案中，小分子激动剂具有范围为3-6、或4-5、或2-4的辛醇-水分配系数(logP)。在一些实施方案中，小分子激动剂具有小于200或小于

另外，应理解，衍生自本文所述的结构和取代基的各种组合的单独化合物或化合物组由本申请公开，其程度如同各化合物或化合物组单独阐述。因此，特定结构或特定取代基的选择在本公开内容的范围内。

如本文在数字的上下文中所用的术语“约”是指以该数字为中心并跨越比该数字小10％且比该数字大10％的范围。在范围的上下文中使用的术语“约”是指跨越比该范围中列出的最低数字少10％，且比该范围中列出的最大数字多10％的扩展范围。应理解，本文所用的术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”是指所列举的组分中的“一种或多种”。替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所用，术语“包括”、“具有”和“包含”是同义使用的，这些术语及其变型旨在解释为非限制性的。

短语“…中的至少一个/种”在后面跟随有项目或元素的列表时，是指列表中一个或多个元素的开放式集合，其可以但不一定包括多于一个元素。

详述

本申请的发明人惊奇地发现，当TLR激动剂(例如TLR7和TLR8激动剂)作为免疫刺激性缀合物施用至对象时，递送模式可能是重要的。团注(bolus)重复IV施用可导致过敏反应毒性。本申请的发明人已经发现，如果免疫刺激性缀合物以导致每次给药后Tmax大于约4小时的方式施用，则可以安全地施用。此外，本申请的发明人已经发现与团注重复IV施用相关的过敏反应毒性是B细胞介导的，并且可以随着B细胞耗损剂的施用而减弱。

目前描述的方法和缀合物尤其提供了用于减轻或避免与免疫刺激性缀合物的施用相关的毒性的方法，并且尤其用于减轻或避免与此类缀合物的静脉内施用(即，团注重复静脉内施用)相关的毒性的方法。通常，直到在施用第一剂量之后至少7天或8天施用随后剂量，才可以观察到与团注重复IV施用相关的过敏反应样毒性。即，可以在首次约7天施用多剂量而不引起过敏反应样毒性，但在约7天之后施用的随后剂量可引起过敏反应样毒性。所述方法提供了以最小化和/或避免过敏反应样毒性的方式(不论剂量之间的毒性如何)，例如，通过以导致免疫刺激性缀合物的Tmax大于约4小时的方式施用免疫刺激性缀合物。在一些方面，施用可以通过皮下施用。在其它方面，施用可以通过静脉内缓慢输注。在一些方面，可以减轻、幸免或避免的毒性是过敏反应样毒性。在一些实施方案中，被减轻、幸免或避免的毒性是过敏反应样毒性。治疗有效方案包括向对象施用至少两个或至少三个周期的所述缀合物。在一个周期内的缀合物的剂量可以是单剂量或作为分开的剂量。剂量可以在一个周期内或在周期之间是相同或不同的。

可用于本发明方法的免疫刺激性缀合物包括抗体构建体，该抗体构建体通常通过连接子连接于至少一种免疫刺激性化合物。抗体构建体具有至少一个抗原结合结构域和Fc结构域。在一些实施方案中，缀合物具有1至20个免疫刺激性化合物/抗体构建体，通常为1至8个。

本文描述了用于治疗通过TLR激动剂可治疗的疾病的方法，其包括向患有癌症的对象施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合在疾病细胞上表达的抗原，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激化合物是TLR激动剂，其中所述有效方案包括向所述对象施用至少两个周期的所述缀合物，以及其中所述有效方案导致在每次施用所述免疫刺激性缀合物后所述对象中的免疫刺激性缀合物的Tmax大于约4小时。

在一些方面，通过TLR激动剂可治疗的疾病是癌症。因此，本文描述了用于治疗癌症的方法，其包括向患有癌症的对象施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激化合物是TLR激动剂，其中所述有效方案包括向所述对象施用至少两个周期的所述缀合物，以及其中所述有效方案导致在每次施用所述免疫刺激性缀合物后所述对象中的免疫刺激性缀合物的Tmax大于约4小时。

在一些方面，通过TLR激动剂可治疗的疾病是病毒感染。因此，本文描述了用于治疗病毒感染的方法，其包括向具有病毒感染的对象施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合(i)所述病毒感染的细胞上存在的抗原或(ii)来自感染细胞的病毒的病毒抗原，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激性化合物是TLR激动剂，其中所述有效方案包括向所述对象施用至少两个周期的所述缀合物，以及其中所述有效方案导致在每次施用所述免疫刺激性缀合物后所述对象中的免疫刺激性缀合物的Tmax大于约4小时。

本文还公开了引发对象中的靶向免疫刺激的方法，其包括施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合疾病细胞上表达的抗原(例如，肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激化合物是TLR激动剂，其中所述有效方案包括向所述对象施用至少两个周期的所述缀合物，以及其中所述有效方案导致在每次施用所述免疫刺激性缀合物后所述对象中的免疫刺激性缀合物的Tmax大于约4小时。

本公开内容还涉及用于治疗用TLR激动剂可治疗的疾病(例如，癌症或病毒性疾病)的方法，其包括向有需要的对象皮下施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合相关抗原(例如肿瘤抗原或肿瘤相关抗原或病毒抗原或与所述疾病相关的另一抗原)，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激性化合物是TLR激动剂，其中所述有效方案包括向所述对象施用至少两个周期的所述缀合物，以及每周期大于0.4mg/kg的免疫刺激性缀合物的总剂量。

本公开内容还涉及用于治疗疾病(例如，用TLR激动剂可治疗的癌症、病毒性疾病或另一种疾病)的方法，其包括向有需要的对象施用B细胞耗损剂以及有效方案的免疫刺激性缀合物，免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激性化合物是TLR激动剂。

本文还描述了引发对象中的靶向免疫刺激的方法，其包括向有需要的对象施用B细胞耗损剂和有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，以及(b)免疫刺激性化合物，所述免疫刺激性化合物是TLR激动剂。

抗体构建体

如本文所述的免疫刺激性缀合物具有包含一个或多个抗原结合结构域和Fc结构域的抗体构建体。每个抗原结合结构域特异性结合抗原。抗体构建体可以具有，例如，特异性结合第一抗原的第一抗原结合结构域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合结构域和Fc结构域。抗体构建体可以是抗体，其中所述抗体具有特异性结合抗原的抗原结合结构域或抗原结合结构域对以及Fc结构域。抗体构建体可以是双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合结构域、特异性结合第二抗原的第二抗原结合结构域和Fc结构域。

抗原结合结构域

抗原结合结构域可以是抗体的抗原结合部分或保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。抗原结合结构域通常识别单一抗原。抗体构建体通常包括，例如，一个或两个抗原结合结构域，尽管在抗体构建体中可以包括更多的抗原结合结构域。抗体构建体可以包括两个抗原结合结构域，其中每个抗原结合结构域识别相同的抗原。抗体构建体可以包括两个抗原结合结构域，其中每个抗原结合结构域识别抗原上的相同表位。抗体构建体可以包括两个抗原结合结构域，其中每个抗原结合结构域识别相同抗原的不同表位。抗体构建体可以包括两个抗原结合结构域，其中每个抗原结合结构域识别不同的抗原。抗体构建体可以具有三个抗原结合结构域，其中每个抗原结合结构域识别不同的抗原。抗体构建体可以具有三个抗原结合结构域，其中两个抗原结合结构域识别相同的抗原，并且第三个识别不同的抗原。

抗体构建体的抗原结合结构域可以选自特异性结合抗原的抗体的任何部分。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以是单克隆抗体，重组抗体或其抗原结合片段，例如重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)、Fab、Fab′、F(ab′)

在一些实施方案中，抗原结合结构域是特异性结合抗原的非抗体分子，包括但不限于DARPin、affimer、avimer、打结素、单抗体(monobody)、lipocalin、anticalin、‘T-body’、亲和体(affibody)、肽体(peptibody)、亲和力夹(affinity clamp)、适配子或肽。

在一些实施方案中，抗原结合结构域不同于抗体或其抗原结合片段，如双环肽(例如，

在某些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合抗原，如选自CD5、CD25、CD37、CD33、CD45、BCMA、CS-1、PD-L1、B7-H3、B7-DC(PD-L2)、HLD-DR、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、EpCAM、MUC1、叶酸结合蛋白(FOLR1)、A33、G250(碳酸酐酶IX)、前列腺特异性膜抗原抗原(PSMA)、GD2、GD3、GM2、Ley、CA-125、CA19-9(MUC1sLe(a))、表皮生长因子、HER2、IL-2受体、EGFRvIII(de2-7EGFR)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、腱生蛋白、金属蛋白酶、内皮唾酸蛋白、avB3、LMP2、EphA2、PAP、AFP、ALK、聚唾液酸、TRP-2、岩藻糖基GM1、间皮素(MSLN)、PSCA、sLe(a)、GM3、BORIS、Tn、TF、GloboH、STn、CSPG4、AKAP-4、SSX2、豆荚蛋白(Legumain)、Tie 2、Tim3、VEGFR2、PDGFR-B、ROR2、TRAIL1、MUC16、EGFR、CMET、HER3、MUC1、MUC15、CA6、NAPI2B、TROP2、CLDN18.2、RON、LY6E、FRAlpha、DLL3、PTK7、LIV1、ROR1、CLDN6、GPC3、ADAM12、LRRC15、CDH6、TMEFF2、TMEM238、GPNMB、ALPPL2、UPK1B、UPK2、LAMP-1、LY6K、EphB2、STEAP、ENPP3、CDH3、Nectin4、LYPD3、EFNA4、GPA33、SLITRK6或HAVCR1的那些抗原。

在某些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合非蛋白质或糖抗原，如GD2、GD3、GM2、Ley、聚唾液酸、岩藻糖基GM1、GM3、Tn、STn、sLe(动物)或GloboH。

在某些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合实体瘤抗原。在一些实施方案中，实体瘤抗原优先存在于肉瘤或癌细胞上。在一些实施方案中，实体瘤抗原优先存在于肉瘤细胞上。在一些实施方案中，实体瘤抗原优先存在于癌细胞上。

在一些实施方案中，实体瘤抗原存在于脑癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、头颈癌、骨癌、皮肤癌、间皮瘤、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫癌或宫颈癌/子宫内膜癌的细胞上。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于乳腺癌上的抗原，如HER2、TROP2、LIV-1、CDH3(p-钙粘蛋白)、MUC1、唾液酸表位CA6、PTK7、GPNMB、LAMP-1、LRRC15、ADAM12、EPHA2、TNC、LYPD3、EFNA4和CLDN6。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于脑癌上的抗原，如EGFRvIII、TNC和DLL-3。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于肺癌上的抗原，如间皮素、HER2、EGFR、PD-L1、MSLN、LY6K、CD56、PTK7、FOLR1、DLL3、SLC34A2、CECAM5、MUC16、LRRC15、ADAM12、EGFRvIII、LYPD3、EFNA4和MUC1。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于肝癌上的抗原，如GPC3、EPCAM、CECAM5。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于肾癌上的抗原，如HAVCR1、ENPP3、CDH6、CD70和cMET。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于胰腺癌上的抗原，如PTK7、MUC16、MSLN、LRRC15、ADAM12、EFNA4、MUC5A和MUC1。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于结肠直肠癌上的抗原，如EPHB2、TMEM238、CECAM5、LRRC15、ADAM12、EFNA4和GPA33。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于卵巢癌上的抗原、如MUC16、MUC1、MSLN、FOLR1、sTN、VTCN1、HER2、PTK7、FAP、TMEM238、LRRC15、CLDN6、SLC34A2和EFNA4。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于头颈癌上的抗原，如LY6K、PTK7、LRRC15、ADAM12、LYPD3、EFNA4和TNC。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于骨癌上的抗原，如EPHA2、LRRC15、ADAM12、GPNMB、TP-3和CD248。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于间皮瘤上的抗原，如MSLN。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于膀胱癌上的抗原，如LY6K、PTK7、UPK1B、UPK2、TNC、Nectin4、SLITRK6、LYPD3、EFNA4和HER2。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于胃癌上的抗原，如HER2、EPHB2、TMEM238、CECAM5和EFNA4。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于前列腺癌上的抗原，如PSMA、FOLH1、PTK7、STEAP、TMEFF2(TENB2)、OR51E2、SLC30A4和EFNA4。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于甲状腺癌上的抗原，如PTK7。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于子宫癌(如存在于子宫癌上)的抗原，如LY6K、PTK7、EPHB2、FOLR1、ALPPL2、MUC16和EFNA4。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于宫颈癌/子宫内膜癌上的抗原，如LY6K、PTK7、MUC16、LYPD3、EFNA4[0100]MUC1。

在一些实施方案中，所述实体瘤抗原是存在于肉瘤上的抗原，如LRRC15。

在一些方面，抗原是肝细胞抗原。在一些方面，肝细胞抗原在小管细胞、库普弗细胞、肝细胞或其任何组合上表达。在一些方面，肝细胞抗原是肝细胞抗原。在一些方面，肝细胞抗原选自ASGR1(脱唾液酸糖蛋白受体1)、ASGR2(脱唾液酸糖蛋白受体2)、TRF2、UGT1A1、SLC22A7、SLC13A5、SLC22A1和C9。在一些方面，肝细胞抗原选自ASGR1、ASGR2和TRF2。在一些方面，肝细胞抗原在感染了选自HBV和HCV的病毒的肝细胞上表达。

在一些方面，抗原是来自选自HBV和HCV的病毒的病毒抗原。在一些方面，病毒抗原是HBV抗原。在一些方面，病毒抗原是HBsAg、HBcAg或HBeAg。在一些方面，病毒抗原是HBsAg。

Fc结构域

抗体构建体包括Fc结构域。Fc结构域是可以结合一个或多个Fc受体(FcR)的结构。Fc结构域可以来自抗体。Fc结构域可以来自IgG抗体。Fc结构域可以来自IgG1、IgG2或IgG4抗体。Fc结构域可以是Fc区的一部分或全部(例如，C

Fc结构域可以是形成抗体构建体的抗体的一部分。Fc结构域也可以共价连接至抗原结合结构域以形成抗体构建体。抗体构建体可以具有抗原结合结构域和Fc结构域，其中Fc结构域与抗原结合结构域共价连接。抗体构建体可以具有抗原结合结构域和Fc结构域，其中Fc结构域作为Fc结构域-抗原结合结构域融合蛋白共价连接至抗原结合结构域。抗体构建体可以具有抗原结合结构域和Fc结构域，其中Fc结构域通过连接子共价连接至抗原结合结构域。

Fc结构域可以是可以结合FcR的抗体的结构域。基于FcR识别的抗体类别，将FcR组织成类别(例如，gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε))。FcαR类结合IgA并且包括几种同种型：FcαRI(CD89)和FcαμR。FcγR类结合IgG并且包括几种同种型：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。FcγRIIIA(CD16a)可以是FcγRIIIA(CD16a)F158变体或V158变体。FcR也可以是FcRn受体。

每种FcγR同种型对IgG抗体的Fc结构域的结合亲和力可以不同。例如，FcγRI可以以比FcγRII或FcγRIII更大的亲和力结合IgG。特定的FcγR同种型对IgG的亲和力可以部分地通过IgG抗体的位置CH2 84.4处的聚糖(例如，寡糖)来控制。例如，含有CH2 84.4聚糖的岩藻糖可以降低IgG对FcγRIIIA的亲和力。另外，由于缺乏半乳糖和末端GlcNAc部分，G0葡聚糖对FcγRIIIA可以具有增加的亲和力。

Fc结构域与FcR的结合可以增强免疫应答。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以导致免疫细胞的成熟。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以导致树突细胞(DC)的成熟。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以导致抗体依赖性细胞毒性。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以导致更有效的免疫细胞抗原摄取和加工。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以促进T细胞的扩增和活化。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以促进CD8+T细胞的扩增和活化。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以影响T细胞应答的免疫细胞调节。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以影响T细胞应答的免疫细胞调节。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以影响T细胞应答的树突细胞调节。可以由Fc结构域与FcR的结合产生的FcR介导的信号传导可以影响T细胞的功能极化(例如，极化可以朝向TH1细胞应答)。

Fc结构域可以被修饰，如通过氨基酸序列的修饰，以改变FcR对Fc结构域的识别。此类修饰仍然可以允许FcR介导的信号传导，这取决于修饰。修饰可以是Fc结构域残基处的氨基酸取代为该残基处的不同氨基酸。修饰可以是在Fc结构域的残基处插入或缺失氨基酸。修饰可以允许FcR结合FcR原本不能结合的Fc结构域上的位点。修饰可以增加FcR与Fc结构域的结合亲和力。修饰可以降低FcR与Fc结构域的结合亲和力。

Fc结构域可以是天然存在的Fc结构域(例如，野生型Fc结构域)的变体，并且与野生型Fc结构域的序列相比可以包含至少一个氨基酸改变。与野生型Fc结构域相比，Fc结构域中的氨基酸改变可以允许抗体构建体或缀合物以更大的亲和力结合至少一种Fc受体。与野生型Fc结构域相比，Fc结构域中的氨基酸改变可以允许抗体构建体或缀合物以更少的亲和力结合至少一种Fc受体。

在一些实施方案中，Fc结构域表现出对一种或多种Fc受体增加的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对一种或多种Fcγ受体增加的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对FcRn受体增加的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对Fcγ和FcRn受体增加的结合亲和力。在其它实施方案中，与来自IgG抗体(例如IgG1抗体)的野生型Fc结构域相比，Fc结构域表现出对Fcγ和/或FcRn受体相同或基本上类似的结合亲和力。

在一些实施方案中，Fc结构域表现出对一种或多种Fc受体降低的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对一种或多种Fcγ受体降低的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对FcRn受体降低的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对Fcγ和FcRn受体降低的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域是Fc无效结构域。在一些实施方案中，与野生型Fc结构域相比，Fc结构域表现出对FcRn受体降低的结合亲和力，但表现出对一种或多种Fcγ受体相同或增加的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对FcRn受体增加的结合亲和力，但表现出对一种或多种Fcγ受体相同或降低的结合亲和力。

Fc结构域可以具有一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或者四个或更多个氨基酸取代，其降低Fc结构域与Fc受体的结合。在某些实施方案中，Fc结构域对FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)或其任何组合中的一种或多种具有降低的结合亲和力。为了降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力，Fc结构域可以包含一个或多个氨基酸取代，其降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力。在其它实施方案中，与来自IgG抗体(例如IgG1抗体)的野生型Fc结构域相比，Fc结构域表现出对FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)或其任何组合中的一种或多种相同或基本上类似的结合亲和力。在一些实施方案中，Fc结构域可以包含已经从野生型IgG序列修饰的IgG同种型的序列。在一些实施方案中，Fc结构域可以包含已经从野生型IgG1序列修饰的IgG1同种型的序列。在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其降低IgG Fc结构域与所有Fcγ受体的结合亲和力。

修饰可以是根据Kabat的EU索引的E233、L234和L235的取代，如E233P/L234V/L235A或E233P/L234V/L235A/ΔG236。修饰可以是根据Kabat的EU索引的P238的取代，如P238A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的D265的取代，如D265A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的N297的取代，如N297A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的A327的取代，如A327Q。修饰可以是根据Kabat的EU索引的P329的取代，如P239A。

在一些实施方案中，IgG Fc结构域包含至少一个氨基酸取代，与野生型或参考IgGFc结构域相比，所述氨基酸取代降低其与FcγR1的结合亲和力。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的F241处的取代，如F241A。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的F243处的取代，如F243A。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的V264处的取代，如V264A。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的D265处的取代，如D265A。

在一些实施方案中，IgG Fc结构域包含至少一个氨基酸取代，与野生型或参考IgGFc结构域相比，所述氨基酸取代增加其与FcγR1的结合亲和力。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的A327和P329处的取代，如A327Q/P329A。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其降低IgG Fc结构域与FcγRII和FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的D270的取代，如D270A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的Q295的取代，如Q295A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的A327的取代，如A237S。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其增加IgG Fc结构域与FcγRII和FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的T256的取代，如T256A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K290的取代，如K290A。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其增加IgG Fc结构域与FcγRII受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的R255的取代，如R255A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的E258的取代，如E258A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的S267的取代，如S267A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的E272的取代，如E272A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的N276的取代，如N276A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的D280的取代，如D280A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的H285的取代，如H285A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的N286的取代，如N286A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的T307的取代，如T307A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的L309的取代，如L309A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的N315的取代，如N315A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K326的取代，如K326A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的P331的取代，如P331A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的S337的取代，如S337A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的A378的取代，如A378A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的E430的取代，如E430。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其增加IgG Fc结构域与FcγRII受体的结合亲和力并且降低与FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的H268的取代，如H268A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的R301的取代，如R301A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K322的取代，如K322A。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其降低IgG Fc结构域与FcγRII受体的结合亲和力但不影响与FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的R292的取代，如R292A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K414的取代，如K414A。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其降低IgG Fc结构域与FcγRII受体的结合亲和力并且增加与FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的S298的取代，如S298A。修饰可以是S239、I332和A330的取代，如S239D/I332E/A330L。修饰可以是S239和I332的取代，如S239D/I332E。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其降低IgG Fc结构域与FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的F241和F243的取代，如F241S/F243S或F241I/F243I。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其降低IgG Fc结构域与FcγRIIIA受体的结合亲和力并且不影响与FcγRII受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的S239的取代，如S239A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的E269的取代，如E269A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的E293的取代，如E293A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的Y296的取代，如Y296F。修饰可以是根据Kabat的EU索引的V303的取代，如V303A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的A327的取代，如A327G。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K338的取代，如K338A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的D376的取代，如D376A。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其增加IgG Fc结构域与FcγRIIIA受体的结合亲和力并且不影响与FcγRII受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的E333的取代，如E333A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K334的取代，如K334A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的A339的取代，如A339T。修饰可以是S239和I332的取代，如S239D/I332E。

在一些实施方案中，修饰包括一个或多个氨基酸的取代，其增加IgG Fc结构域与FcγRIIIA受体的结合亲和力。修饰可以是根据Kabat的EU索引的L235、F243、R292、Y300和P396的取代，如L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L(IgG1VLPLL)。修饰可以是根据Kabat的EU索引的S298、E333和K334的取代，如S298A/E333A/K334A。修饰可以是根据Kabat的EU索引的K246的取代，如K246F。

影响IgG Fc结构域与一种或多种Fcγ受体相互作用的IgG Fc结构域中的其它取代公开在美国专利第7,317,091号和第8,969,526号中(其公开内容通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，IgG Fc结构域包含至少一个氨基酸取代，与野生型或参考IgGFc结构域相比，所述氨基酸取代降低与FcRn的结合亲和力。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的H435处的取代，如H435A。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的I253处的取代，如I253A。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的H310处的取代，如H310A。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的I253、H310和H435处的取代，如I253A/H310A/H435A。

修饰可以包括一个氨基酸残基的取代，相对于野生型或参考IgG Fc结构域，该氨基酸残基的取代增加IgG Fc结构域对FcRn的结合亲和力。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的V308处的取代，如V308P。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的M428处的取代，如M428L。修饰可以包括在N434处的取代，如根据Kabat的EU索引的N434A或根据Kabat的EU索引的N434H。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的T250和M428处的取代，如T250Q和M428L。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的M428和N434处的取代，如M428L和N434S、N434A或N434H。修饰可以包括在根据Kabat的EU索引的M252、S254和T256处的取代，如M252Y/S254T/T256E。修饰可以是一个或多个氨基酸的取代，其选自P257L、P257N、P257I、V279E、V279Q、V279Y、A281S、E283F、V284E、L306Y、T307V、V308F、Q311V、D376V和N434H。影响IgG Fc结构域与FcRn相互作用的IgG Fc结构域中的其它取代公开在美国专利第9,803,023号中(其公开内容通过引用并入本文)。

在一些实施方案中，抗体构建体是人IgG2抗体，包括IgG2Fc区。在一些实施方案中，人IgG2抗体的重链可以在第127位、第232位或第233位的半胱氨酸处突变。在一些实施方案中，人IgG2抗体的轻链可以在第214位的半胱氨酸突变。人IgG2抗体的重链和轻链中的突变可以是从半胱氨酸残基到丝氨酸残基。

融合蛋白

在抗体构建体中，第一抗原结合结构域和另外的抗原结合结构域(如果存在)可以作为融合蛋白连接至Fc结构域。第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以在Fc结构域的N-末端连接至Fc结构域。第一抗原结合结构域可以在Fc结构域的N-末端连接至Fc结构域，并且第二抗原结合结构域可以在C-末端连接至Fc结构域。第一抗原结合结构域可以在Fc结构域的N-末端连接至Fc结构域，并且第二抗原结合结构域可以通过多肽连接子在C-末端连接至Fc结构域。在一些实施方案中，多肽连接子的范围为约10至约25个氨基酸，并且可以例如具有序列[G4S]n，其中n＝2至约5。

在一些实施方案中，第一抗原结合结构域可以在Fc结构域的C-末端连接至Fc结构域，并且第二抗原结合结构域可以在N-末端连接至Fc结构域。第一抗原结合结构域和Fc结构域可以包含抗体，并且第二结合结构域可以包含连接至抗体的单链可变片段(scFv)。第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和Fc结构域可以包含抗体，以及任选的第三结合结构域可以包含连接至抗体的单链可变片段(scFv)。第二抗原结合结构域和Fc结构域可以包含抗体，并且第一结合结构域可以包含单链可变片段(scFv)。单链可变片段可以包含抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。融合蛋白的第一抗原结合结构域可以在第一抗原结合结构域的单链可变片段的重链可变结构域处连接至第二抗原结合结构域(HL方向)。可选地，融合蛋白的第一抗原结合结构域可以在第一结合结构域的单链可变片段的轻链可变结构域处连接至第二抗原结合结构域(LH方向)。在任一方向上，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以通过多肽连接子连接。在一些实施方案中，多肽连接子的长度可以在约15至约25个氨基酸变化，并且可以例如具有序列[G4S]n，其中n＝3至约5。

在一些实施方案中，当第一抗原结合结构域和Fc结构域包含抗体并且第二抗原结合结构域包含单链可变片段(scFv)时，融合蛋白的第二抗原结合结构域可以在第一抗原结合结构域的单链可变片段的重链可变结构域处连接至第一抗原结合结构域(HL方向)。可选地，融合蛋白的第二抗原结合结构域可以在第一抗原结合结构域的单链可变片段的轻链可变结构域处连接至第一抗原结合结构域(LH方向)。

抗体构建体可以包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，其中所述第二抗原结合结构域可以连接至第一抗原结合结构域。抗体构建体可以包含具有轻链和重链的抗体。第一抗原结合结构域可以包含轻链和重链的Fab片段。第二抗原结合结构域可以作为融合蛋白在轻链的C-端或C-末端连接至轻链。第二抗原结合结构域可以包含单链可变片段(scFv)。

抗体构建体可以包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和Fc结构域，其中第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域作为融合蛋白连接至Fc结构域。

抗体

抗体构建体可以包含抗体，所述抗体可以具有一个或多个抗原结合结构域和Fc结构域。抗体可以包括通过二硫键共价结合在一起的两条轻链多肽(轻链)和两条重链多肽(重链)。轻链和重链的N-末端区域一起形成抗体的抗原识别位点。能够识别并能够结合抗原的位点由三个互补决定区(CDR)或高变区组成，它们位于两条重链和两条轻链的N-末端处重链可变区和轻链可变区的构架内。恒定结构域提供抗体的一般框架，并且可以不直接参与抗体与抗原的结合，但可以参与各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

抗体构建体的抗体可以包含任何类型的抗体，其可以被分配到不同类别的免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几种不同的类别可以进一步分成同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区(Fc)可以分别是α、δ、ε、γ和μ。基于恒定结构域的氨基酸序列，轻链可以是kappa或κ和lambda或λ中的一种。抗体构建体还可以包含抗体的抗原结合片段或重组形式，包括但不限于能够特异性结合抗原的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、rIgG、scFv、hcAb(重链抗体)、单域抗体、VHH、VNAR、sdAbs或纳米抗体。

抗体的抗原结合结构域通常包含一个或多个轻链(LC)CDR(LCDR)和一个或多个重链(HC)CDR(HCDR)、一个或多个LCDR或者一个或多个HCDR。例如，抗体的抗原结合结构域可以包含以下中的一个或多个：轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)或轻链互补决定区3(LCDR3)。对于另一个实例，抗原结合结构域可以包含以下中的一个或多个：重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)或重链互补决定区3(HCDR3)。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含以下中的所有：轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)、轻链互补决定区3(LCDR3)、重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)。除非另有说明，否则本文所述的CDR可以根据IMGT(国际免疫遗传学信息(international ImMunoGeneTics information))系统定义。

抗原结合结构域可以仅包含抗体的重链(例如，包括HC CDR)，并且不包含抗体的任何其它部分。抗原结合结构域可以仅包含抗体重链的可变结构域。可选地，抗原结合结构域可以仅包含抗体的轻链(例如，包括轻链CDR)。抗原结合结构域可以仅包含抗体轻链的可变结构域。

抗体可以是嵌合的或人源化的。非人(例如鼠)抗体的嵌合和人源化形式可以是完整的(全长)嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗原结合片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')

本文所述的抗体可以是人抗体。如本文所用，“人抗体”可以包括具有例如人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或者从针对一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物中分离的抗体，并且其通常不表达内源性免疫球蛋白。可以使用不能表达功能性内源性免疫球蛋白但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人抗体。识别选择表位的完全人抗体可以通过使用指导的选择产生。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择。

本文所述的抗体可以是双特异性抗体或双可变结构域抗体(DVD)。双特异性和DVD抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，通常是人或人源化抗体。

本文所述的抗体可以被衍生化或以其它方式修饰。例如，衍生化的抗体可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解裂解等进行修饰。

本文所述的抗体能够特异性结合癌症。抗体能够特异性结合实体瘤抗原。

在一些实施方案中，所述抗体可以是曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、伊匹单抗、帕妥珠单抗、替西木单抗(tremelimumab)、纳武单抗、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、MDX-1105(WO 2007/005874)、达西珠单抗(dacetuzumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、MPDL3280A、派姆单抗(lambrolizumab)、博纳吐单抗、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、奥那妥组单抗(onartuzumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、clivatuzumab、索非妥珠单抗(sofituzumab)、依决洛单抗、阿德木单抗(adecatumumab)、阿奈妥单抗(anetumab)、huDS6、利法妥珠单抗(lifastuzumab)、赛妥珠单抗、PR1A3、人源化的PR1A3、人源化的Ab2-3、claudiximab、AMG595、ABT806、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、DS-8895a变体1、DS-8895a变体2、MEDI-547、那呐妥单抗(narnatumab)、RG7841、法妥组单抗(farletuzumab)、米妥昔单抗(mirvetuximab)、J591变体1、J591变体2、洛伐妥珠单抗(rovalpituzumab)、PF-06647020、ladiratuzumab、西妥珠单抗(cirmtuzumab)、ladiratuzumab、huLiv1-14(WO 2012078688)、Liv1-1.7A4(US 2011/0117013)、huLiv1-22(WO 2012078688)、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、格巴妥木单抗(glembatumumab)、莫妥组单抗(oportuzumab)、enfortumab、迪妥昔珠单抗(depatuxizumab)、ASG-15ME的抗体、huM25(WO2017/095808A1)、或考曲妥珠单抗(codrituzumab)。

在一些实施方案中，所述抗体可以是曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、伊匹单抗、帕妥珠单抗、替西木单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿特珠单抗、MDX-1105(WO2007/005874)、达西珠单抗、乌瑞芦单抗、MPDL3280A、派姆单抗、博纳吐单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奥那妥组单抗、帕曲妥单抗、clivatuzumab、索非妥珠单抗、依决洛单抗、阿德木单抗、阿奈妥单抗、huDS6、利法妥珠单抗、赛妥珠单抗、PR1A3、人源化的PR1A3、人源化的Ab2-3、claudiximab、AMG595、ABT806、西罗珠单抗、DS-8895a变体1、DS-8895a变体2、MEDI-547、那呐妥单抗、RG7841、法妥组单抗、米妥昔单抗、J591变体1、J591变体2、洛伐妥珠单抗、PF-06647020、ladiratuzumab、西妥珠单抗、ladiratuzumab、huLiv1-14(WO 2012078688)、Liv1-1.7A4(US 2011/0117013)、huLiv1-22(WO 2012078688)、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、格巴妥木单抗、莫妥组单抗、enfortumab、迪妥昔珠单抗、ASG-15ME的抗体、huM25(WO2017/095808A1)或考曲妥珠单抗的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，所述抗体包含曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、伊匹单抗、帕妥珠单抗、替西木单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、阿特珠单抗、MDX-1105(WO2007/005874)、达西珠单抗、乌瑞芦单抗、MPDL3280A、派姆单抗、博纳吐单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奥那妥组单抗、帕曲妥单抗、clivatuzumab、索非妥珠单抗、依决洛单抗、阿德木单抗、阿奈妥单抗、huDS6、利法妥珠单抗、赛妥珠单抗、PR1A3、人源化的PR1A3、人源化的Ab2-3、claudiximab、AMG595、ABT806、西罗珠单抗、DS-8895a变体1、DS-8895a变体2、MEDI-547、那呐妥单抗、RG7841、法妥组单抗、米妥昔单抗、J591变体1、J591变体2、洛伐妥珠单抗、PF-06647020、ladiratuzumab、西妥珠单抗、ladiratuzumab、huLiv1-14(WO 2012078688)、Liv1-1.7A4(US 2011/0117013)、huLiv1-22(WO 2012078688)、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、格巴妥木单抗、莫妥组单抗、enfortumab、迪妥昔珠单抗、ASG-15ME的抗体、huM25(WO2017/095808A1)或考曲妥珠单抗的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合乳腺癌抗原。所述抗体可以是，例如，曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、赛妥珠单抗、ladiratuzumab、huLiv1-14(WO 2012078688)、Liv1-1.7A4(US 2011/0117013)、huLiv1-22(WO 2012078688)、huDS6、格巴妥木单抗、PF-0664720、MEDI-547、DS-8895a变体1或DS-08895a变体2。在一些实施方案中，抗体包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、赛妥珠单抗、ladiratuzumab、huLiv1-14(WO 2012078688)、Liv1-1.7A4(US2011/0117013)、huLiv1-22(WO 2012078688)、huDS6、格巴妥木单抗、PF-0664720、MEDI-547、DS-8895a变体1或DS-08895a变体2的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、赛妥珠单抗、ladiratuzumab、huLiv1-14(WO 2012078688)、Liv1-1.7A4(US 2011/0117013)、huLiv1-22(WO 2012078688)、huDS6、格巴妥木单抗、PF-0664720、MEDI-547、DS-8895a变体1或DS-08895a变体2的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合脑癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，AMG595、ABT806、洛伐妥珠单抗或迪妥昔珠单抗的抗体。在一些实施方案中，抗体包含AMG595、ABT806、洛伐妥珠单抗或迪妥昔珠单抗的抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含AMG595、ABT806、洛伐妥珠单抗或迪妥昔珠单抗的抗体的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合肺癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，帕尼单抗、西妥昔单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗和尼妥珠单抗、利法妥珠单抗、阿奈妥单抗、PF-0664720、法妥组单抗、洛伐妥珠单抗、利法妥珠单抗、索非妥珠单抗、huDS6、ABT806、AMG595或huM25(WO2017/095808A1)。在一些实施方案中，抗体包含帕尼单抗、西妥昔单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗和尼妥珠单抗、利法妥珠单抗、阿奈妥单抗、PF-0664720、法妥组单抗、洛伐妥珠单抗、利法妥珠单抗、索非妥珠单抗、huDS6、ABT806、AMG595或huM25(WO2017/095808A1)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含帕尼单抗、西妥昔单抗、帕博利珠单抗、纳武单抗、阿特珠单抗和尼妥珠单抗、利法妥珠单抗、阿奈妥单抗、PF-0664720、法妥组单抗、洛伐妥珠单抗、利法妥珠单抗、索非妥珠单抗、huDS6、ABT806、AMG595或huM25(WO2017/095808A1)的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合肝癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，考曲妥珠单抗、莫妥组单抗或人源化的PR1A3。在一些实施方案中，抗体包含考曲妥珠单抗、莫妥组单抗或人源化的PR1A3的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含考曲妥珠单抗、莫妥组单抗或人源化的PR1A3的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合肾癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，AGS-16M8F、AGS-16C3、CDX-014的抗体或奥那妥组单抗。在一些实施方案中，抗体包含AGS-16M8F、AGS-16C3、CDX-014的抗体或奥那妥组单抗的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含AGS-16M8F、AGS-16C3、CDX-014的抗体或奥那妥组单抗的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合存在于胰腺癌上的抗原。所述抗体可以是，例如，PF-0664720、clivatuzumab、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、阿尼莫单抗(anetumumab)、huDS6、索非妥珠单抗、huM25(WO2017/095808A1)或RG7841。在一些实施方案中，抗体包含PF-0664720、clivatuzumab、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、阿尼莫单抗、huDS6、索非妥珠单抗、huM25(WO2017/095808A1)或RG7841的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含PF-0664720、clivatuzumab、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、阿尼莫单抗、huDS6、索非妥珠单抗、huM25(WO2017/095808A1)或RG7841的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合结肠直肠癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，huM25(WO2017/095808A1)、PR1A3、人源化的PR1A3、pantumumab、西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗。在一些实施方案中，抗体包含huM25(WO2017/095808A1)、PR1A3、人源化的PR1A3、pantumumab、西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含huM25(WO2017/095808A1)、PR1A3、人源化的PR1A3、pantumumab、西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合存在于卵巢癌上的抗原。所述抗体可以是，例如，索非妥珠单抗、4H11(US2013/0171152、4H5(US2013/0171152)、huDS6、法妥组单抗、阿奈妥单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、PF-0664720、西罗珠单抗、huM25(WO2017/095808A1)或利法妥珠单抗。在一些实施方案中，抗体包含索非妥珠单抗、4H11(US2013/0171152、4H5(US2013/0171152)、huDS6、法妥组单抗、阿奈妥单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、PF-0664720、西罗珠单抗、huM25(WO2017/095808A1)或利法妥珠单抗的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含索非妥珠单抗、4H11(US2013/0171152、4H5(US2013/0171152)、huDS6、法妥组单抗、阿奈妥单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、PF-0664720、西罗珠单抗、huM25(WO2017/095808A1)或利法妥珠单抗的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合存在于头颈癌上的抗原。所述抗体可以是，例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、nimtuzumab、PF-0664720、pantumumab、西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗。在一些实施方案中，抗体包含西妥昔单抗、帕尼单抗、nimtuzumab、PF-0664720、pantumumab、西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含西妥昔单抗、帕尼单抗、nimtuzumab、PF-0664720、pantumumab、西妥昔单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合骨癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，huM25(WO2017/095808A1)、DS-8895a变体1、DS-8895a变体2或glembatumab。在一些实施方案中，抗体包含huM25(WO2017/095808A1)、DS-8895a变体1、DS-8895a变体2或glembatumab的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含huM25(WO2017/095808A1)、DS-8895a变体1、DS-8895a变体2或glembatumab的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合皮肤癌上存在的抗原。

在一些实施方案中，抗体特异性结合间皮瘤上存在的抗原。

在一些实施方案中，抗体特异性结合宫颈癌/子宫内膜癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，PF-0664720、阿尼莫单抗、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、huDS6或索非妥珠单抗。在一些实施方案中，抗体包含PF-0664720、阿尼莫单抗、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、huDS6或索非妥珠单抗的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含PF-0664720、阿尼莫单抗、4H11(US2013/0171152)、4H5(US2013/0171152)、huDS6或索非妥珠单抗的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合膀胱癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，enfortumab、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或SLITRK6。在一些实施方案中，抗体包含enfortumab、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或SLITRK6的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含enfortumab、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或SLITRK6的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合胃癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，索非妥珠单抗、阿奈妥单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或人源化的PR1A3。在一些实施方案中，抗体包含索非妥珠单抗、阿奈妥单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或人源化的PR1A3的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含索非妥珠单抗、阿奈妥单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗或人源化的PR1A3的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合前列腺癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，米妥昔单抗、J591变体1或J591变体2。在一些实施方案中，抗体包含米妥昔单抗、J591变体1或J591变体2的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含米妥昔单抗、J591变体1或J591变体2的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合甲状腺癌上存在的抗原。

在一些实施方案中，抗体特异性结合子宫癌上存在的抗原。所述抗体可以是，例如，PF-0664720、法妥组单抗、索非妥珠单抗、4H11(US2013/0171152或4H5(US2013/0171152)。在一些实施方案中，抗体包含PF-0664720、法妥组单抗、索非妥珠单抗、4H11(US2013/0171152或4H5(US2013/0171152)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗体包含PF-0664720、法妥组单抗、索非妥珠单抗、4H11(US2013/0171152或4H5(US2013/0171152)的根据IMGT系统的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，抗体特异性结合肉瘤上存在的抗原。

在一些实施方案中，抗体特异性结合肝细胞上存在的抗原并且对象具有病毒感染(例如，HBV或HCV)。所述抗体可以是，例如，结合ASGR1或ASGR2的抗体。

免疫刺激性化合物

抗体构建体通常通过连接子连接至免疫刺激性化合物以形成免疫刺激性缀合物。抗体构建体可以连接至一个或多个免疫刺激性化合物，通常约1至约10个化合物/抗体构建体。

在一些实施方案中，免疫刺激性化合物活化人免疫细胞，包括但不限于树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、髓样来源的抑制性细胞、NK细胞、B细胞、T细胞或肿瘤细胞或它们的组合。在一些实施方案中，免疫刺激性化合物是髓样细胞激动剂。髓样细胞激动剂是活化或刺激髓样细胞的免疫应答的化合物。例如，髓样细胞激动剂可以通过引起髓样细胞释放细胞因子来刺激免疫应答，这导致免疫细胞的活化。髓样细胞激动剂对免疫应答的刺激可以在体外通过共培养免疫细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))与缀合物靶向的细胞以及测量细胞因子释放、趋化因子释放、免疫细胞增殖、免疫细胞活化标志物的上调和/或ADCC来测量。在实施例中描述了示例性测定。可以通过在施用缀合物以及靶细胞和PBMC之后测定共培养物中剩余靶细胞的百分比来测量ADCC。

通常，免疫刺激性化合物作用于toll样受体(TLR)、核苷酸寡聚化结构域样受体(NOD)、RIG-I样受体(RLR)、c型凝集素受体(CLR)或胞质DNA传感器(CDS)或它们的组合。

在一些实施方案中，免疫刺激性化合物包含选自以下的一种或多种TLR的配体：TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR7/TLR8、TLR9和TLR10.

在一些实施方案中，免疫刺激性化合物是髓样细胞激动剂。在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的TLR2的配体：(a)热杀死细菌产物，优选HKAL、HKEB、HKHP、HKLM、HKLP、HKLR、HKMF、HKPA、HKPG或HKSA、HKSP，以及(b)细胞壁组分产物，优选LAM、LM、LPS、LIA、LIA、PGN、FSL、Pam2CSK4、Pam3CSK4或酵母聚糖(Zymosan)。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的TLR3的配体：rintatolimod、poly-ICLC、

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的TLR4的配体：LPS,MPLA或嘧啶并[5,4-b]吲哚，如WO 2014/052828(Cal的U(U of Cal))中所述的那些。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的TLR5的配体：FLA和鞭毛蛋白。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR6的配体。

在某些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR7激动剂和/或TLR8激动剂。在某些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR7激动剂。在某些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR8激动剂。在一些实施方案中，髓样细胞激动剂选择性地激动TLR7，而不激动TLR8。在其它实施方案中，髓样细胞激动剂选择性地激动TLR8，而不激动TLR7。

在某些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR7激动剂。在某些实施方案中，TLR7激动剂选自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、heteroarothiadiazide-2,2-二氧化物、苯并萘啶、噻吩并[3,2-d]嘧啶、4-氨基-咪唑并喹啉、咪唑并-吡啶酮、咪唑并-嘧啶酮、嘌呤、稠合的嘧啶-内酰胺、咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、咪唑并[4,5-c]喹啉、嘧啶、苯并氮杂

在某些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR8激动剂。在某些实施方案中，TLR8激动剂选自苯并氮杂

在一些实施方案中，TLR8激动剂是选自化合物1.1-1.2、1.4-1.20、1.23-1.27、1.29-1.46、1.48和1.50-1.67的苯并氮杂

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的TLR9的配体：ODN1585、ODN1668、ODN1826、PF-3512676(ODN2006)、ODN2007、ODN2216、ODN2336、ODN2395、BB-001、BB-006、CYT-003、IMO-2055、IMO-2125、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、agatolimod、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、来托莫德(leftolimod)(MGN-1703)、利尼莫德(litenimod)和CYT-003-QbGl0。

在其它实施方案中，髓样激动剂选择性地激动TLR9、TLR3、TLR4、TLR2、TLR5、RIG-I、STING、cGAS、NOD1、NOD2、NOD1/NOD2、NRLP3、ALPK1、MDA5AIM2、IRE1和PERK。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是TLR10的配体。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的核苷酸寡聚化结构域(NOD)样配体的配体：NOD1激动剂(C12-iE-DAP、iE-DAP、Tri-DAP)，NOD2激动剂(L18-MDP、MDP、M-TriLYS、M-TriLYS-D-ASN、莫拉丁酯(Murabutide)、N-乙醇酰基-MDP)和NOD1/NOD2激动剂(M-TriDAP、PGN)。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的一种或多种RIG-I样受体(RLR)的配体：S'ppp-dsRNA、Poly(dA:dT)、Poly(dG:dC)和Poly(I:C)。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的一种或多种C型凝集素受体(CLR)的配体：Cnrdlan AL、HKCA、HKSC、WGP、酵母聚糖和海藻糖-6,6-二山嵛酸酯。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的一种或多种胞质DNA传感器(CDS)的配体：ADU-S100，c-GMP，c-G-AMP，c-G-GMP，c-A-AMP，c-di-AMP，c-di-IMP，c-di-GMP，c-di-UMP，HSV-60，ISD，pCpG，Poly(dA:dT)，Poly(dG:dC)，Poly(dA)，VACV-70和α-倒捻子素以及WO2018156625(U of Texas)、WO2018152453(Eisai)、WO2018138685(Janssen)、WO2018100558(Takeda)、WO2018098203(Janssen)、WO2018065360(Biolog LifeSciences)、WO2018060323(Boehringer Ingelheim)、WO2018045204(IFM Therapeutics)、WO2018009466(Aduro)、WO 2017161349(Immune Sensor)、WO2017123669、WO2017123657、WO2017027646(Merck)、WO2017027645(Merck)、WO2016120305(GSK)、WO2016096174(InvivoGen)和US20140341976(Aduro)中公开的化合物。

在一些实施方案中，髓样细胞激动剂是选自以下的炎性小体诱导物的配体：NLRP3炎性小体蛋白质复合物，优选矾晶体、ATP、CPPD晶体、Hennozoin、MSU晶体、Nano-Si02、尼日利亚菌素(Nigericin)，以及(b)AIM2炎性小体蛋白质复合物，如Poly(dA:dT)。

在某些方面，TLR8激动剂或TLR7激动剂分别选自类别A或类别B，如本文进一步描述的。类别A的化合物(TLR8激动剂)的变量和式描述于标题为类别A的化合物的部分中，以及类别B的化合物(TLR7激动剂)的变量和式描述于标题为类别B的化合物的随后的部分中。类别A的化合物和类别B的化合物的式和变量可以在命名中重叠，例如，类别A和类别B的化合物的式IA；然而，变量和式描述不旨在于类别之间互换。

在一些方面，髓样细胞激动剂是苯并氮杂

其中：

R

R

R

R

C

C

杂环基，所述杂环基是含有一个选自N和O的杂原子并且是未取代的或者被苯基取代的饱和的3至7元环。

式X-1的结构描述于例如PCT公开号WO2017/202703中。

在一些方面，髓样细胞激动剂是苯并氮杂

其中：

R

R

R

a)

其中

X

X

X

X

Z

b)

其中

X

X

Y

Z

Z

c)

其中

X

Z

d)

其中

X

Z

在一些方面，髓样细胞激动剂是苯并氮杂

其中

R

R

R

R

R

Y是N或CR

其中R

式X-3的化合物描述于例如PCT公开号WO2016/096778中。

在一些方面，髓样细胞激动剂是二氢嘧啶基苯并氮杂

其中

R

R

R

R

R

R

X是N或CR

在一些方面，髓样细胞激动剂是亚磺酰基苯基或磺酰亚胺基(sulfonimidoyl)苯基苯并氮杂

其中

X是CR

R

R

R

R

R

R

式X-5的化合物描述于例如PCT公开号WO2017/046112中。

在一些方面，髓样细胞激动剂是具有式X-6的结构的TLR调节剂化合物：

其中

R

R

其中R

R

R

R

Z是C并且

R

R

R

在一些方面，髓样细胞激动剂是具有式X-7的结构的TLR调节剂化合物：

其中

Y是CF

R

R

R

R

在一些方面，髓样细胞激动剂是具有式X-8的结构的TLR调节剂化合物：

其中

W是-C(O)-；

Z是H、烷基、烯基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、OR

R

或者R

或者R

R

n是0、1、2、3或4。

式X-6、X-7和X-8的化合物描述于例如美国公开号US2019/0016808和US2014/0088085中。

在一些方面，髓样细胞激动剂是具有式X-9的结构的TLR调节剂化合物：

其中

R

R

R

R

苯基，所述苯基是未取代的或者被一个或两个选自以下的基团取代：C

杂芳基，所述杂芳基是5或6元芳香族环，其含有一个、两个或三个选自N、O或S的杂原子并且是未取代的或者被一个或两个选自以下的基团取代：C

式X-9的化合物描述于例如PCT公开号WO2016/142250中。

类别A的化合物，TLR8激动剂

在一些方面，本公开内容提供了由式(IIA)的结构或其药学上可接受的盐表示的TLR8激动剂：

其中：

L

L

X

X

R

R

R

R

R

其中苯并氮杂

在一些实施方案中，式(IIA)的化合物由式(IIB)或其药学上可接受的盐表示：

其中：

R

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，当R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，式(IIB)的化合物是式(IIC)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R

L

R

R

L

R

卤素、-OR

C

C

在某些实施方案中，-N(R

在某些实施方案中，R

在一些实施方案中，所述化合物选自：

在一些方面，本公开内容提供了由式(IIIA)的结构表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中:

L

L

X

X

R

R

R

R

R

R

R

其中苯并氮杂

在一些实施方案中，式(IIIA)的化合物由式(IIIB)或其药学上可接受的盐表示：

其中：

R

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，所述化合物选自：

以及它们中任一种的盐。

在一些方面，本公开内容提供了由式(IA)的结构表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中:

L

L

X

X

R

R

R

R

R

其中苯并氮杂

在一些实施方案中，式(IA)的化合物由式(IB)或其药学上可接受的盐表示：

其中:

R

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，所述化合物选自：

在一些方面，本公开内容提供了由式(IVA)的结构表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中:

L

L

X

R

R

R

L

R

其中苯并氮杂

在一些实施方案中，式(IVA)的化合物由式(IVB)或其药学上可接受的盐表示：

其中：

R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，R

在一些方面，式(IVB)的化合物是式(IVC)的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R

L

R

R

L

R

在某些实施方案中，-N(R

在一些实施方案中，所述化合物进一步共价结合连接子L

在一些实施方案中，L

其中：

L

R

在一些实施方案中，RX包含离去基团。在一些实施方案中，RX包含马来酰亚胺。在一些实施方案中，L

在一些实施方案中，L

其中

L

RX

其中RX*上的

在一些方面，本公开内容提供了选自以下的化合物或盐：

在一些方面，本公开内容提供了选自以下的化合物或盐：

其中RX

其中RX*上的

在一些实施方案中，L

在一些方面，本公开内容提供了选自以下的化合物或盐：

在一些方面，本公开内容提供了选自以下的化合物或盐：

在一些实施方案中，RX

在一些方面，本公开内容提供了由下式表示的缀合物：

在一些方面，本公开内容提供了由下式表示的缀合物：

在一些方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含本文公开的缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，缀合物的平均DAR是约2至约8、或约1至约3、或约3至约5。

类别B的化合物，TLR7激动剂

在一些方面，本公开内容提供了由式(IA)的结构表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

R

R

R

R

R

R

R

R

X

X

n是1、2或3；

x是1、2或3；

w是0、1、2、3或4；以及

z是0、1或2.

在某些实施方案中，对于式(IA)的化合物，其中X

在某些实施方案中，式(IA)的化合物由式(IB)或其药学上可接受的盐表示：

其中R

在某些实施方案中，式(IA)的化合物由式(IC)或其药学上可接受的盐表示：

其中R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，

R

R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，其中R

在某些实施方案中，对于式(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，X

在某些实施方案中，所述化合物由

在某些方面，本公开内容提供了式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或盐，所述化合物或盐进一步共价结合连接子L

在某些方面，本公开内容提供了由式(IIA)表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

R

R

R

R

R

R

R

R

R

L

X

X

n是1、2或3；

x是1、2或3；

w是0、1、2、3或4；以及

z是0、1或2。

在某些实施方案中，对于式(IIA)的化合物或盐，X

在某些实施方案中，式(IIA)的化合物由(IIB)或(IIC)或者其药学上可接受的盐表示：

其中R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，

R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，

R

R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，

R

R

在某些实施方案中，对于式(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，X

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，L

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，L

其中：

L

R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，RX包含离去基团。在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，RX是马来酰亚胺或α-卤代羰基。在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，L

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，L

其中：

RX包含反应性部分；以及

n是0-9。

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，RX包含离去基团。在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，RX是马来酰亚胺或α-卤代羰基。在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，L

在某些实施方案中，本公开内容提供了由下式表示的缀合物：

其中：

抗体是抗体构建体；

n是1至20；

D是式(IA)、(IB)或(IC)的类别B的化合物中任一种的化合物或盐；以及L

D-L

在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)、(IC)、(IIA)、(IIB)和(IIC)中任一种的化合物或盐的缀合物，n选自1至8。在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)、(IC)、(IIA)、(IIB)和(IIC)中任一种的化合物或盐的缀合物，n选自2至5。在某些实施方案中，对于式(IA)、(IB)、(IC)、(IIA)、(IIB)和(IIC)中任一种的化合物或盐的缀合物，n是2。

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)和(IIC)中任一种的化合物或盐，-L

其中：

L

RX

R

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)或(IIC)中任一种的化合物或盐，RX

在某些实施方案中，对于式(IIA)、(IIB)和(IIC)的化合物，-L

其中：

RX

n是0-9。

在某些实施方案中，本公开内容提供了靶向部分或抗体构建体以及类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)中任一种的至少一种化合物的免疫刺激性缀合物(或缀合物)，每种化合物任选地通过连接子连接至靶向部分或抗体构建体。在某些实施方案中，本公开内容提供了靶向部分或抗体构建体以及类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的至少一种化合物的免疫刺激性缀合物，每种化合物任选地通过连接子连接至靶向部分或抗体构建体。在某些实施方案中，药物组合物的平均药物抗体比(DAR)选自1至8。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适于皮下施用的药物组合物，其包含类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)中任一种的化合物的免疫刺激性缀合物以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本公开内容提供了适于皮下施用的药物组合物，其包含类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物的免疫刺激性缀合物以及药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物的平均药物抗体比(DAR)选自1至8。

在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗通过TLR激动剂可治疗的疾病(例如，癌症、病毒性疾病)的方法，其包括向有需要的对象皮下施用有效量的适于皮下施用的类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)中任一种的化合物的缀合物或其药物组合物，同时减轻、幸免或避免与团注静脉内施用所述缀合物相关的毒性。在一些实施方案中，被减轻、幸免或避免的毒性是过敏反应样毒性。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗癌症的方法，其包括向有需要的对象皮下施用有效量的适于皮下施用的类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中的任一种的化合物的缀合物或其药物组合物，同时减轻、幸免或避免与所述缀合物的团注静脉内施用相关的毒性。可以被减轻、幸免或避免的毒性包括过敏反应样毒性。

在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗的方法，其包括向有需要的对象皮下施用适于皮下施用的类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)中任一种的化合物的缀合物或其药物组合物，同时减轻、幸免或避免与团注静脉内施用所述缀合物相关的毒性。可以被减轻、幸免或避免的毒性包括过敏反应样毒性。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗的方法，其包括向对象皮下施用适于皮下施用的类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中的任一种的化合物的缀合物或其药物组合物，同时减轻、幸免或避免与所述缀合物的团注静脉内施用相关的毒性。可以被减轻、幸免或避免的毒性包括过敏反应样毒性。

本公开内容提供了适于皮下施用的类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)中任一种的化合物的缀合物或其药物组合物，其用于通过皮下施用所述缀合物通过治疗而治疗对象身体的方法中，同时减轻、幸免或避免与团注静脉内施用所述缀合物相关的毒性。可以被减轻、幸免或避免的毒性包括过敏反应样毒性。本公开内容提供了适于皮下施用的类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物的缀合物或其药物组合物，其用于通过治疗而治疗对象身体的方法中，同时减轻、幸免或避免与团注静脉内施用所述缀合物相关的毒性。可以被减轻、幸免或避免的毒性包括过敏反应样毒性。

本公开内容提供了制备下式的抗体缀合物的方法：

其中：

抗体是抗体构建体；

n选自1至20；

L

D选自类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)以及类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物或化合物的盐，

所述方法包括使D-L

本公开内容提供了制备显示的抗体缀合物的方法：

其中：

抗体是抗体构建体；

n选自1至20；

L

D选自类别A，式(IA)、(IB)、(IIA)、(IIB)、(IIIA)和(IIIB)以及类别B，式(IA)、(IB)或(IC)中任一种的化合物，

所述方法包括使L

在一些实施方案中，本文公开的化合物以不同的富集同位素形式使用，例如，以

除非另有说明，否则本文描述的结构旨在包括仅在一个或多个同位素富集的原子存在下不同的化合物。例如，具有除了用氘或氚替换氢或用富

本公开内容的化合物任选地在构成此类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可用诸如例如氘(

在某些实施方案中，本文公开的化合物使一些或所有的

氘取代的化合物使用诸如以下中所述的各种方法合成：Dean,Dennis C.；编者Recent Advances in the Synthesis and Applications of Radiolabeled Compoundsfor Drug Discovery and Development.[In:Curr.,Pharm.Des.,2000；6(10)]2000,110pp；George W.；Varma,Rajender S.The Synthesis of Radiolabeled Compounds viaOrganometallic Intermediates,Tetrahedron,1989,45(21),6601-21；和Evans,E.Anthony.Synthesis of radiolabeled compounds,J.Radioanal.Chem.,1981,64(1-2),9-32。

氘代原材料是容易获得的，并且进行本文所述的合成方法以提供含氘化合物的合成。大量的含氘试剂和结构单元可从化学供应商如Aldrich Chemical Co商购获得。

本公开内容的化合物还包括那些化合物的结晶形式和无定形形式，药学上可接受的盐以及具有相同类型活性的这些化合物的活性代谢物，包括例如化合物的多晶型物、假多晶型物(pseudopolymorphs)、溶剂化物、水合物、未溶剂化的多晶型物(包括无水物(anhydrates))、构象多晶型物和无定形形式，以及它们的混合物。

本公开内容包括了本文所述化合物的盐，特别是药学上可接受的盐。具有足够酸性、足够碱性或两种官能团的本公开内容的化合物可与多种无机碱及无机酸和有机酸中任一种反应以形成盐。可选地，固有带电的化合物，如具有季氮的那些，可与适当的抗衡离子(如，卤化物，如溴化物、氯化物或氟化物)形成盐。

本文所述的化合物可在一些情况下作为非对映体、对映体或其他立体异构体形式存在。本文提出的化合物包括所有非对映体形式、对映体形式和差向异构体形式以及它们的适当混合物。立体异构体的分离可通过色谱法进行或通过形成非对映体以及通过重结晶或色谱法分离进行、或其任何组合进行。(Jean Jacques,Andre Collet,Samuel H.Wilen,“Enantiomers,Racemates and Resolutions”,John Wiley And Sons,Inc.,1981，对于本公开内容，将其通过引用并入本文)。还可通过立体选择性合成获得立体异构体。

本文所述的方法和组合物包括使用无定形形式以及结晶形式(也被称为多晶型物)。本文所述的化合物可以呈药学上可接受的盐的形式。同样，这些具有相同活性类型的化合物的活性代谢物也包括在本公开内容的范围内。此外，本文所述的化合物可以以非溶剂化形式以及含药学上可接受的溶剂(如水、乙醇等)的溶剂化形式存在。本文提出的化合物的溶剂化形式也被认为是本文公开的。

在某些实施方案中，本文所述的化合物或化合物的盐可为连接至抗体构建体以形成缀合物的前药。术语“前药”旨在涵盖在生理条件下转化为活性化合物(例如TLR8、TLR7激动剂、其它TLR激动剂、STING激动剂、RIG-I样受体激动剂、c型凝集素受体激动剂或胞质DNA传感器激动剂)的化合物。用于制备前药的一种方法是包括一个或多个选择的部分，所述部分在生理条件下被水解或以其它方式裂解以显示所需的分子。在其它实施方案中，前药通过宿主动物如宿主动物体内特定靶细胞的酶促活性转化。

本文所述的化合物的前药形式被包括在权利要求的范围内，其中该前药在体内被代谢以产生本文所述的化合物。在一些情况下，一些本文所述的化合物可为另一种衍生物或活性化合物的前药。

在某些实施方案中，免疫刺激性化合物如TLR8激动剂或TLR7激动剂被修饰为具有掩蔽基团的前药，使得TLR8激动剂、TLR7激动剂或其它激动剂具有有限的活性或无活性直至其到达去除掩蔽基团以显示活性化合物的环境。例如，TLR8激动剂或TLR7激动剂可以在参与结合TLR8受体的活性位点的胺处被共价修饰，使得化合物不能以其修饰(前药)形式结合受体的活性位点。在此类实例中，掩蔽基团在如靶细胞相邻的胞内或胞外的递送位点特异性的生理条件下，如在酶促或酸性条件下被去除。由于溶酶体蛋白酶如组织蛋白酶和纤溶酶的作用，可以从本文所述的化合物或盐的胺中去除掩蔽基团。这些蛋白酶可以在某些肿瘤组织中以升高的水平存在。可以通过溶酶体酶去除掩蔽基团。溶酶体酶可以是例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶S、β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。

在某些实施方案中，胺掩蔽基团抑制化合物的胺基团与TLR8受体的残基的结合。胺掩蔽基团可以在生理条件下在细胞内去除，但仍与细胞外的胺共价结合。可用于抑制或减弱化合物的胺基团与TLR8受体的残基的结合的掩蔽基团包括，例如，肽和氨基甲酸酯(盐)。

用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和方法是本领域已知的，并且包括例如在R.Larock,Comprehensive Organic Transformations(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第二版(1991)；L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis(1994)；以及L.Paquette编辑,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis(1995)中所描述的那些。

连接子

所述缀合物包含将抗体构建体与至少一种免疫刺激性化合物，如髓样细胞激动剂连接的连接子。连接子可以是，例如，可裂解的或不可裂解的连接子。缀合物可以包含多个连接子。缀合物中的连接子可以是相同的连接子或不同的连接子。

如本领域技术人员将理解的，连接子通过在一个位置处形成与化合物的共价键并在另一个位置处形成抗体构建体的共价键来将免疫刺激性化合物，如髓样细胞激动剂连接至抗体构建体。共价键可通过连接子上的官能团与免疫刺激性化合物和抗体构建体上的官能团之间的反应形成。如本文所用，表述“连接子”可包括(i)未连接形式的连接子，其可包含能够将连接子与免疫刺激性化合物共价连接的官能团和能够将连接子与抗体构建体共价连接的官能团；(ii)部分连接形式的连接子，其可包含能够将连接子与抗体构建体共价连接的官能团，并可共价连接至免疫刺激性化合物，或反之亦然；和(iii)完全连接形式的连接子，其可共价连接至免疫刺激性化合物和抗体构建体两者。在一些特定的实施方案中，连接子上的官能团和在连接子和抗体构建体之间形成的共价键可以分别具体地表示为Rx和Rx’。

连接子可以是短的或长的，以及是可裂解的或不可裂解的。连接子可以含有具有不同特性的区段，如柔性区段或刚性区段、亲水性区段和/或疏水性区段。连接子可以对胞外环境化学稳定，例如在血流中化学稳定，和/或可以包括不稳定的连键。连接子可以包含被设计成在细胞内特异性地或非特异性地裂解和/或消耗(immolate)或以其它方式分解的连键。可裂解的连接子可以对特定位点处如溶酶体或胞外空间相邻的癌细胞的酶敏感。

可裂解的连接子可以包括缬氨酸-瓜氨酸肽、缬氨酸-丙氨酸肽、苯丙氨酸-赖氨酸或其它肽，如形成蛋白酶识别和裂解位点的肽。这样的含有肽的连接子可以含有五氟苯基基团。含有肽的连接子可以包括琥珀酰亚胺或马来酰亚胺基团。含有肽的连接子可以包括对氨基苯甲酸(PABA)基团。含有肽的连接子可以包括氨基苄氧基羰基(PABC)基团。含有肽的连接子可以包括PABA或PABC基团和五氟苯基基团。含有肽的连接子可以包括PABA或PABC基团和琥珀酰亚胺基团。含有肽的连接子可以包括PABA或PABC基团和马来酰亚胺基团。

不可裂解的连接子通常是蛋白酶不敏感的并且对细胞内过程不敏感。不可裂解的连接子可以包括马来酰亚胺基团。不可裂解的连接子可以包括琥珀酰亚胺基团。不可裂解的连接子可以是马来酰亚胺基-烷基-C(O)-连接子。不可裂解的连接子可以是马来酰亚胺基己酰基连接子。马来酰亚胺基己酰基连接子可以是N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧酸酯。马来酰亚胺基己酰基连接子可以包括琥珀酰亚胺基团。马来酰亚胺基己酰基连接子可以包括五氟苯基基团。

连接子可以是马来酰亚胺基己酰基基团和一个或多个聚乙二醇分子的组合。连接子可以是马来酰亚胺-PEG4连接子。连接子可以是含有琥珀酰亚胺基团的马来酰亚胺基己酰基连接子和一个或多个聚乙二醇分子的组合。连接子可以是含有五氟苯基基团的马来酰亚胺基己酰基连接子和一个或多个聚乙二醇分子的组合。连接子可以含有与聚乙二醇分子连接的马来酰亚胺，其中聚乙二醇可以允许更多的连接子柔性或者可以使用更长的连接子。

连接子可以是(马来酰亚胺基己酰基)-(缬氨酸-丙氨酸)-(对氨基苄氧基羰基)连接子。连接子可以是(马来酰亚胺基己酰基)-(缬氨酸-瓜氨酸)-(对氨基苄氧基羰基)连接子。连接子可以是(马来酰亚胺基己酰基)-(苯基丙氨酸-赖氨酸)-(对氨基苄氧基羰基)连接子。

连接子还可以含有亚烷基、亚烯基、亚炔基、聚醚、聚酯或聚酰胺、聚氨基酸、肽、多肽、可裂解的肽和/或氨基苄基氨基甲酸酯的区段。连接子可以在一端含有马来酰亚胺，并且在另一端含有N-羟基琥珀酰亚胺基酯。连接子可以含有N端胺乙酰化的赖氨酸和缬氨酸-瓜氨酸、缬氨酸-丙氨酸或苯基丙氨酸-赖氨酸裂解位点。连接子可以是由微生物转谷氨酰胺酶产生的连接，其中该连接可以在含胺的部分与经工程化以含有谷氨酰胺的部分之间产生，这是由于该酶催化了谷氨酰胺侧链的酰基基团和赖氨酸链的伯胺之间的键形成。连接子可以含有反应性伯胺。连接子可以是分选酶A连接子。可以通过将LXPTG识别基序(SEQ IDNO:1)与N-末端GGG基序融合以再生天然的酰胺键的分选酶A酶来产生分选酶A连接子。因此，产生的连接子可以将连接至LXPTG识别基序(SEQ ID NO：1)的部分与连接至N-末端GGG基序的部分连接。连接子可以是一个部分上的非天然氨基酸与肟键之间反应产生的连接，所述肟键是通过用另一部分上的烷氧基胺修饰酮基团而形成的。部分可以是缀合物的一部分。部分可以是抗体构建体的一部分，如抗体。部分可以是免疫刺激性化合物，如髓样细胞激动剂的一部分。部分可以是结合结构域的一部分。连接子可以是未取代的，或例如被取代基取代的。取代基可包括例如，羟基基团、氨基基团、硝基基团、氰基基团、叠氮基基团、羧基基团、甲醛基团、亚胺基团、烷基基团、烯基基团、炔基基团、烷氧基基团、酰基基团、酰氧基基团、酰胺基团和酯基团。

连接子可以是多价的，使得它将多于一种的免疫刺激性化合物共价连接至抗体构建体上的单个位点，或者是单价的，使得它将单一免疫刺激性化合物共价连接至抗体构建体上的单个位点。

描述了可用于将许多免疫刺激性化合物连接至缀合物的抗体构建体的示例性多价连接子。例如，

为了利用上述方案中描述的

作为示例而非限制，下面描述可以包括在本文所述的缀合物中的一些可裂解的和不可裂解的连接子。

可裂解的连接子可以是在体外和体内可裂解的。可裂解的连接子可以包括化学或酶促不稳定的或可降解的连键。可裂解的连接子可以依靠细胞内的过程来释放免疫刺激性化合物，如在细胞质中还原、暴露至溶酶体中的酸性条件，或者通过细胞内的特定蛋白酶或其它酶进行裂解。可裂解的连接子可以掺入一个或多个化学键，其是化学上或酶促可裂解的，而连接子的其余部分可以是不可裂解的。

连接子可以含有化学不稳定基团如腙和/或二硫化物基团。包含化学不稳定基团的连接子可以利用血浆和一些细胞质隔室之间的差异特性。可以促进免疫刺激性化合物释放含有肼的连接子的细胞内条件可以是核内体和溶酶体的酸性环境，而含有二硫化物的连接子可以在可以含有高硫醇浓度例如谷胱甘肽的细胞溶质中被还原。通过在化学不稳定基团附近使用取代基引入空间位阻，可以增加含有化学不稳定基团的连接子的血浆稳定性。

酸不稳定基团，如腙，可以在血液中性pH环境(pH 7.3-7.5)中的全身循环期间保持完整，并且一旦缀合物被内化到细胞内的温和酸性核内体(pH 5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)隔室中就可以经历水解并且可以释放免疫刺激性化合物。这种pH依赖性释放机制可能与免疫刺激性化合物的非特异性释放有关。为了增加连接子的腙基团的稳定性，可以通过化学修饰例如取代来改变连接子，从而允许调节以在溶酶体中实现更有效的释放，同时使循环损失最小化。

含腙的连接子可以含有另外的裂解位点，如另外的酸不稳定裂解位点和/或酶促不稳定的裂解位点。包括示例性含腙连接子的缀合物可以包括例如以下结构：

其中分别地，D是免疫刺激性化合物，以及Ab是抗体构建体，以及n表示与抗体构建体结合的化合物-结合的连接子(LP)的数量。在某些连接子，如连接子(Ia)中，连接子可以包含两个可裂解的基团、二硫化物和腙部分。对于这样的连接子，未修饰的游离免疫刺激性化合物的有效释放可能需要酸性pH或二硫化物还原和酸性pH。具有单个腙裂解位点的连接子如(Ib)和(Ic)可以是有效的。

可以包括在连接子中的其它酸不稳定基团包括含顺式-乌头酰基的连接子。顺式-乌头酰基化学作用可以使用与酰胺键并置的羧酸以在酸性条件下加速酰胺水解。

可裂解的连接子还可以包含二硫化物基团。二硫化物在生理pH下可以是热力学稳定的，并且可以设计成在细胞内内化后释放免疫刺激性化合物，其中与胞外环境相比，胞质溶胶可以提供显著更还原的环境。二硫键的断裂可能需要存在细胞质硫醇辅因子，如(还原的)谷胱甘肽(GSH)，使得含二硫化物的连接子在循环中可以合理稳定，从而在胞质溶胶中选择性地释放免疫刺激性化合物。细胞内酶蛋白二硫化物异构酶或能够裂解二硫键的类似酶也可以促进细胞内二硫键的优先裂解。GSH可以以0.5-10mM的浓度范围存在于细胞中，相较而言GSH或半胱氨酸(最丰富的低分子量硫醇)的浓度显著较低，在循环中为大约5μM。肿瘤细胞(在那不规则的血流可导致缺氧状态)可导致还原酶的活性增强，并且因此可导致甚至更高的谷胱甘肽浓度。含有二硫化物的连接子的体内稳定性可以通过连接子的化学修饰来增强，例如，使用邻近二硫键的空间位阻。

免疫刺激性缀合物(包括含二硫化物的连接子)可以包括以下结构：

其中分别地，D是免疫刺激性化合物，以及Ab是抗体构建体，n表示与抗体构建体结合的连接子结合的化合物的数量，以及R在每次出现时独立地选自例如氢或烷基。增加邻近二硫键的空间位阻可以增加连接子的稳定性。当一个或多个R基团选自低级烷基如甲基时，诸如(IIa)和(IIc)的结构可以显示出增加的体内稳定性。

可以使用的另一种类型的连接子是被酶特异性裂解的连接子。例如，连接子可以被溶酶体酶裂解。这样的连接子可以是基于肽的，或者可以包括可以作为酶底物的肽区。基于肽的连接子在血浆和胞外环境中比化学不稳定的连接子更稳定。

肽键可以具有良好的血清稳定性，因为溶酶体蛋白水解酶由于内源性抑制剂以及与溶酶体相比血液不利的pH值而在血液中具有非常低的活性。由于溶酶体蛋白酶例如组织蛋白酶和纤溶酶的作用，可以发生从抗体构建体释放免疫刺激性化合物。这些蛋白酶可以以升高的水平存在于某些肿瘤组织中。连接子可以被溶酶体酶裂解。溶酶体酶可以是例如组织蛋白酶B、组织蛋白酶S、β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。

可裂解的肽可以选自四肽如Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu或二肽如Val-Cit、Val-Ala和Phe-Lys或其它肽。与较长的肽相比，二肽可以具有较低的疏水性，这取决于肽的组成。

多种基于二肽的可裂解连接子可以用于本文所述的免疫刺激性缀合物中。

酶促可裂解的连接子可以包括自消(self-immolative)间隔基，以将免疫刺激性化合物与酶促裂解位点在空间上分开。免疫刺激性化合物与肽连接子的直接连接可导致免疫刺激性化合物或免疫刺激性化合物的氨基酸加合物的蛋白水解释放，从而损害其活性。自消间隔基的使用可以允许在酰胺键水解后消除完全活性的化学未修饰的免疫刺激性化合物。

一种自消间隔基可以是双功能性对氨基苯甲醇基团(PABA)，其可以通过氨基基团与肽连接，形成酰胺键，而含胺的免疫刺激性化合物可以通过氨基甲酸酯官能团与连接子的苄基型羟基基团连接(以得到对酰氨基苄基氨基甲酸酯，PABC)。所得的前免疫刺激性化合物可以在蛋白酶介导的裂解后被活化，导致1,6-消除反应，从而释放未修饰的免疫刺激性化合物、二氧化碳和连接子的残余物。以下方案描述了对酰氨基苄基氨基甲酸酯的片段化和免疫刺激性化合物的释放：

其中X-D表示未修饰的免疫刺激性化合物并且与“肽”相邻的羰基是所述肽的一部分。还描述了这种自消基团的杂环变体。

酶促可裂解的连接子可以是基于β-葡糖醛酸的连接子。通过溶酶体酶β-葡糖醛酸酶裂解β-葡糖苷酸糖苷键，可以实现免疫刺激性化合物的简易释放。这种酶可以大量存在于溶酶体内，并且可以在一些肿瘤类型中过表达，而细胞外的酶活性可以很低。由于β-葡糖苷酸的亲水性质，基于β-葡糖醛酸的连接子可以用于避免免疫刺激性缀合物发生聚集的倾向。在某些实施方案中，基于β-葡糖醛酸的连接子可以将抗体构建体与疏水性免疫刺激性化合物连接。以下方案描述了含有基于β-葡糖醛酸的连接子的免疫刺激性缀合物释放免疫刺激性化合物(D)：

其中Ab表示抗体构建体。

已经描述了用于将药物如奥里斯他汀(auristatins)、喜树碱和多柔比星类似物、CBI小沟结合物和普赛博林(psymberin)与抗体连接的多种可裂解的基于β-葡糖醛酸的连接子。这些基于β-葡糖醛酸的连接子可以用于本文所述的缀合物中。在某些实施方案中，酶促可裂解的连接子是基于β-半乳糖苷的连接子。β-半乳糖苷大量存在于溶酶体内，而细胞外的酶活性较低。

另外，含有酚基的免疫刺激性化合物可以通过酚羟基氧与连接子共价键合。一种这样的连接子依赖于这样的方法，其中二氨基-乙烷“空间连接”与传统的“基于PABO”的自消基团组合使用以递送酚。

可裂解的连接子可以包括不可裂解的部分或区段，和/或可裂解的区段或部分可以包括在在其它方面不可裂解的连接子中以使其可裂解。仅举例来说，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物可以包含聚合物主链中的可裂解基团。例如，聚乙二醇或聚合物连接子可以包含一个或多个可裂解基团，如二硫化物、腙或二肽。

可以包含在连接子中的其它可降解的连键可以包括通过PEG羧酸或活化的PEG羧酸与免疫刺激性化合物上的醇基团反应形成的酯连键，其中这样的酯基团可以在生理条件下水解，以释放出免疫刺激性化合物。可水解降解的连键可以包括但不限于碳酸酯连键；由胺和醛反应产生的亚胺连键；通过使醇与磷酸基团反应形成的磷酸酯键；乙缩醛连键，即醛和醇的反应产物；原酸酯连键，即甲酸酯和醇的反应产物；以及由亚磷酰胺基团，包括但不限于在聚合物的末端和寡核苷酸的5'羟基基团形成的寡核苷酸连键。

连接子可以含有酶促可裂解的肽部分，例如，包含结构式(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)或(IIId)或者其药学上可接受的盐的连接子：

其中：“肽”表示由溶酶体酶可裂解的肽(以N→C取向示出，其中肽包括氨基和羧基“末端”)；T表示包含一个或多个乙二醇单元或亚烷基链或它们的组合的聚合物；R

在某些实施方案中，肽可以选自天然氨基酸、非天然氨基酸或它们的组合。在某些实施方案中，肽可以选自三肽或二肽。在特定实施方案中，二肽可以包含L-氨基酸并且选自：Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Lys-Phe；Val-Lys；Lys-Val；Ala-Lys；Lys-Ala；Phe-Cit；Cit-Phe；Leu-Cit；Cit-Leu；Ile-Cit；Cit-Ile；Phe-Arg；Arg-Phe；Cit-Trp；和Trp-Cit或其盐。

根据结构式(IIIa)的连接子的示例性实施方案如下所示(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的反应性基团)：

其中

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(IIIb)、(IIIc)或(IIId)的连接子的示例性实施方案可以包括下面所示的连接子(如所示，连接子可以包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的反应性基团):

其中

连接子可以含有酶促可裂解的糖部分，例如，包含结构式(IVa)、(IVb)、(IVc)、(IVd)或(IVe)或者其药学上可接受的盐的连接子：

其中：q是0或1；r是0或1；X

可以包括在本文所述的免疫刺激性缀合物中的根据结构式(IVa)的连接子的示例性实施方案可以包括下面所示的连接子(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(IVb)的连接子的示例性实施方案包括下面所示的连接子(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(IVc)的连接子的示例性实施方案包括下面所示的连接子(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(IVd)的连接子的示例性实施方案包括下面所示的连接子(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(IVe)的连接子的示例性实施方案包括下面所示的连接子(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

尽管可裂解的连接子可以提供某些优点，但包含本文所述的缀合物的连接子不需要是可裂解的。对于不可裂解的连接子，免疫刺激性化合物释放可能不依赖于血浆和一些细胞质隔室之间的差异特性。免疫刺激性化合物的释放可以在经由抗原-介导的胞吞作用的免疫刺激性缀合物的内化和递送至溶酶体隔室后发生，其中抗体构建体可以通过细胞内蛋白水解降解被降解到氨基酸的水平。该过程可以释放出免疫刺激性化合物衍生物，它由免疫刺激性化合物、连接子和氨基酸残基或连接子所共价连接的残基形成。与具有可裂解连接子的免疫刺激性缀合物相比，具有不可裂解连接子的来自免疫刺激性缀合物的免疫刺激性化合物衍生物可以具有更高的亲水性和更低的膜渗透性，这可导致旁观者效应减少和非特异性毒性减少。具有不可裂解连接子的免疫刺激性缀合物可以在循环中具有比具有可裂解连接子的免疫刺激性缀合物更高的稳定性。不可裂解的连接子可以包括亚烷基链，或者可以是聚合的，诸如例如，基于聚亚烷基二醇聚合物，酰胺聚合物，或者可以包括亚烷基链、聚亚烷基二醇和/或酰胺聚合物的区段。连接子可以含有具有1至6个乙二醇单元的聚乙二醇区段。

连接子可以是体内不可裂解的，例如根据下式或其盐的连接子：

其中：R

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(Va)-(Vf)的连接子的示例性实施方案包括下面所示的连接子(如所示，连接子包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团，以及

用于将连接子与抗体构建体连接的连接基团本质上可以是亲电子的并且包括例如马来酰亚胺基团、炔烃、炔酸酯、丙二烯和丙二烯酯、活化的二硫化物、活性酯如NHS酯和HOBt酯、卤代甲酸盐(酯)、酰基卤、烷基卤和苄基卤如卤代乙酰胺。还存在与“自稳定”马来酰亚胺和“桥接二硫化物”相关的新兴技术，其可以根据本公开内容使用。

马来酰亚胺基团经常用于制备缀合物，因为它们对与缀合物的抗体的硫醇基团(例如，半胱氨酸基团)反应具有特异性。抗体的硫醇基团与具有包含马来酰亚胺基团的连接子的药物之间的反应按照以下方案进行：

也可以发生导致从硫取代的(thio-substituted)琥珀酰亚胺消除马来酰亚胺的逆反应。这种逆反应是不期望的，因为马来酰亚胺基团可能随后与另一种可用的硫醇基团，如在体内具有可用的半胱氨酸的其蛋白质反应。因此，逆反应可以破坏缀合物的特异性。防止逆反应的一种方法是将碱性基团掺入上述方案中所示的连接基团中。不希望受理论束缚，碱性基团的存在可以增加附近水分子的亲核性，以促进琥珀酰亚胺基团的开环水解。连接基团的水解形式在血浆蛋白存在下对去缀合具有抗性。所谓的“自稳定”连接子为缀合物提供了改进的稳定性。以下示出了代表性示意图：

上面示意表示的水解反应可以发生在琥珀酰亚胺基团的羰基基团处。因此，可能会产生两种可能的异构体，如下所示：

可以修改碱的特性以及碱与马来酰亚胺基团之间的距离，以调节硫取代的琥珀酰亚胺基团的水解速率，并通过例如提高缀合物的特异性和稳定性来优化缀合物至靶标的递送。

适用于在缀合至抗体构建体之前包含在本文所述的连接子(如具有马来酰亚胺基团的本文所述的任何连接子)中的碱可以促进在将抗体构建体与连接子缀合后形成的附近琥珀酰亚胺基团的水解。碱可以包括例如胺(如，-N(R

具有马来酰亚胺基团的本文所述的连接子可以包括诸如但不限于以下的吸电子基团：-C(O)R、＝O、-CN、-NO

自稳定连接子的实例在如美国专利公开号2013/0309256中提供，其连接子通过引用并入本文。应理解，与免疫刺激性化合物结合使用的自稳定连接子可以等同地描述为包括未取代的马来酰亚胺的连接子、包括硫取代的琥珀酰亚胺的连接子，或水解开环的包括硫取代的琥珀酰亚胺的连接子。

在某些实施方案中，连接子包含选自以下的稳定连接子部分：

在上面提供的方案中，底部结构可以被称为(马来酰亚胺基)-DPR-Val-Cit-PAB，其中DPR是指二氨基丙酸，Val是指缬氨酸，Cit是指瓜氨酸，并且PAB是指对氨基苄基羰基。

用于桥接来源于天然铰链二硫键还原的一对巯基基团的方法已经被公开，并且在下面的示意图中描述。该方法的一个优点是能够通过完全还原IgG(以从链间二硫化物得到4对巯基)，然后与4当量的烷基化剂反应来合成同质DAR4缀合物。据称含有“桥接二硫化物”的缀合物具有增加的稳定性。

类似地，如下所述，已经开发了能够桥接一对巯基基团的马来酰亚胺衍生物。

连接子可以含有以下结构式(VIa)、(VIb)或(VIc)：

或其盐，其中：R

可以包括在本文所述的缀合物中的根据结构式(VIa)和(VIb)的连接子的示例性实施方案可以包括下面所示的连接子(如所示，连接子可以包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

可以包括在本文所述的免疫刺激性缀合物中的根据结构式(VIc)的连接子的示例性实施方案可以包括下面所示的连接子(如所示，连接子可以包括适用于将连接子与抗体构建体共价连接的基团)：

其中

连接子可以在任何合适的位置连接至抗体构建体。在选择连接位点时要考虑的因素包括连接子是可裂解的还是不可裂解的，用于连接至抗体构建体的连接子的反应性基团，免疫刺激性化合物的化学性质以及与连接子和抗体构建体上的反应性位点的相容性，以及连接位点对Fc结构域的功能活性的影响。连接子可以连接至抗体构建体的氨基酸序列的末端，或者可以连接至抗体构建体的氨基酸的侧链，如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链。连接子可以结合抗体构建体的Fc结构域或Fc区的氨基酸序列的末端，或者可以结合抗体构建体的Fc结构域的氨基酸的侧链，如赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸残基或谷氨酸残基的侧链。

在一些实施方案中，连接子连接至抗体Fc结构域的铰链半胱氨酸。连接子可以在轻链恒定结构域赖氨酸处与抗体构建体连接。连接子可以在轻链中的工程化的半胱氨酸处与抗体构建体连接。连接子可以在工程化的轻链谷氨酰胺处与抗体构建体连接。连接子可以在工程化到轻链中的非天然氨基酸处与抗体构建体连接。连接子可以在重链恒定结构域赖氨酸处与抗体构建体连接。连接子可以在重链中的工程化的半胱氨酸处与抗体构建体连接。连接子可以在工程化的重链谷氨酰胺处与抗体构建体连接。连接子可以在工程化到重链中的非天然氨基酸处与抗体构建体连接。氨基酸可以被工程化到如本文所述或如本领域技术人员已知的抗体构建体的氨基酸序列，并且可以连接至缀合物的连接子。可以将工程化的氨基酸加入到现有氨基酸的序列中。可以用工程化的氨基酸取代一系列氨基酸的一个或多个现有氨基酸。

连接子可以通过巯基连接至抗体构建体。连接子可以通过伯胺连接至抗体构建体。连接子可以是抗体构建体上的非天然氨基酸与肟键反应产生的连接，所述肟键是通过用免疫刺激性化合物上的烷氧基胺修饰酮基而形成的。

如技术人员已知的，选择用于特定缀合物的连接子可受多种因素的影响，所述因素包括但不限于与抗体构建体的连接点(如，lys、cys或其它氨基酸残基)、药物药效团的结构限制和药物的亲脂性。针对缀合物选择的具体连接子应寻求平衡特定抗体构建体/药物组合的这些不同因素。

例如，已经观察到缀合物实现对抗原-阳性肿瘤细胞附近存在的旁观者抗原-阴性细胞的杀伤。通过缀合物杀伤旁观者细胞的机制表明，在缀合物的细胞内加工过程中形成的代谢产物可能起作用。由抗原-阳性细胞中的缀合物代谢产生的中性细胞毒性代谢物似乎在旁观者细胞杀灭中发挥作用，同时可以防止带电的代谢物扩散穿过膜进入培养基，或培养基穿过膜，并因此不能影响旁观者杀伤。在某些实施方案中，选择连接子以减弱由缀合物的细胞代谢物引起的旁观者效应。在某些实施方案中，选择连接子以增加旁观者效应。

连接子或连接子-化合物的特性也可以在使用和/或储存条件下影响缀合物的聚集。通常，文献中报道的缀合物含有每个抗体分子不超过3-4个药物分子。试图获得更高的药物抗体比(“DAR”)通常是失败的，特别是如果药物和连接子都是疏水的，这是由于缀合物聚集。在许多情况下，作为增加效力的手段，高于3-4的DAR可以是有益的。在免疫刺激性化合物本质上更疏水的情况下，可能可取的是选择相对亲水的连接子作为减少缀合物聚集的手段，尤其是在需要大于3-4的DAR的情况下。因此，在某些实施方案中，连接子掺入在储存和/或使用过程中减少缀合物聚集的化学部分。连接子可以掺入极性或亲水基团，如带电基团或在生理pH下带电荷的基团，以减少缀合物的聚集。例如，连接子可以掺入带电基团，如在生理pH下去质子化如羧酸盐或质子化如胺的盐或基团。

在特定实施方案中，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)所测定的，在储存或使用期间，缀合物的聚集小于约40％。在特定实施方案中，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)所测定的，在储存或使用期间，缀合物的聚集小于35％，如小于约30％、如小于约25％、如小于约20％、如小于约15％、如小于约10％、如小于约5％、如小于约4％或甚至更低。

髓样细胞激动剂-连接子的示例性合成

可以在连接至抗体构建体以形成如本文所述的缀合物之前，通过各种方法合成髓样细胞激动剂-连接子化合物。例如，可以如方案B1所示合成a。

方案B1：

可以将已被活化用于酰胺键形成的聚乙二醇化羧酸(i)与适当取代的含胺髓样细胞激动剂反应，得到中间体酰胺。活化酯(ii)的形成可通过在偶联剂如二异丙基碳二亚胺(DIC)存在下，使用诸如N-羟基琥珀酰亚胺或五氟苯酚的试剂使含中间体酰胺的羧酸反应以提供化合物(ii)来实现。

作为另一个实例，可以如方案B2中所示合成髓样细胞激动剂-连接子。

方案B2：

可以使活化的碳酸酯如(i)与适当取代的含胺的髓样细胞激动剂反应以得到氨基甲酸酯(ii)，可以使用基于R

作为另外的实例，可以如方案B3中所示合成髓样细胞激动剂-连接子。

方案B3：

可以使活化的羧酸酯如(i-a)与适当取代的含胺的髓样细胞激动剂反应以得到酰胺(ii)。可选地，可以在酰胺键形成剂(如二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，将(i-b)型羧酸与适当取代的含胺的髓样细胞激动剂偶联，以提供所需的髓样细胞激动剂-连接子。

作为另外的实例，可以如方案B4中所示合成髓样细胞激动剂-连接子。

方案B4：

可以使活化的碳酸酯如(i)与适当取代的含胺的髓样细胞激动剂反应以得到氨基甲酸酯(ii)作为靶标髓样细胞激动剂。

作为另外的实例，可以如方案B5中所示合成髓样细胞激动剂-连接子。

方案B5：

可以使活化的羧酸如(i-a、i-b、i-c)与适当取代的含胺的髓样细胞激动剂反应以得到酰胺(ii-a、ii-b、ii-c)作为靶标髓样细胞激动剂。

这些髓样细胞激动剂-连接子可以通过各种方法来制备。应当理解，本领域技术人员可以通过类似方法或通过组合本领域技术人员已知的其它方法来制备这些化合物。还应理解，本领域技术人员将能够以与本文所述类似的方式通过使用适当的原材料并根据需要修改合成途径来进行制备。原材料和试剂可从商业供应商获得或根据本领域技术人员已知的来源合成或如本文所述制备。

缀合物

如本文所述的缀合物包含抗体构建体以及与至少一种免疫刺激性化合物如髓样细胞激动剂或其它激动剂(例如，TLR8激动剂、TLR7激动剂、其它TLR激动剂、STING激动剂、RIG-I样受体激动剂、c型凝集素受体激动剂或胞质DNA传感器激动剂)连接的至少一个连接子。在一些方面，本公开内容提供了由式I表示的缀合物：

其中：

A是抗体构建体，

L是连接子；

D

n选自1至20；以及

z选自1至20。

在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是髓样细胞激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是TLR8激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是TLR7激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是TLR3激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是TLR4激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是TLR5激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是TLR9激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是STING激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是RIG-I样受体激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是c型凝集素受体激动剂。在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是胞质DNA传感器激动剂。

在一些方面，本公开内容提供了包含至少一种免疫刺激性化合物(例如，化合物或其盐)、抗体构建体和至少一种连接子的缀合物，其中每种免疫刺激性化合物通过连接子连接，即，共价结合至抗体构建体。连接子可以选自可裂解的连接子或不可裂解的连接子。在一些实施方案中，连接子是可裂解的。在其它实施方案中，连接子是不可裂解的。在本申请的前面部分中进一步描述了连接子，其中的任一个可用于将抗体构建体连接至免疫刺激性化合物。

在缀合物中，载药量由z、每个抗体构建体的免疫刺激性化合物-连接子分子的数量或每个抗体构建体的免疫刺激性化合物的数量表示，这取决于特定缀合物。根据上下文，z可以表示每个抗体构建体的免疫刺激性化合物(-连接子)分子的平均数量，还被称为平均载药量。z的范围可以是1-20、1-50或1-100。在一些缀合物中，z优选是1至8。在一些优选的实施方案中，当z表示平均载药量时，z的范围为约2至约5。在一些实施方案中，z是约2、约3、约4或约5。缀合物的制剂中每个抗体构建体的免疫刺激性化合物的平均数量可以通过常规手段如质谱、液相色谱/质谱(LC/MS)、HIC、ELISA测定和HPLC来表征。

许多缀合物与本文的公开内容一致。所述缀合物通常包含共价结合靶向部分或抗体构建体的免疫刺激性化合物，所述靶向部分或抗体构建体将所述缀合物定位至靶组织、细胞群或细胞。靶向部分可以包含抗体可变结构域的全部或部分，尽管也考虑了替代的靶向部分。靶向部分或抗体构建体直接地或通过将免疫刺激性化合物拴到靶向部分或抗体构建体的连接子共价连接至每种免疫刺激性化合物。本文列出的抗体以及本文列出的或本领域技术人员以其它方式已知的抗原或其表位的抗体与本文公开的缀合物一致。

一些示例性缀合物如下。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种免疫刺激性化合物和任选地至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种TLR7激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种TLR8激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种化合物A TLR8激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种化合物B TLR7激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种TLR3激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种TLR4激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种TLR5激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种TLR9激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种STING激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种RIG-I激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种c型凝集素受体激动剂和至少一种连接子。缀合物可以包含抗体构建体、至少一种胞质DNA传感器激动剂和至少一种连接子。

在一些实施方案中，所述免疫刺激性化合物是髓样细胞激动剂。许多髓样细胞激动剂与本文公开内容如TLR8激动剂一致。示例性的TLR8激动剂选自化合物1.1-1.2、1.4-1.20、1.23-1.27、1.29-1.46、1.48和1.50-1.67(实施例)。在一些实施方案中，髓样细胞激动剂-连接子化合物(连接子-有效载荷)选自连接子-有效载荷2.1-2.17(实施例)中的任一种。

本文所述的免疫刺激性缀合物可以活化、刺激或增强针对疾病病况的细胞的免疫应答，同时幸免、减轻或避免与免疫刺激性缀合物的团注静脉内施用相关的毒性。可以在体外通过将免疫细胞(例如髓样细胞)与缀合物靶向的细胞共培养以及测量细胞因子释放、趋化因子释放、免疫细胞增殖、免疫细胞活化标志物的上调和/或ADCC来测量免疫刺激性缀合物(如髓样细胞激动剂)对免疫应答的活化、刺激或增强。可以通过在施用缀合物与靶细胞、髓样细胞和其它免疫细胞之后测定共培养物中剩余靶细胞的百分比来测量ADCC。在一些实施方案中，免疫刺激性缀合物可以活化或刺激免疫细胞活性，如通过体外测定(如细胞因子释放测定)、通过检测活化标志物(例如MHC II类标志物)或本领域已知的其它测定所确定的。在一些实施方案中，免疫刺激性缀合物具有100nM或更小的EC50，如通过细胞因子释放测定所确定的。在一些实施方案中，免疫刺激性缀合物具有50nM或更小的EC50，如通过细胞因子释放测定所确定的。在一些实施方案中，免疫刺激性缀合物具有10nM或更小的EC50，如通过细胞因子释放测定所确定的。在一些实施方案中，免疫刺激性缀合物具有1mM或更小的EC50。

药物制剂

本文所述的缀合物可用作用于向有需要的对象施用(例如皮下、缓慢IV输注)的药物组合物。药物组合物可以包含本文所述的缀合物和一种或多种适于皮下施用的药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以包含本文所述的任何缀合物。药物组合物还可以包含缓冲剂、碳水化合物和/或防腐剂，这视情况而定。可以例如通过冻干缀合物、混合、溶解、乳化、封装或包埋缀合物来制备包含缀合物的药物组合物。药物组合物还可以包含呈游离碱形式或药学上可接受的盐形式的本文所述的缀合物。

用于配制药物组合物的方法可以包括用一种或多种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体配制本文所述的缀合物中的任一种以形成固体、半固体或液体组合物，用于皮下施用。固体组合物可包以括例如粉剂，并且在一些方面，固体组合物还含有无毒的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和其它药学上可接受的添加剂。可选地，本文所述的组合物可以是冻干的或呈粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水复溶。

药物组合物和制剂可以是无菌的。可以通过无菌过滤进行过滤来完成灭菌。

本文所述的药物组合物可以被配制用于以注射剂施用，即皮下注射。用于注射的制剂的非限制性实例可包括油性或水性媒介物中的无菌混悬液、溶液或乳液。合适的油性媒介物可包括但不限于，亲脂性溶剂或媒介物例如脂肪油或合成的脂肪酸酯、或脂质体。水性注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质。混悬液还可含有合适的稳定剂。可选地，本文所述的药物组合物可以是冻干的或呈粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水复溶。

用于皮下施用的制剂已经描述于，例如，WO2018/136412、WO2016/036678、WO2013/173687、WO2013/096835、WO2012/151199、WO2011/147921、WO2011/104381、WO2011/090088、WO2011/017070、WO2011/012637、WO2009/084659和WO2004/091658中，其中的每一个在此通过引用以其整体并入。

所述缀合物可以与药学上可接受的媒介物联合以单位剂量的形式配制用于皮下施用。此类媒介物可以是固有无毒的和非治疗性的。媒介物可以是水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用非水性媒介物，如不挥发性油和油酸乙酯。媒介物可以含有少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质(例如，缓冲剂和防腐剂)。

治疗性应用

免疫刺激性缀合物及其药物组合物可用于本公开内容的方法中以治疗多种不同的对象，包括但不限于哺乳动物、人类、非人类哺乳动物、家养动物(如，实验室动物、家庭宠物或牲畜)、非驯化动物(如野生动物)、狗、猫、啮齿动物、小鼠、仓鼠、牛、鸟、鸡、鱼、猪、马、山羊、绵羊、兔及其任何组合。

免疫刺激性缀合物及其药物组合物可以在本文所述的方法中用作治疗剂，例如作为可以以有效方案向有需要的对象施用以实现治疗效果的治疗，同时减轻、幸免或避免与缀合物的团注重复静脉内施用相关的毒性。可以被减轻、幸免或避免的毒性包括过敏反应样毒性。可以通过减少、抑制、缓解、减轻或根除疾病状态(包括但不限于其一种或多种症状)在对象中获得治疗效果。在患有疾病或病况、或者表现出其早期症状、或者表现出或在其它方面疑似处于或接近疾病或病况的早期阶段的对象中的治疗效果可以通过减少、抑制、预防、延迟、缓解、减轻或根除所述病况或疾病、或者病况前或疾病前状态来获得。在各种实施方案中，有效方案导致在每次施用免疫刺激性缀合物后免疫刺激性缀合物的Tmax大于约4小时。在一些实施方案中，有效方案导致在每次施用免疫刺激性缀合物后Tmax大于约6小时、大于约8小时、大于约10小时、大于约12小时或大于约15小时。

在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对用TLR激动剂可治疗的疾病(例如癌症或病毒性疾病)的免疫应答。缀合物的抗体构建体识别与疾病或疾病状态相关的抗原。

在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对病况疾病的细胞的免疫应答。在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物，以活化、刺激或增强针对癌细胞的免疫应答，其中所述癌细胞表达被缀合物的抗体构建体识别的肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对表达被缀合物的抗体构建体识别的肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答。在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对表达被缀合物的抗体构建体识别的肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答。

在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对实体瘤(如肉瘤、癌或淋巴瘤)的肿瘤细胞的免疫应答。所述缀合物的抗体构建体识别靶细胞，如肿瘤细胞上的抗原。在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对肉瘤的肿瘤细胞的免疫应答。所述缀合物的抗体构建体识别肉瘤细胞上的抗原。在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对癌的肿瘤细胞的免疫应答。所述缀合物的抗体构建体识别肿瘤细胞上的抗原。在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对淋巴瘤的肿瘤细胞的免疫应答。所述缀合物的抗体构建体识别肿瘤细胞上的抗原。

在某些实施方案中，所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对实体瘤的肿瘤细胞，如脑、乳腺、肺、肝、肾、胰腺、结肠直肠、卵巢、头颈、骨、皮肤、间皮瘤、膀胱、胃、前列腺、甲状腺、子宫或宫颈/子宫内膜细胞的免疫应答。所述缀合物的抗体构建体识别肿瘤细胞上的抗原。

在某些实施方案中，所述癌症是表达HER2的癌症，并且所述方法包括以有效方案向有需要的对象皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物或其药物组合物以活化、刺激或增强针对表达HER2的癌症的细胞的免疫应答。在一些方面，表达HER2的癌症表达以如通过免疫组织化学测定的2+或3+的水平表达HER2。

在一些实施方案中，可以被幸免、减轻或避免的与免疫刺激性缀合物的静脉内施用相关的毒性是过敏反应样毒性。此类毒性可能与免疫刺激性缀合物的单次或多次静脉内施用相关。如本文所用，“减轻(alleviating)”或“减轻(to alleviate)”毒性是指使毒性不那么严重。术语“幸免(sparing)”或“幸免(to spare)”是指显著降低毒性以及降低对对象的危害。

在一些实施方案中，与免疫刺激性缀合物的静脉内施用相关的过敏反应样应答的毒性被幸免、减轻或避免。过敏反应样应答是指在不存在显著的细胞因子释放的情况下的诸如低血压、气道狭窄、低体温症和/或血管渗漏综合征的症状。如本文所用，过敏反应样应答不同于由IgG或IgE应答引起的经典过敏反应。在一些实施方案中，与免疫刺激性缀合物的重复团注静脉内施用相关的4级或更高级过敏反应样不良事件被幸免、减轻或避免。在一些实施方案中，与免疫刺激性缀合物的重复团注静脉内施用相关的3级或更高级过敏反应样不良事件被幸免、减轻或避免。在一些实施方案中，与免疫刺激性缀合物的重复团注静脉内施用相关的2级或更高级过敏反应样不良事件被减轻、幸免或避免。在一些实施方案中，与免疫刺激性缀合物的重复团注静脉内施用相关的1级或更高级过敏反应样不良事件被减轻、幸免或避免。

本领域普通技术人员将理解，向有需要的对象施用本文所述的药物组合物或缀合物的量、持续时间和频率取决于若干因素，包括但不限于，例如对象的健康、对象的具体疾病或病况、对象的具体疾病或病况的等级或水平、对象正在或已经施用的另外治疗剂等。

在实施本文所述方法的一些方面，以至少两个或至少三个周期的有效方案皮下施用或通过缓慢IV输注施用免疫刺激性缀合物。每个周期可以在周期之间任选地包括休息期(resting stage)。施用周期可以是任何合适的长度。在一些实施方案中，每个周期是一周(7天)、10天、每两周(14天或两周)、每三周(21天)或每四周(28天)。在一些实施方案中，每个周期是一个月。在一些实施方案中，至少两个剂量的免疫刺激性缀合物以超过7天的间隔或超过10天的间隔施用。在一些实施方案中，在初始剂量的免疫刺激性缀合物之后超出7天或超出10天施用至少一个剂量的免疫刺激性缀合物。

每个周期内免疫刺激性缀合物或其药物组合物的剂量是适于实现治疗效果的量。周期内的剂量可以是单剂量或分剂量(即，周期内的多剂量)。在一些实施方案中，当待施用的药物组合物的体积大于通常通过所选途径以单剂量施用的体积时，施用分剂量。例如，通常皮下施用的最大体积是约1.5mL，因为认为更大的体积与注射部位疼痛和注射部位的其它不良事件相关。因此，在一些实施方案中，当待皮下施用的药物组合物的量大于约1.5mL时，施用分剂量，这意味着将体积分成例如各自小于1.5mL的较小体积，以及将较小体积各自在对象身体上的不同部位注射。在某些实施方案中，一个周期内免疫刺激性缀合物或其药物组合物的总剂量是约0.1至约10mg/kg。在一些实施方案中，总剂量是约0.5至约7.5mg/kg。在一些实施方案中，总剂量是约0.5至约5mg/kg。在一些实施方案中，总剂量是约0.5至约4mg/kg。在一些实施方案中，总剂量是约0.5至约3.5mg/kg。在一些实施方案中，总剂量是约0.5至约2mg/kg。

使用本文公开的免疫刺激性缀合物的本文公开的方法涉及依次施用(例如，依次皮下施用)多个剂量的免疫刺激性缀合物。这种依次施用避免了与免疫刺激性缀合物的重复团注施用相关的毒性。在一些方面，免疫刺激性缀合物以有效方案施用，所述有效方案导致在每次施用免疫刺激性缀合物后大于约4小时的对象中的免疫刺激性缀合物的Tmax。在一些方面，在约72小时时或之前、在约48小时时或之前、在约30小时时或之前、在约24小时时或之前、或者在约16小时时或之前达到Tmax。

免疫刺激性化合物，特别是作为本文一般性论述的缀合物的组分递送的免疫刺激性化合物，通过缀合至抗体构建体，如抗体可变结构域，或者通过选择性地结合特定抗体构建体靶标而差异结合该靶标的其它靶向部分，刺激或诱导定位到该特定靶标上的特定免疫应答途径的靶向活化。

此类缀合物的应用在将对象自身的免疫应答引导至疾病或病症的特定部位的细胞(如与疾病或病症相关的细胞)方面显示出显著的益处。活化或刺激针对靶细胞的免疫应答促进靶细胞的减少、增殖抑制、生长抑制、进展抑制、转移抑制或其它方面的抑制直到并且包括，在一些情况下，靶细胞的清除。因此，在一些情况下，靶向免疫应答活化或刺激导致患者中疾病进展的抑制或显现出的疾病(manifest disease)的至少一种症状的减轻，直到并且在一些情况下，包括对象中一种症状至整个疾病状态的完全消除。

尽管如此，免疫刺激性缀合物的施用并非没有某种风险。如本文所公开的，免疫刺激性缀合物的团注重复静脉内施用可导致引发不需要的或非预期的免疫应答，如过敏反应样应答。此类毒性的特征可以在于某些症状，包括，在各种情况下，体温下降、血压下降、气道限制，快速和弱化的脉搏，以及在一些情况下，死亡中的一种或多种。

当以包括连续多次团注静脉内施用的给药方案施用免疫刺激性缀合物时，增加了此类毒性的风险。以第二剂量向对象静脉内团注施用免疫刺激性缀合物增加了除了引发针对特定疾病或病症或其细胞的靶向免疫应答之外或之前，对象可能经历毒性，如过敏反应样毒性的风险。

因此，本文公开了减少或消除与免疫刺激性缀合物(如但在所有情况下不限于本文公开的免疫刺激性缀合物)的重复团注静脉内施用相关的毒性的治疗方案。此类毒性包括过敏反应样毒性。

一些此类治疗方案可以包括，例如，第一次皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物，如本文公开的那些，以便根据需要引发针对特定靶标，如表现出通过免疫刺激性缀合物的抗体构建体的特异性结合免疫刺激性化合物所靶向的表位的肿瘤细胞或细胞群，的初始靶向免疫应答。

然后，治疗方案可以包括，例如，通过皮下或静脉内缓慢输注施用第二次施用免疫刺激性缀合物以幸免或减轻与免疫刺激性缀合物的静脉内施用相关的毒性，同时免疫刺激性缀合物在疾病或病症或其细胞的特定部位实现其靶向的免疫刺激作用。如本文所公开的，如第二次施用包括免疫刺激性缀合物的皮下或静脉内缓慢输注施用。如以下实施例中所公开的，观察到向已经接受第一剂量的免疫刺激性缀合物的对象皮下或静脉内缓慢输注施用第二剂量的免疫刺激性缀合物减轻、减少或在一些情况下减少或最小化与所述缀合物的团注重复静脉内施用相关的毒性，其特征在于对对象通常有害的过敏反应样应答/毒性。

在本文公开的各种治疗方案中，将第二剂量的皮下或静脉内缓慢输注施用并入包括通过皮下施用预先施用第一剂量的免疫刺激性缀合物的治疗方案中。在这些情况下，术语‘第一’和‘第二’剂量旨在表示相对于彼此的施用时间，但不一定表示总体治疗方案中剂量的时间或相对位置。

第二剂量皮下或静脉内缓慢输注施用在时间上不同于一个或多个“第一次”施用，使得免疫刺激性缀合物的第一剂量或周期间隔例如几天或更长时间，然后在通过皮下或静脉内缓慢输注递送施用第二剂量之前更长持续时间。第二次和随后的皮下或静脉内缓慢输注施用通常是规则系列施用事件(包括第一次皮下或静脉内缓慢输注施用和随后的施用，如以规则或不规则的间隔皮下或静脉内缓慢输注给药)的一部分。

在一些实施方案中，在施用免疫刺激性缀合物之前耗损B细胞。在一些实施方案中，免疫刺激性缀合物与B细胞耗损剂一起施用。B细胞耗损剂可以在免疫刺激性缀合物之前、与免疫刺激性缀合物同时或在免疫刺激性缀合物之后施用。B细胞耗损剂可以例如在第一次施用免疫刺激性缀合物的14天内、7天内、1天内、24小时、12小时、6小时、4小时、3小时、2小时或1小时内施用。B细胞耗损剂包括但不限于抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗BLyS抗体、TACI-Ig、BR3-Fc和抗BR3抗体。非限制性示例性B细胞耗损剂包括利妥昔单抗、奥克珠单抗、奥法木单抗、依帕珠单抗、MEDI-51(抗CD19抗体)、贝利木单抗、BR3-Fc、AMG-623和阿塞西普。

在一些实施方案中，所述免疫刺激性缀合物与减轻过敏反应样毒性的药剂一起施用。减轻过敏反应样毒性的非限制性示例性药剂包括肾上腺素、抗组胺剂、可的松和β-激动剂。施用可以是例如在施用免疫刺激性缀合物的1小时内或数分钟内。

如本文公开的施用方法与使用宽范围的与抗体构建体或其它靶向部分连接的免疫刺激性化合物的免疫刺激性缀合物一致。特别地，本文公开的方法非常适合与免疫刺激性缀合物，如引导对象中对特定病症或疾病位置、细胞类型或细胞的免疫应答的免疫刺激性缀合物，一起使用。因此，实施本文的一些方法包括选择合适的对象，如经受或正在经历免疫刺激性缀合物治疗的对象，所述免疫刺激性缀合物将缀合物的免疫刺激性化合物引导至特定的病症或疾病部位、细胞类型或细胞。通常，由于具有适于通过如本文公开的免疫刺激性缀合物治疗的疾病或病症的至少一种症状，或者预计会发展适于通过如本文公开的免疫刺激性缀合物治疗的疾病或病症的至少一种症状(如缓解和处于复发风险的对象)，选择对象用于实施该方法。选择一些疾病不是基于或不是仅基于疾病类型，而是基于在促进免疫刺激性缀合物定位至合适的表位的肿瘤、细胞类型或特定细胞上检测到或存在所述表位。

进行与本文公开内容一致的免疫刺激性缀合物的皮下施用或缓慢IV输注施用以幸免或减轻或避免与缀合物的重复团注静脉内施用相关的毒性，如过敏反应样应答。许多时间方案与第一剂量施用后的第二剂量施用一致，如在第一剂量之后不超过7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天或24天施用第二剂量。可选地，一些给药方案包括在施用第一剂量之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23或24天皮下施用第二剂量。

类似地，许多剂量用量与本文公开的方法一致。通常，第二剂量和随后剂量的施用水平约为第一剂量的施用水平，或与其相同。第二剂量可以不同地大于、等于或小于第一剂量。例如，选择第二剂量使其为第一剂量的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。可选地，选择第二剂量使其为第一剂量的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多90％或至多95％。类似地，在一些情况下，选择第二剂量使其大于第一剂量，如第一剂量的例如至多125％、至多150％、至多200％、至多300％或至多400％。

通常相对于对象的属性(如对象体重)来确定对象的剂量。示例性剂量用量(如，皮下剂量用量)范围为小于1mg/kg至1、2、3、4、5、6、7、8、9至10，并且还考虑了与上述值范围中列出的那些值中间的值。在多种治疗方案中的示例性剂量包括，例如，第一1mg/kg剂量、在第21天三周后施用的第二1mg/kg剂量和每三周施用的随后1mg/kg剂量；第一2mg/kg剂量、在第21天三周后施用的第二2mg/kg剂量和每三周施用的随后2mg/kg剂量；第一3mg/kg剂量、在第21天三周后施用的第二3mg/kg剂量和每三周施用的随后3mg/kg剂量；第一4mg/kg剂量、在第21天三周后施用的第二4mg/kg剂量和每三周施用的随后4mg/kg剂量；或者第一5mg/kg剂量、在第21天三周后施用的第二5mg/kg剂量和每三周施用的随后5mg/kg剂量；在适于皮下或静脉内缓慢输注施用的PBS缓冲液或其它药物制剂中。在多种治疗方案中的另外示例性剂量包括，例如，第一1mg/kg剂量、在第14天两周后施用的第二1mg/kg剂量和每两周施用的随后1mg/kg剂量；第一2mg/kg剂量、在第14天两周后施用的第二2mg/kg剂量和每两周施用的随后2mg/kg剂量；第一3mg/kg剂量、在第14天两周后施用的第二3mg/kg剂量和每两周施用的随后3mg/kg剂量；第一4mg/kg剂量、在第21天两周后施用的第二4mg/kg剂量和每两周施用的随后4mg/kg剂量；以及第一5mg/kg剂量、在第14天两周后施用的第二5mg/kg剂量和每两周施用的随后5mg/kg剂量；在适于皮下或静脉内缓慢输注施用的PBS缓冲液或其它药物制剂中。在多种治疗方案中的其它示例性剂量包括，例如，第一1mg/kg剂量、在第28天四周后施用的第二1mg/kg剂量和每四周施用的随后1mg/kg剂量；第一2mg/kg剂量、在第28天四周后施用的第二2mg/kg剂量和每四周施用的随后2mg/kg剂量；第一3mg/kg剂量、在第28天四周后施用的第二3mg/kg剂量和每四周施用的随后3mg/kg剂量；第一4mg/kg剂量、在第28天四周后施用的第二4mg/kg剂量和每四周施用的随后4mg/kg剂量；以及第一5mg/kg剂量、在第28天四周后施用的第二5mg/kg剂量和每四周施用的随后5mg/kg剂量；在适于皮下或静脉内缓慢输注施用的PBS缓冲液或其它药物制剂中。本领域技术人员理解，还考虑了在这些范围内或者在这些范围外但与这些范围中的上限或下限值相差例如不超过10％、不超过20％、不超过30％、不超过40％或不超过50％的替代方案。

本文公开的方法通常包括在施用第一剂量、第二剂量或者一个或多个另外的剂量后监测对象。许多监测方法与本文的公开内容一致。监测通常涉及检测过敏反应样应答的至少一种症状或不良事件或者至少一种风险增加的指标。示例性监测包括选自包括监测血细胞计数，体温，皮肤变色，对象警觉性或过敏反应样应答的其它指标的列表中的至少一个监测过程。

如本文公开的施用方案任选地包括在第二剂量(如上文所述的第二皮下或静脉内缓慢输注剂量)之前或之后的“测试剂量”。测试剂量包括以低于适于引发缀合物的靶向免疫刺激作用，但足以指示可能由例如通过静脉内施用第二剂量的施用而引起的过敏反应样应答的选定水平的水平施用免疫刺激性缀合物。测试剂量的施用通常伴随着监测对象的症状，如体温、呼吸、心率或血压的变化，或者本文公开或与过敏反应样反应在其它方面相关的其它适应症。

因此，本文的方法包括以下的一种或多种要素：选择需要针对抗原如肿瘤抗原的免疫刺激性治疗的对象，施用包括皮下或静脉内缓慢输注施用免疫刺激性缀合物的给药方案，监测应答如过敏反应样应答以及观察与病症相关的至少一种症状的减轻。

在多种情况下，所述免疫刺激性缀合物包含苯并氮杂

在一些情况下，所述免疫刺激性缀合物包含TLR7激动剂。在某些实施方案中，所述TLR7激动剂选自咪唑并喹啉、咪唑并喹啉胺、噻唑并喹啉、氨基喹啉、氨基喹唑啉、吡啶并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺、嘧啶-2,4-二胺、2-氨基咪唑、1-烷基-1H-苯并咪唑-2-胺、四氢吡啶并嘧啶、heteroarothiadiazide-2,2-二氧化物、苯并萘啶、噻吩并[3,2-d]嘧啶、4-氨基-咪唑并喹啉、咪唑并-吡啶酮、咪唑并-嘧啶酮、嘌呤、稠合的嘧啶-内酰胺、咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、咪唑并[4,5-c]喹啉、嘧啶、苯并氮杂

本文别处公开的其它免疫刺激性化合物也与本文公开的方法一致。

在一些情况下，免疫刺激性化合物包含如本文别处公开的抗体或抗体结构域。

在一些情况下，与所述病症相关的至少一种症状的减轻包括降低的肿瘤生长。在一些情况下，与所述病症相关的至少一种症状的减轻包括肿瘤停滞。

一般合成方案和实施例

提供以下合成方案是出于说明而非限制的目的。以下实施例说明了制备本文所述化合物的各种方法。应理解，本领域技术人员可以通过类似方法或通过组合本领域技术人员已知的其它方法来制备这些化合物。还应理解，本领域技术人员将能够以如下所述的类似方式通过使用适当的原料并根据需要修改合成途径来制备。通常，原料和试剂可以从商业供应商获得，或者根据本领域技术人员已知的来源合成或者如本文所述制备。

方案1

C-8甲酰胺的合成

在高温下，使醛(i)与适当的Wittig试剂如3-氰基-2-(三苯基亚磷酰基)丙酸叔丁酯反应，得到烯烃(ii)，其通过用还原剂(如于热乙酸中的铁粉)处理烯烃(ii)而经历还原性环化，得到氮杂

方案2

C-8甲酰胺的替代合成

使(i)在用于芳基卤的羰基化的标准条件下，如一氧化碳、钯催化剂(如Pd(OAc)

方案3

C-8胺类似物的合成

在环境温度下，使醛(i)与适当的Wittig试剂如3-氰基-2-(三苯基亚磷酰基)丙酸乙酯反应，得到烯烃(ii)，其通过用还原剂(如于热乙酸中的铁粉)处理烯烃(ii)而经历还原性环化，得到氮杂

方案4

当在适当的溶剂中在适当的碱存在下，用适当的亲电子试剂处理时，具有侧基氨基官能度的4-氨基咪唑并喹啉(i)可以被酰化或烷基化，得到类型(ii)的化合物。保护基团(PG)的最后去保护(如果适用)导致化合物(iii)的产生，所述化合物(iii)含有可以以与该顺序的第一步(i→ii)类似的方式官能化的游离胺。可选地，4-氨基化合物(ii)可以通过用适当的亲电子试剂处理来封端，以提供获得类型(v)的化合物。类型(v)的化合物可以转化为类型(vii)的化合物，就如同类型(ii)的化合物转化为(iv)。在一些情况下，类型(iv)的化合物可以通过在适当的溶剂中在适当的碱存在下用适当的亲电子试剂处理而被直接修饰以获得类型(vii)的化合物。

方案5

连接子-有效载荷的合成

连接子-有效载荷(LP)可通过各种方法合成。例如，LP化合物可如方案5-1所示合成。

方案5-1：

已经被活化用于酰胺键形成的聚乙二醇化羧酸(i)可以与适当取代的含胺的免疫刺激性化合物反应，得到中间体酰胺。活化酯(ii)的形成可通过在偶联剂如二异丙基碳二亚胺(DIC)存在下，使用试剂如N-羟基琥珀酰亚胺或五氟苯酚使含中间体酰胺的羧酸反应以提供化合物(ii)来实现。

LP可如方案5-2所示合成。

方案5-2：

可以使活化的碳酸酯如(i)与适当取代的含胺的免疫刺激性化合物反应，得到氨基甲酸酯(ii)，可以使用标准方法基于R

LP化合物可如方案5-3所示合成。

方案5-3：

可以使活化的羧酸酯如(i-a)与适当取代的含胺的免疫调节刺激性化合物反应以得到酰胺(ii)。可选地，可以在酰胺键形成剂如二环己基碳二亚胺(DCC)存在下，将(i-b)型羧酸与适当取代的含胺的免疫刺激性化合物偶联，以提供所需的LP。

LP化合物可以通过各种方法如方案5-4中所示的方法合成。方案5-4：

可以使活化的碳酸酯如(i)与适当取代的含胺的免疫调节刺激性化合物反应，以得到氨基甲酸酯(ii)作为靶标ISC。

LP化合物也可以如方案5-5所示合成。

方案5-5：

可以使活化的羧酸如(i-a、i-b、i-c)与适当取代的含胺的免疫刺激性化合物反应，以得到酰胺(ii-a、ii-b、ii-c)作为目标连接的有效载荷(LP)。

通过参考以下编号的实施方案发现本公开内容的进一步理解。1.用于减轻与静脉内施用免疫刺激性缀合物相关的不需要的毒性的方法，其包括：向有需要的对象皮下施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，以及(b)免疫刺激性化合物；由此，与静脉内施用所述缀合物相比，减轻静脉内施用所述缀合物的毒性，并且所述毒性选自造血毒性、过敏反应样毒性和细胞因子释放综合征。2.用于减轻与静脉内施用免疫刺激性缀合物相关的不良事件的方法，其包括：向有需要的对象皮下施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，以及(b)免疫刺激性化合物；由此，在所述对象中幸免与静脉内施用所述缀合物相关的造血毒性、过敏反应样毒性或细胞因子释放综合征。3.用免疫活化缀合物增加治疗的耐受性的方法，其包括：向有需要的对象皮下施用有效方案的免疫刺激性缀合物，所述免疫刺激性缀合物包含(a)靶向部分，所述靶向部分特异性结合肿瘤抗原或肿瘤相关抗原，以及(b)免疫刺激性化合物；其中在所述有效方案中施用的总剂量大于通过静脉内施用的所述缀合物的耐受剂量，由此与静脉内施用所述缀合物相比，在所述对象中幸免造血毒性、过敏反应样毒性或细胞因子释放综合征的发展。4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述缀合物由式(I)表示：

实施例

包括以下实施例以进一步描述本公开内容的一些实施方案，并且不应用于限制本公开内容的范围。

实施例1：2-氨基-N

步骤A：Int 1.1a的制备

在25℃，将溴乙腈(8.60g,71.7mmol,4.78mL)加入到叔丁(triphenylphosphorylidine)乙酸酯(45.0g,119mmol,1.00当量)在EtOAc(260mL)中的溶液。将反应物在80℃加热16h，之后TLC(DCM：MeOH＝10：1；R

步骤B：Int 1.1b的制备

将Int 1.1a(11.4g,54.4mmol,1.00当量)和4-甲酰基-3-硝基苯甲酸甲酯(24.8g,59.8mmol,1.10当量)在甲苯(200mL)中的溶液在25℃搅拌18h。TLC(石油醚：EtOAc＝1：2)显示反应完成，并将混合物浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱法(石油醚：EtOAc＝10：1至8：1至4：1)纯化，得到呈黄色固体的Int 1.1b(11.3g)。

步骤C：Int 1.1c的制备

在60℃，将铁粉(6.79g,122mmol)加入到Int 1.1b(23.4g,20.3mmol,1.00当量)在冰醋酸(230mL)中的溶液。将混合物在85℃搅拌3h。TLC(石油醚：EtOAc＝1：2；R

步骤D：Int 1.1d的制备

将Int 1.1c(8.00g,25.3mmol)在HCl/二噁烷(160mL)中的溶液在25℃搅拌16h，之后LCMS显示反应完成。将混合物浓缩，得到12.5g呈浅黄色固体的Int 1.1d，其无需纯化即可直接使用。

步骤E：Int 1.1e的制备

在0℃，将5.0g(13.3mmol)HBTU和7.7mL(44.4mmol)DIPEA加入到在60mL DMF中含有3.3g(11.1mmol)Int 1.1d的溶液。在5分钟之后，加入2.2g(21.7mmol)二正丙胺，并将反应搅拌至室温过夜。将反应用20mL饱和的NH

步骤F：Int 1.1f的制备

将在30mL二氯甲烷中含有1.8g(5.3mmol)Int 1.1e的溶液冷却至0℃并且用2.2mL(7.9mmol)TEA，然后用1.7g(7.9mmol)Boc

步骤G：Int 1.1g的制备

将在10mL THF和水的1：1混合物中含有500mg(1.13mmol)Int 1.1f的溶液冷却至0℃，并且用1.7mL(1.7mmol)1N LiOH处理。在搅拌16h之后，加入冰片，然后加入足够的5％的柠檬酸溶液以产生沉淀(pH～5.5)。将所得混合物用EtOAc洗涤三次，将合并的有机萃取物用盐水洗涤并经Na

步骤H：化合物1.1的制备

将46mg(0.12mmol)HATU加入到在1.0mL DMF中含有43mg(0.10mmol)Int 1.1f的溶液中。将反应混合物搅拌5分钟，然后用30mg(0.12mmol)7-N-Boc-氨基-1,2,3,4-四氢喹啉和0.022mL(0.20mmol)NMM处理。将反应混合物搅拌16h，然后用5mL饱和的NH

实施例2：髓样细胞激动剂苯并氮杂

表1显示了作为髓样细胞激动剂的苯并氮杂

表1：化合物1.1-1.67

实施例3：8-取代的酰苯胺的合成：2-氨基-8-(烟酰氨基)-N,N-二丙基-3H-苯并[b]氮杂

步骤A：化合物1.62的制备

向在5mL DMF中含有46mg(0.10mmol)(8-溴-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

实施例4：8-取代的磺酰胺的合成：2-氨基-N,N-二丙基-8-(N-(吡啶-3-基)氨磺酰基)-3H-苯并[b]氮杂

步骤A：化合物1.63的制备

向在50mL二噁烷中含有460mg(1.0mmol)(8-溴-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

实施例5：连接子-修饰的有效载荷(LP)的合成：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基((5-(2-氨基-4-(二丙基-氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

步骤A：化合物2.1的制备

将54mg(0.07mmol)MC-Val-Cit-PAB-PNP(CAS号159857-81-5)加入到在1.0mL DMF和32μL(0.18mmol)DIPEA中含有40mg(0.07mmol)2-氨基-N

实施例6：具有髓样细胞激动剂的连接子-修饰的有效载荷(LP)的合成：2-氨基-N

步骤A：化合物2.2的制备

将50mg(0.11mmol)N-琥珀酰亚胺基6-[[4-(马来酰亚胺基甲基)环己基]甲酰胺基]己酸酯(CAS号125559-00-4)加入到在2.0mL DCM和15μL(0.11mmol)三乙胺中含有60mg(0.11mmol)2-氨基-N

实施例7：连接子-修饰的有效载荷(LP)的合成

实施例7A：2-氨基-N

将在2mL DCM中含有58mg(0.10mmol)化合物1.35和30mg(0.1mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸酯的溶液用0.07mL(0.4mmol)DIPEA处理，并将反应物在室温下搅拌4h。将反应混合物通过反相色谱法纯化，而无需后处理，提供28mg呈白色固体的化合物-连接子2.3。

可以以类似于以上对于化合物-连接子2.3所描述的方式通过使化合物1.35与适当取代的连接子基团反应来制备以下化合物-连接子2.4至2.7。

化合物-连接子2.4

(S)-2-氨基-N

从琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-smcc)得到白色固体。

化合物-连接子2.5

(S)-2-氨基-N

从(α-马来酰亚胺基丙酰基-ω-琥珀酰亚胺基-4(乙二醇))(mal-PEG4-NHS)得到白色固体。

化合物-连接子2.6

(S)-2-氨基-N

从4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB NHS酯)得到白色固体。

化合物-连接子2.7

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基((S)-1-(((5-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

从mc-VC-PABA-PNP得到白色固体。

化合物-连接子2.8

4-((R)-2-((R)-2-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-(1-(5-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

从化合物1.61和mc-VC-PABA-PNP得到白色固体。

化合物-连接子2.9

4-((R)-2-((R)-2-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(1-(5-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

从化合物1.57和mc-VC-PABA-PNP得到白色固体。

化合物-连接子2.20

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-(((5-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

从化合物1.64和mc-VC-PABA-PNP得到白色固体。

化合物-连接子2.21

2-氨基-N

从化合物1.61和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯提供白色固体。

实施例7B：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-(4-((3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

步骤A：Int 7B-1的制备

向在冰水浴中冷却的3-硝基-5,6,7,8-四氢-1,6-萘啶二氢氯化物(1.0g,3.97mmol)和4-(溴甲基)苯甲酸叔丁酯(1.18g,4.36mmol)在DMF(40mL)中的搅拌溶液中逐滴加入TEA(2.76mL,19.8mmol)。将所得澄清溶液搅拌过夜，同时终止冷却浴。LC-MS显示具有少量剩余的SM的大部分所需产物。将反应混合物真空浓缩，将残余物用水(45mL)和饱和的NaHCO

步骤B：Int 7B-2的制备

在室温下，向4-((3-硝基-7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)甲基)苯甲酸叔丁酯(1.32g,3.57mmol)在27mL DCM中的搅拌溶液中加入含4M HCl(9mL,36.0mmol)的二噁烷。将反应混合物搅拌3h，然后减压浓缩。将残余物真空干燥，得到浅黄色固体，其无需进一步纯化即可直接使用。

步骤C：Int 7B-3的制备

向在冰水浴中冷却的4-((3-硝基-7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)甲基)苯甲酸二氢氯化物(1.28g,3.32mmol)、(9H-芴-9-基)甲基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯盐酸盐(1.060g,3.32mmol)和二异丙基乙胺(4.65ml,26.6mmol)在30mL DCM中的搅拌溶液中逐滴加入2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物(

步骤D：Int 7B-4的制备

将(9H-芴-9-基)甲基(2-(4-((3-硝基-7,8-二氢-1,6-萘啶-6(5H)-基)甲基)苯甲酰胺基)乙基)氨基甲酸酯(2.0g,3.5mmol)和铁(1.930g,34.6mmol)在乙酸(30mL)/水(3mL)中的混合物在50℃搅拌45min。将反应混合物冷却至室温、过滤并浓缩。将残余物用饱和的NaHCO

步骤E：Int 7B-5的制备

在室温下，向2-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

步骤F：Int 7B-6的制备

在室温下，向(8-((6-(4-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙基)氨基甲酰基)苄基)-5,6,7,8-四氢-1,6-萘啶-3-基)氨基甲酰基)-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

步骤G：化合物-连接子2.10的制备

在氮气下，向在冰水浴中冷却的(8-((6-(4-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苄基)-5,6,7,8-四氢-1,6-萘啶-3-基)氨基甲酰基)-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

实施例7C：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(2-(4-((3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

步骤A：化合物-连接子2.11的制备

在室温下，将84.5mg(0.115mmol)来自以上步骤F的(8-((6-(4-((2-氨基乙基)氨基甲酰基)苄基)-5,6,7,8-四氢-1,6-萘啶-3-基)氨基甲酰基)-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

实施例7D：全氟苯基4-((3-((2-(4-((3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

化合物-连接子2.12的制备

在室温下，将2-氨基-N

实施例7E：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-7-甲氧基-3H-苯并[b]氮杂

使用2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

实施例7F：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-7-甲氧基-3H-苯并[b]氮杂

从2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-7-甲氧基-3H-苯并[b]氮杂

实施例7G：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-7-氟-3H-苯并[b]氮杂

从2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-7-氟-3H-苯并[b]氮杂

实施例7H：4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(3-(4-((3-(2-氨基-4-(二丙基氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂

以类似于化合物2.1(实施例5)的方式制备。

表2显示了化合物-连接子2.1-2.21。

表2：化合物-连接子2.1-2.21

实施例8：通过连接子将抗体构建体与髓样细胞激动剂连接

本实施例显示了通过连接子将抗体构建体与髓样细胞激动剂连接以形成缀合物的不同方法。

连接子，如马来酰亚氨基己酰基)-(缬氨酸-瓜氨酸)-(对氨基苄基氧基羰基)连接子或二硫化物连接子(如，如在式Ig至Il中公开的)可首先连接至髓样细胞激动剂以形成髓样细胞激动剂-连接子化合物。随后，髓样细胞激动剂-连接子缀合至抗体构建体。

将连接子连接至抗体构建体，其中连接子是二硫化物连接子(如，在式Ig-Il中)或腙连接子以形成连接子-抗体构建体。随后，髓样细胞激动剂缀合至与抗体构建体连接的连接子。

实施例9：基于赖氨酸的生物缀合

将抗体构建体以约2mg/mL至约10mg/mL的浓度交换至适当的缓冲液，例如磷酸盐、硼酸盐、PBS或Tris-乙酸盐中。在搅拌下将适当数量的当量的髓样细胞激动剂-连接子作为溶液添加。根据髓样细胞激动剂-连接子构建体的物理性质，可以在添加髓样细胞激动剂-连接子构建体之前引入助溶剂以促进溶解。根据所观察到的反应性，将反应物在室温搅拌2小时至约12小时。反应的进展通过LC-MS监测。一旦认为反应完成，则通过适用的方法去除剩余的髓样细胞激动剂-连接子构建体，并将赖氨酸连接的髓样细胞激动剂缀合物交换至所需的配制缓冲液中。

使用以下方案34中所述的条件，以10mg的抗体构建体(mAb)和10当量的髓样细胞激动剂-连接子开始合成赖氨酸-连接的缀合物(ADC＝缀合物；ATAC＝髓样细胞激动剂-连接子)。可以通过以下所述的方法确定单体含量和药物抗体比率。

实施例10：基于半胱氨酸的生物缀合

将抗体用适当数量的当量的还原剂(例如，二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦)以约2mg/mL至约10mg/mL的浓度交换至适当的缓冲液(例如磷酸盐、硼酸盐、PBS或Tris-乙酸盐)中。将所得溶液搅拌适当的时间和温度，以实现所需的还原。在搅拌下将髓样细胞激动剂-连接子构建体作为溶液添加。根据髓样细胞激动剂-连接子构建体的物理性质，在添加髓样细胞激动剂-连接子构建体之前引入助溶剂以促进溶解。根据观察到的反应性，将反应物在室温下搅拌约1小时至约12小时。反应的进展通过液相色谱-质谱(LC-MS)监测。一旦认为反应完成，则通过适用的方法去除剩余的游离免疫刺激性化合物-连接子构建体，并将缀合物交换至所需的配制缓冲液中。使用以下方案35所述的条件，以10mg的抗体构建体(mAb)和7当量的髓样细胞激动剂-连接子开始合成此类基于半胱氨酸的缀合物(ADC＝缀合物；ATAC＝髓样细胞激动剂-连接子)。可以通过本文确定单体含量和药物抗体比。

方案35：

实施例11：摩尔比的测定

本实施例说明了测定摩尔比的一种方法。将1微克的缀合物注入LC/MS，如配备有与Agilent 1290 Infinity UHPLC系统耦合的Agilent双喷射流ESI源的Agilent 6550iFunnel Q-TOF。获得原始数据，并使用软件如有BioConfirm的Agilent MassHunter定性分析软件(Agilent MassHunter Qualitative Analysis Software)利用最大熵反卷积算法进行反卷积。完整缀合物的平均质量由软件计算，其可以使用25％的高峰高度进行计算。然后将这一数据导入另一程序中，如Agilent摩尔比计算器，以计算髓样细胞激动剂:缀合物的摩尔比。

实施例12：用于测定摩尔比的另外方法

用于测定摩尔比的另一种方法如下。首先，将10μL 5mg/mL缀合物溶液注入连接有TOSOH TSKgel丁基-NPR TM疏水性相互作用色谱(HIC)柱(2.5μM粒径，4.6mm x 35mm)的HPLC系统设置中。然后，经18分钟的过程，运行一种方法，其中在12分钟的过程中将流动相梯度从100％流动相A运行为100％流动相B，然后在100％流动相A下进行六分钟重新平衡。流速为0.8mL/min并且将检测器设置在280nM。流动相A是1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠(pH 7)。流动相B是于25mM磷酸钠(pH 7)中的25％异丙醇。运行后，对色谱图进行积分，并通过对加权峰面积求和来确定摩尔比。

实施例13：通过TLR8髓样细胞激动剂缀合物诱导PBMC表达TNFα

本实施例显示了在表达被缀合物识别的抗原的细胞存在下，髓样细胞激动剂缀合物可以增加PBMC产生促炎细胞因子TNFα。

通过标准方法从人中分离PBMC。简而言之，通过Ficoll梯度离心分离PBMC，将其重悬于RPMI中，并铺板于96孔平底微量滴定板(～125,000个/孔)中。然后加入表达抗原(例如HER2)的重组细胞(～25,000个/孔)以及滴定浓度的缀合物或未缀合的亲本抗体作为对照。所述缀合物含有针对所述抗原的抗体；将抗体与TLR8苯并氮杂

实施例14：通过免疫刺激性缀合物诱导鼠巨噬细胞产生鼠TNFα

免疫刺激性缀合物筛选的一般程序。本实施例显示了在表达抗原的肿瘤细胞存在下，免疫刺激性缀合物可以增加来自骨髓衍生的鼠巨噬细胞产生促炎细胞因子鼠TNFα。

鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞。在分化之后，将骨髓衍生的鼠巨噬细胞在cRPMI测定培养基中铺板于96孔平底微量滴定板(80,000个/孔)中。然后加入表达抗原或不表达抗原的肿瘤细胞(40,000个/孔)，以及在cRPMI培养基中滴定浓度范围为100-0.006nM的缀合物或对照抗体。在过夜培养之后，收获上清液，并通过ELISA(BioLegend)测定鼠TNFα水平。使用GraphPad Prism 7.01软件(GraphPad Software)分析数据并使用非线性回归计算EC50值。数据将显示缀合物是有活性的，在抗原表达存在下以剂量依赖性方式刺激鼠巨噬细胞产生鼠TNFα。相比之下，在非表达细胞上抗原不存在下，缀合物不刺激鼠巨噬细胞产生鼠TNFα。

实施例15：HER2-TLR7和HER2-TLR8免疫激动剂缀合物

以下实施例中提及的抗HER2人源化抗体-TLR7缀合物(“HER2-TLR7”)的髓样细胞激动剂-连接子构建体如下所示。缀合是通过如本文所述的基于半胱氨酸的生物缀合。

4-((S)-2-((S)-2-(6-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹琳-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯

以下实施例中提及的抗HER2人源化抗体-TLR8缀合物(“HER2-TLR8”)的髓样细胞激动剂-连接子构建体如下所示。缀合是通过如本文所述的基于半胱氨酸的生物缀合。

实施例16-皮下施用免疫激动剂缀合物避免了在小鼠模型中静脉内施用情况下所观察到的过敏反应样应答。小鼠中的过敏反应样应答需要B细胞。

本实施例显示了通过静脉内(IV)而非皮下(SC)施用给予HER2-TLR7的小鼠在重复给药时经历过敏反应样毒性的症状，如低体温症所证明的。在第0天和第7天，向无肿瘤的Balb/c雌性(Jackson Laboratory)团注IV或SC给予2剂5mg/kg HER2-TLR7。在第二剂量(第7天)后，立即每5-10分钟记录直肠温度，持续1小时。IV而非SC施用药物的小鼠表现出指示过敏反应样应答的稳定的温度下降(图1A)。注意，无论途径如何，在第一剂量之后没有观察到临床症状或体温变化(数据未显示)。

在第0天和第7天，向无肿瘤的雌性T细胞和B细胞缺陷型SCID小鼠(JacksonLaboratory；图1B)和B细胞缺陷型J

表3

实施例17：用B细胞耗损抗体进行的预处理保护小鼠免于过敏性应答

为了评价预防性B细胞耗损对过敏性应答的影响，用250μg B细胞耗损的抗CD20处理无肿瘤的雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory)。48小时后，向它们给予第一IV剂量的5mg/kg HER2-TLR7。7天后，给予第二IV剂量的HER2-TLR7，并且每5-10分钟评估直肠温度。如图2所示，B细胞耗损的小鼠被保护免于过敏性应答。

实施例18：小鼠中的过敏反应样应答不需要肥大细胞

在第0天和第7天，向无肿瘤的雌性肥大细胞缺陷型小鼠(WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)和它们的野生型同窝出生仔畜(litermates)(Jackson Laboratory)IV施用5mg/kgHER2-TLR7。在第二剂量后每5-10分钟评估直肠温度。显著的、持续的温度下降是小鼠中过敏反应的替代指标。

如图3所示，野生型(图3的A)和肥大细胞缺陷型(图3的B)小鼠在IV施用HER2-TLR7后均显示出过敏反应的临床症状。这些结果表明在IV施用HER2-TLR7后在小鼠中观察到的过敏反应应答不需要肥大细胞。

实施例19：过敏性应答需要巨噬细胞/单核细胞以重复IV给药HER2-TLR7

因为过敏性应答不需要肥大细胞，所以我们接下来询问哪些其它效应细胞可能负责过敏性应答。向无肿瘤的雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory)以7天间隔施用两个IV剂量的5mg/kg HER2-TLR7。在第二剂量之前24-48小时，通过IV施用150μL氯膦酸盐脂质体(巨噬细胞/单核细胞)、25μg抗CD200R3克隆Ba103(嗜碱性粒细胞)或500μg抗Ly6G克隆1A8(嗜中性粒细胞)来耗损效应细胞。在第二次剂量后每5-10分钟监测直肠温度。如图4所示，仅巨噬细胞/单核细胞耗损保护小鼠免于过敏性应答。

实施例20-无论施用途径如何，在小鼠血浆中检测到针对HER2-TLR7的ADA(旧图8A-8B)

为了确定抗药物抗体(ADA)水平与过敏性应答的相关性，我们进行了ELISA以比较IV或SC给药后产生的ADA水平。向雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratories)以一周间隔IV或SC施用两剂量的5mg/kg HER2-TLR7或HER2裸抗体。在第二剂量之后7天，抽取血液并使用桥接ELISA分析血浆中的ADA。在本实施例中，HER2裸抗体用于捕获和检测血浆ADA。在给予HER2-TLR7的小鼠中，无论施用途径如何，均以相同的水平产生针对抗体主链的ADA(图5A)。重要的是，当向小鼠施用裸抗体时，未形成ADA，这强调了TLR7激动剂的佐剂的重要性。为了进一步证明这一点，对这些样品进行第二次ELISA以评估针对HER2-TLR7的IgG1抗体水平。在该测定中，HER2-TLR7用于捕获血浆ADA，而抗小鼠IgG1用于检测。在IV和SC施用HER2-TLR7后产生大约相同滴度的ADA，表明观察到的应答不能仅通过ADA水平解释(图5B)。

实施例21：过敏性应答不是由于Cmax，而是与快速的Tmax相关

在SC与IV施用途径之间，药代动力学参数，如达到峰值血浆水平的时间(Tmax)和峰值血浆浓度(Cmax)不同。为了测试这些参数与SC施用所观察到的缺乏过敏性应答的相关性，我们对IV或SC施用5mg/kg HER2-TLR7(图6A)或者SC施用50mg/kg HER2-TLR7(图6B)至携带CT26-Her2肿瘤的Balb/c小鼠(Jackson Laboratory)进行PK分析。在注射后4小时、24小时、72小时和7天抽取血液。通过ELISA测定HER2-TLR7的血浆水平。如表4所示，在IV注射之后4小时和SC注射之后24小时达到HER2-TLR7的峰值血浆水平。在IV给药的动物中5mg/kg的Cmax大约是SC给药的小鼠中的两倍。重要的是，给予50mg/kg SC剂量的小鼠中的Cmax是以5mg/kg IV施用的动物中的Cmax的大约2.2倍(90对比41ug/mL)，所述SC剂量是当重复施用至荷瘤小鼠时不导致过敏反应的水平(数据未显示)。总之，这表明过敏性应答不是由于Cmax，而是与快速的Tmax相关。

表4

实施例22：PAF或组胺的中和降低了小鼠中的过敏反应样应答

在结合抗原-抗体复合物时，效应细胞如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞被触发释放PAF和/或组胺，增加与过敏反应相关的血管通透性和血管舒张的化学介质。为了确定这些介质中的哪一些参与过敏性应答，以7天的间隔向无肿瘤的雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory)施用两个剂量的5mg/kg IV HER2-TLR7。在第二剂量前30分钟给予200μg/小鼠(IP)的PAF抑制剂，CV6209或125μg/小鼠(IP)的抗组胺药，曲普利啶-HCl。每5-10分钟量取直肠温度，持续1小时。另外，使用表5中的以下标准评估临床得分。

表5

如图7所示，在IV施用HER2-TLR7之前中和PAF和组胺减轻了毒性。

实施例23：肾上腺素，而非地塞米松，降低小鼠中的过敏性应答

肾上腺素通常用于治疗过敏性休克。为了确定在小鼠中的过敏性应答是否被肾上腺素减轻，以7天的间隔向无肿瘤的雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory)施用两剂量的5mg/kg IV HER2-TLR7。在第二剂量后5分钟以10μg/只小鼠施用IV肾上腺素。如先前所示评估直肠温度和临床得分。

如图8所示，在IV施用HER2-TLR7之后5分钟施用肾上腺素减轻了毒性，而60μg/只小鼠SC的预防剂量的抗炎剂地塞米松没有效果(图7)。

实施例24：重复剂量过敏反应由小鼠中非自身反应性驱动

向无肿瘤的雌性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory)施用5mg/kg SC剂量的HER2-TLR7，7天后施用5mg/kg IV剂量的HER2-TLR7，5mg/kg IV剂量的裸抗HER2抗体，5mg/kg IV剂量的针对非HER2癌抗原的小鼠裸抗体(小鼠抗体1)，或5mg/kg IV剂量的缀合至小鼠抗体1的TLR7激动剂。作为阴性对照，给予一些小鼠第二SC剂量的5mg/kg HER2-TLR7。第二剂量后每5-10分钟评估直肠温度。显著的、持续的温度下降是小鼠中过敏反应的替代指标。施用IV HER2-TLR7、裸抗HER2抗体或与小鼠抗体1缀合的TLR7激动剂的小鼠表现出过敏反应样应答，而施用SC HER2-TLR7或IV小鼠抗体1的小鼠没有表现出过敏反应样应答。这些结果表明过敏反应是由对HER2-TLR7的人源化组分或对连接子有效载荷本身的非自身反应性驱动的，而不是任一抗体的小鼠组分的非自身反应性驱动的。(数据未显示)。

实施例25：在用HER2-TLR7处理的Her2-CT26荷瘤小鼠中改善的存活

为了避免针对测试物品的抗药物抗体的潜在干扰，我们在具有Balb/c背景的B细胞缺陷品系Jh小鼠(Taconic)中进行了功效实验。在肿瘤形成之后，向小鼠SC施用20mg/kg的抗HER2抗体或20和2mg/kg的HER2-TLR7激动剂，QW，持续4周。Kaplan-Meier存活曲线表明，与单独的HER2抗体相比，皮下施用20mg/kg或2mg/kg HER2-TLR7之后存活改善(图9)。

实施例26：向非人灵长类动物重复剂量静脉内施用含有苯并氮杂

本实施例显示了重复静脉内施用大剂量的HER2-TLR8导致食蟹猴的急性过敏反应样应答。本研究中所用的猴子是目的饲养的，未接受过处理的(treatment-

实施例27：向非人灵长类动物重复剂量皮下施用含有苯并氮杂

本实施例显示了重复皮下施用HER2-TLR8不会在食蟹猴中导致急性过敏反应样应答。本研究中所用的猴子是目的饲养的，未接受过处理的(treatment-

实施例28：向非人灵长类动物重复剂量皮下施用含有苯并氮杂

向非人灵长类动物重复剂量皮下施用2mg/kg、6mg/kg和12mg/kg的HER2-TLR8导致一致的药效动力学应答，表明每个给药周期的活性药物暴露。在不同的时间点通过静脉穿刺收集血样，并使用标准血液分析仪分析血液化学性质，包括C反应蛋白(CRP)。如图10所示，HER2-TLR8导致每个给药周期C反应蛋白(CRP)的一致的、适度的升高。

实施例29：向非人灵长类动物重复剂量皮下施用含有苯并氮杂

研究了在食蟹猴中以2、6或12mg/kg皮下施用或者以7.5mg/kg静脉内施用单剂量的HER2-TLR8的药代动力学特征。在给药前和给药后的一系列时间点通过静脉穿刺收集血液。制备血清并通过ELISA测定测量HER2-TLR8，其中将血清样品加入到用重组HER2包被的测定板中，并使用针对TLR8有效载荷的标记抗体来检测HER2-TLR8。如表6所示，在皮下递送12mg/kg剂量或静脉内递送7.5mg/kg剂量的情况下，在血清中达到类似水平的HER2-TLR8。

表6

实施例30：向非人灵长类动物重复剂量皮下施用含有苯并氮杂

如下评估TLR7抗体缀合物改变小鼠同基因肿瘤中肿瘤细胞生长的能力。6-7周龄的Balb/cJ小鼠的脂肪乳腺垫皮下(SC)接种1x10

用HER2-TLR7激动剂缀合物处理的群组显示出减慢的肿瘤生长(比较图11B与图11A和图11C)以及与HER2和PBS对照相比显著的存活优势(图11D)。

实施例31：响应于HER2-TLR7而清除HER2pos CT26肿瘤的小鼠在再激发时排斥HER2pos CT26肿瘤

设计这些研究以测试在用HER2-TLR7(如以上实施例15中所示的结构)处理的小鼠中抗肿瘤应答的持久性。用5mg/kg和20mg/kg的HER2-TLR7或未缀合的HER2 mAb SC处理接种有HER2阳性CT26结肠癌细胞的小鼠。用HER2-TLR7处理完全清除肿瘤的小鼠在原发肿瘤清除之后大约60天用相同的HER2阳性CT26细胞系再激发。替代物的半衰期是大约48小时，并且在再激发时不再存在。如下获得用于再激发的HER2-TLR7缀合物处理的小鼠。用PBS中的5x10

一些5mg/kg和20mg/kg缀合物处理的动物分别清除其肿瘤的25％和30％，而在未缀合的HER2抗体或PBS组中没有清除。表现出完全清除的那些以及类似激发的初始动物群组用注射到左侧腹的5x10

实施例32：响应于HER2-TLR7而清除HER2+CT26肿瘤的小鼠在再激发时排斥HER2neg CT26肿瘤

为了测试用HER2-TLR7缀合物处理的小鼠中抗肿瘤应答的持久性和表位扩散，用HER2-TLR7处理(HER2-TLR7，如以上实施例15中所示的结构)的完全清除肿瘤的小鼠在原发肿瘤清除之后60天在左侧腹用野生型(HER2阴性)CT26细胞再激发。如下获得用于再激发的小鼠。在雌性BALB/cJ小鼠的右侧腹中皮下接种PBS中的5x10

与初始对照不同，保护所有再激发的小鼠不受野生型CT26肿瘤细胞生长的影响，表明不依赖于HER2的持久的和广泛的新抗原T细胞应答。结果显示在图13中。

实施例33：在HER2pos细胞存在下，HER2-TLR7诱导来自小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的TNF-α

如下体外评估抗HER2-TLR7缀合物通过HER2与肿瘤细胞结合时特异性活化小鼠巨噬细胞的能力。使用附接到填充有生长培养基(补充有10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、1XGlutaMAX-1、1X非必需氨基酸、10mM HEPES和0.5％青霉素/链霉素的DMEM)的3mL注射器的27G针从BALB/cJ小鼠股骨和胫骨收获骨髓细胞。将骨髓细胞离心，在计数之前裂解RBC，并以5x10

在培养之后，收集上清液并在-80℃冷冻直至进行细胞因子分析。通过mTNFαELISA试剂盒(Biolegend)测定上清液中的鼠TNFα(mTNFα)水平，并根据制造说明书在EnvisionPlate Reader(Perkin Elmer,Waltham,MA)上读取。然后使用GraphPad Prism 7.01软件(GraphPad Software,San Diego,CA)绘制mTNFα水平，以及使用非线性回归曲线拟合产生EC

当与HER2pos细胞系结合时，抗HER2-TLR7缀合物有效地活化小鼠骨髓细胞，但当在HER2neg细胞系存在下未结合时，则不能活化小鼠骨髓细胞。TLR7有效载荷化合物能够在两种细胞系存在下有效地活化巨噬细胞。结果显示在图14A(BMDM+SK-BR-3)和14B(BMDM+MDA-MB-468)中。

实施例34：在用HER2-TLR7处理之后，HER2+CT26荷瘤小鼠中的瘤内细胞因子、趋化因子和免疫细胞的浸润/活化升高

为了证明肿瘤靶向的TLR7免疫活化的能力，将携带HER2+肿瘤的小鼠用抗HER2-TLR7缀合物(HER2-TLR7，如以上实施例15中所示的结构)或抗HER2抗体对照处理，切除肿瘤并通过测量免疫细胞、细胞因子和趋化因子来分析该肿瘤的免疫活化。在6-8周龄的BALB/cJ小鼠的右侧腹中皮下接种5x10

表7

与对照相比，发现在单剂量(图15A，IFN；15B，IL-1α；15C，MCP-1；15D，MIP1α)或3剂量(图16A，IFN；16B，IL-6；16C，MCP-1；16D，IP-10；16E，CXCL1；和16F，CXCL2)的抗HER2-TLR7缀合物后48小时，指示的趋化因子和细胞因子的瘤内水平升高，表明免疫活化增加。通过未配对T检验确定统计学显著性(*p<0.05,**p<0.01,p<0.001)。

与对照相比，FACS分析表明瘤内固有和适应性免疫细胞活化在单剂量或三剂量后48小时(第6天)增加。到48小时，通过四聚体染色(图17A)鉴定扩增的AH-1+肿瘤抗原T细胞群。在第6天，巨噬细胞M1与M2的比例(MHC II+类：CD206+)(图17B)和AH-1应答CD8 T细胞的扩增(图17C)增加。在两个时间点观察到升高的肿瘤细胞表面PD-L1表达(图17D-图17E)和嗜中性粒细胞浸润(图17F-图17G)。通过未配对T-检验确定统计学显著性(*p<0.05,**p<0.01,p<0.001)。

总之，这些数据表明用TLR7缀合物处理增加了广泛的瘤内免疫活化。

尽管已经在本文中示出和描述了本公开内容的方面，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些方面仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实践本公开内容中可以采用本文所述的本公开内容的方面的各种替代方案。以下权利要求意图限定本公开内容的范围，并且由此涵盖了这些权利要求及其等效物范围内的方法和结构。