用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液

摘要

本发明属于医用材料的生物负载测定技术领域，尤其是一种用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，解决了现有技术中含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载很难测定，测定过程操作复杂，测定结果数据准确性不高的问题，所述用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；三种酶同时联合作用，能将蛋白大分子酶解成小分子肽，可通过0.45μm滤膜，且不影响产品中生物负载的种类和数量；所述处理液可用于含蛋白生物医用产品，蛋白可以是液态存在，也可以是固态存在，如胶原蛋白、丝素蛋白等。

说明书

技术领域

本发明涉及医用材料的生物负载测定技术领域，尤其涉及一种用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液。

背景技术

生物负载量是建立灭菌剂量的关键值，既决定了辐照成本的高低，又反映了企业生产质量控制水平。如果在产品确定灭菌参数时，收集的生物负载数据不准确，会直接影响产品的灭菌。

常规用于医疗保健产品生物负载的测定方法是采用洗脱液浸提产品上的微生物再进行培养。操作过程是用无菌洗脱液浸没或冲洗产品，通过振摇、拍打、超声、搅切、擦拭等方法进行微生物提取，浸提液用0.45μm滤膜过滤，然后将滤膜有菌面朝上贴到琼脂平板上，琼脂平板经一定条件培养后进行菌落计数；也可以用平板倾注、平板涂抹、螺旋涂板法直接培养浸提液。有些产品也可以不使用洗脱液，直接用接触碟法或琼脂覆盖法进行菌落计数。以上方法可以解决大多数医疗保健产品的生物负载测定。

含可溶性蛋白生物医用材料是指生物医用材料中含有胶原蛋白、丝素蛋白等天然高分子材料，或呈液态，或呈固态；其具有完整三螺旋结果的胶原蛋白的分子量为30万道尔顿、丝素蛋白的分子量最大可达25万道尔顿等，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解。液态或者固态材料在提取过程中，大分子的蛋白分子在过滤过程中会造成堵孔无法获得真实的生物负载数据。目前蛋白溶液常用的生物负载检测方法有44℃加热样品处理液、调节样品处理液的酸碱度并采用特殊材质的过滤膜等，但是效果不佳，且试验操作过程复杂，费时费力，易污染，需要多张过滤膜，数据的准确性不高。基于上述陈述，本发明提出了一种用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载很难测定，测定过程操作复杂，测定结果数据准确性不高的问题，而提出的一种用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液。

用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；三种酶同时联合作用，能将蛋白大分子酶解成小分子肽，可通过0.45μm滤膜，且不影响产品中生物负载的种类和数量；所述处理液可用于含蛋白生物医用产品，蛋白可以是液态存在，也可以是固态存在，如胶原蛋白、丝素蛋白等。

优选的，所述终浓度胶原酶为0.02%～0.20%；胶原酶能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。

优选的，所述终浓度胰蛋白酶0.05%～0.25%；胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。

优选的，所述终浓度木瓜蛋白酶0.05%～0.50%；木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。

优选的，所述处理液的pH值为7.0～7.5。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液的制备方法，包括以下步骤：

分别配制3×终浓度的胶原酶溶液、终浓度的胰蛋白酶溶液和终浓度的木瓜蛋白酶溶液，按照1:1:1混合均匀，调节pH值为7.0～7.5，用0.22μm滤膜过滤除菌和除杂质，制得所述处理液。

优选的，所述调节pH值选用1M NaOH或1M HCl。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液使用方法，包括以下步骤：

以无菌操作，取出含可溶性蛋白生物医用材料样品，剪碎或浸提，用0.1%蛋白胨水冲洗液洗脱2次，充分振荡，将样品和冲洗液倒入无菌瓶，加入处理液，样品与处理液的比例为10:1～20:1，37℃～44℃消化3～10分钟，再将洗脱液用滤膜抽滤；

然后再用0.1%蛋白胨水充分洗脱分解样品3次，每次充分振荡3分钟，将洗脱液用滤膜抽滤,将抽滤后的全部滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基上；

最后，把胰酪大豆胨琼脂培养基倒入无菌瓶中进行培养，在30～35℃温度下，培养3～5天后，计数。

本发明提出的用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，具有以下有益效果：

1、本发明提出了一种用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液由胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶混合制得，配方简单，制备工艺简单；三种酶同时联合作用，能将蛋白大分子酶解成小分子肽，可通过0.45μm滤膜，且不影响产品中生物负载的种类和数量；所述处理液可用于含蛋白生物医用产品，蛋白可以是液态存在，也可以是固态存在，如胶原蛋白、丝素蛋白等。

2、本发明还提出了一种用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液的使用方法，用于测定含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载，准确度达95%以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例一

本发明提出的用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；所述终浓度胶原酶为0.02%、终浓度胰蛋白酶0.25%、终浓度木瓜蛋白酶0.25%。

其制备方法，包括以下步骤：

分别配制3×终浓度的胶原酶溶液、终浓度的胰蛋白酶溶液和终浓度的木瓜蛋白酶溶液，按照1:1:1混合均匀，调节pH值为7.0，用0.22μm滤膜过滤除菌和除杂质，制得所述处理液；

所述调节pH值选用1M HCl。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液使用方法，包括以下步骤：

以无菌操作，取出胶原贴敷料（20g/件），剪碎或浸提，用0.1%蛋白胨水冲洗液20ml洗脱2次，充分振荡，将样品和冲洗液倒入无菌瓶，加入处理液6ml，样品与处理液的比例为10:1，37℃消化5分钟，（记为处理1），再将洗脱液用滤膜抽滤；

然后再用0.1%蛋白胨水充分洗脱分解样品3次（记为处理2-4），每次充分振荡3分钟，将洗脱液用滤膜抽滤，将抽滤后的全部滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基上；

最后，把胰酪大豆胨琼脂培养基倒入无菌瓶中（记为处理5）进行培养，在30℃温度下，培养5天后，计数。

本实施例设5个平行样，回收率计算值为5个平行样的平均值。

实施例二

本发明提出的用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；所述终浓度胶原酶为0.10%、终浓度胰蛋白酶0.15%、终浓度木瓜蛋白酶0.30%。

其制备方法，包括以下步骤：

分别配制3×终浓度的胶原酶溶液、终浓度的胰蛋白酶溶液和终浓度的木瓜蛋白酶溶液，按照1:1:1混合均匀，调节pH值为7.2，用0.22μm滤膜过滤除菌和除杂质，制得所述处理液；

所述调节pH值选用1M HCl。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液使用方法，包括以下步骤：

以无菌操作，取出胶原贴敷料（20g/件），剪碎或浸提，用0.1%蛋白胨水冲洗液20ml洗脱2次，充分振荡，将样品和冲洗液倒入无菌瓶，加入处理液6ml，样品与处理液的比例为12:1，39℃消化8分钟，（记为处理1），再将洗脱液用滤膜抽滤；

然后再用0.1%蛋白胨水充分洗脱分解样品3次（记为处理2-4），每次充分振荡3分钟，将洗脱液用滤膜抽滤，将抽滤后的全部滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基上；

最后，把胰酪大豆胨琼脂培养基倒入无菌瓶中（记为处理5）进行培养，在31℃温度下，培养4天后，计数。

本实施例设5个平行样，回收率计算值为5个平行样的平均值。

实施例三

本发明提出的用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；所述终浓度胶原酶为0.20%、终浓度胰蛋白酶0.05%%、终浓度木瓜蛋白酶0.50%。

其制备方法，包括以下步骤：

分别配制3×终浓度的胶原酶溶液、终浓度的胰蛋白酶溶液和终浓度的木瓜蛋白酶溶液，按照1:1:1混合均匀，调节pH值为7.5，用0.22μm滤膜过滤除菌和除杂质，制得所述处理液；

所述调节pH值选用1M NaOH。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液使用方法，包括以下步骤：

以无菌操作，取出胶原贴敷料（20g/件），剪碎或浸提，用0.1%蛋白胨水冲洗液20ml洗脱2次，充分振荡，将样品和冲洗液倒入无菌瓶，加入处理液6ml，样品与处理液的比例为14:1，40℃消化9分钟，（记为处理1），再将洗脱液用滤膜抽滤；

然后再用0.1%蛋白胨水充分洗脱分解样品3次（记为处理2-4），每次充分振荡3分钟，将洗脱液用滤膜抽滤，将抽滤后的全部滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基上；

最后，把胰酪大豆胨琼脂培养基倒入无菌瓶中（记为处理5）进行培养，在33℃温度下，培养3天后，计数。

本实施例设5个平行样，回收率计算值为5个平行样的平均值。

实施例四

本发明提出的用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；所述终浓度胶原酶为0.02%%、终浓度胰蛋白酶0.05%%、终浓度木瓜蛋白酶0.50%。

其制备方法，包括以下步骤：

分别配制3×终浓度的胶原酶溶液、终浓度的胰蛋白酶溶液和终浓度的木瓜蛋白酶溶液，按照1:1:1混合均匀，调节pH值为7.4，用0.22μm滤膜过滤除菌和除杂质，制得所述处理液；

所述调节pH值选用1M NaOH。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液使用方法，包括以下步骤：

以无菌操作，取出丝素蛋白贴敷料（20g/件），剪碎或浸提，用0.1%蛋白胨水冲洗液20ml洗脱2次，充分振荡，将样品和冲洗液倒入无菌瓶，加入处理液6ml，样品与处理液的比例为18:1，42℃消化5分钟，（记为处理1），再将洗脱液用滤膜抽滤；

然后再用0.1%蛋白胨水充分洗脱分解样品3次（记为处理2-4），每次充分振荡3分钟，将洗脱液用滤膜抽滤，将抽滤后的全部滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基上；

最后，把胰酪大豆胨琼脂培养基倒入无菌瓶中（记为处理5）进行培养，在34℃温度下，培养4天后，计数。

本实施例设5个平行样，回收率计算值为5个平行样的平均值。

实施例五

本发明提出的用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液，所述处理液为胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的混合溶液；所述终浓度胶原酶为0.12%、终浓度胰蛋白酶0.10%、终浓度木瓜蛋白酶0.30%。

其制备方法，包括以下步骤：

分别配制3×终浓度的胶原酶溶液、终浓度的胰蛋白酶溶液和终浓度的木瓜蛋白酶溶液，按照1:1:1混合均匀，调节pH值为7.1，用0.22μm滤膜过滤除菌和除杂质，制得所述处理液；

所述调节pH值选用1M 1M HCl。

本发明还提出了用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液使用方法，包括以下步骤：

以无菌操作，取出丝素蛋白贴敷料（20g/件），剪碎或浸提，用0.1%蛋白胨水冲洗液20ml洗脱2次，充分振荡，将样品和冲洗液倒入无菌瓶，加入处理液6ml，样品与处理液的比例为20:1，44℃消化3分钟，（记为处理1），再将洗脱液用滤膜抽滤；

然后再用0.1%蛋白胨水充分洗脱分解样品3次（记为处理2-4），每次充分振荡3分钟，将洗脱液用滤膜抽滤，将抽滤后的全部滤膜贴在胰酪大豆胨琼脂培养基上；

最后，把胰酪大豆胨琼脂培养基倒入无菌瓶中（记为处理5）进行培养，在35℃温度下，培养3天后，计数。

本实施例设5个平行样，回收率计算值为5个平行样的平均值。

每个实施例均设置对照组：对照组不加处理液，采用同样的方法和步骤处理。

实施例一计算培养结果如下：

当处理过程的生物负载超过总生物负载的65%以上，采用修正系数修正的方法进行生物负载的评估。

根据上述实验数据，回收率计算如下：

本实施例回收率的修正系数计算：

100/78.97=1.27

试验组共5个样品，整个处理过程大概3小时。

对照组在处理1的样液即无法通过滤膜，无法进行后续试验。

实施例二计算培养结果如下：

当处理过程的生物负载超过总生物负载的65%以上，采用修正系数修正的方法进行生物负载的评估。

根据上述实验数据，回收率计算如下：

本实施例回收率的修正系数计算：

100/78.18=1.28

试验组共5个样品，整个处理过程大概3小时。

对照组在处理1的样液即无法通过滤膜，无法进行后续试验。

实施例三计算培养结果如下：

当处理过程的生物负载超过总生物负载的65%以上，采用修正系数修正的方法进行生物负载的评估。

根据上述实验数据，回收率计算如下：

本实施例回收率的修正系数计算：

100/79.54=1.26

试验组共5个样品，整个处理过程大概3小时。

对照组在处理1的样液即无法通过滤膜，无法进行后续试验。

实施例四计算培养结果如下：

当处理过程的生物负载超过总生物负载的65%以上，采用修正系数修正的方法进行生物负载的评估。

根据上述实验数据，回收率计算如下：

本实施例回收率的修正系数计算：

100/79.69=1.25

试验组共5个样品，整个处理过程大概3小时。

对照组在处理1的样液即无法通过滤膜，无法进行后续试验。

实施例五计算培养结果如下：

当处理过程的生物负载超过总生物负载的65%以上，采用修正系数修正的方法进行生物负载的评估。

根据上述实验数据，回收率计算如下：

本实施例回收率的修正系数计算：

100/77.86=1.28

试验组共5个样品，整个处理过程大概3小时。

对照组在处理1的样液即无法通过滤膜，无法进行后续试验。

以上实施例表明，使用此处理液进行天然生物蛋白大分子的生物负载，经过2步均可实现生物负载回收超过65%。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。