一种调控鳞翅目害虫致死的miRNA、类似物、抑制剂及其应用

摘要

本发明属于农业生物技术领域，具体一种可调控鳞翅目害虫致死且延缓鳞翅目害虫生长发育的miRNA及其类似物与抑制剂，并进一步公开其用于制备防治鳞翅目害虫药剂的用途。本发明通过对鳞翅目昆虫miRNA基因家族的序列分析，获得鳞翅目昆虫小菜蛾miRNA即pxy‑miR‑34‑5p，并进一步由上述pxy‑miR‑34‑5p的成熟体序列经标记及化学修饰经体外合成相应的miRNA类似物agomiR‑34和抑制剂antagomiR‑34。利用显微注射法研究发现，所述pxy‑miR‑34‑5p的类似物agomiR‑34和抑制剂antagomiR‑34可通过调控鳞翅目害虫EcR延缓其生长发育或降低它们的存活率，为建立基于miRNA干扰技术控制鳞翅目害虫的新策略提供理论指导。

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体一种可调控鳞翅目害虫致死且延缓鳞翅目害虫生长发育的miRNA及其类似物与抑制剂，并进一步公开其用于制备防治鳞翅目害虫药剂的用途。

背景技术

鳞翅目害虫是蔬菜作物生产上的重要害虫，常常多种虫害混合发生，年发生代数多，且世代重叠严重，每年都会造成巨大的经济损失。目前对于鳞翅目害虫防控的主要手段仍然依赖于杀虫剂的化学防治手段，但由于大量杀虫剂的不合理使用，导致鳞翅目害虫几乎对所有用过的杀虫药剂都产生了抗性，而要达到更好的防治效果只能不断加大农药的使用量，进而就会造成更为严重的环境污染，并形成恶性循环。因此，在农业生产实践中，急需寻找化学农药之外的防治鳞翅目害虫的替代手段。

MicroRNAs(miRNA)为20世纪90年代发现的一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链小RNA分子，由细胞内源产生的发卡结构转录本加工而来。miRNA通过与靶基因mRNA的5'非编码区(5'UTR)、开放阅读框(ORF)或3'非编码区(3'UTR)的特定序列结合，裂解mRNA或翻译阻断来调控表达水平。绝大多数miRNA的转录是由RNA聚合酶Ⅱ介导的，少数由RNA聚合酶Ⅲ介导，形成长度为几百甚至上千个碱基的初级转录本(pri-miRNA)，其中pri-miRNA具有5’端帽子结构和poly(A)尾巴，内部有茎环结构。pri-miRNA于细胞核内在RNase III的作用下，被剪切生成miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA经由Expotin-5转运蛋白的转运，从细胞核被运输至细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA被Dicer酶切割为成熟的miRNA双链。最终，成熟miRNA双链中的一条功能单链(5P或3P)通过与其他相关蛋白质(包括TRBP、Ago等)的结合，形成“RNA诱导沉默复合体”(RISC)，该复合体RISC可识别靶标基因，并与之结合，进而调控基因的表达。功能研究表明，miRNAs会参与调控昆虫多种重要的生物学过程，包括昆虫生长发育、蜕变、翅型分化、繁殖、免疫、杀虫剂抗性等。而序列分析也发现，鳞翅目昆虫miR-34具有高度的保守性，鳞翅目昆虫EcR的3'UTR区具有miR-34保守的种子区结合位点。本发明通过对鳞翅目昆虫miRNA基因家族的序列分析，获得鳞翅目昆虫miRNA，为建立基于miRNA干扰技术控制害虫的新策略提供理论指导。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可调控鳞翅目害虫致死或延缓昆虫生长发育的miRNA，即pxy-miR-34-5p，并进一步合成其类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34，并进一步通过对昆虫注射，揭示了pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34对鳞翅目害虫致死及延缓发育的作用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种调控鳞翅目害虫延缓发育或致死的pxy-miR-34-5p，所述pxy-miR-34-5p具有如下所示的核苷酸序列：

5’-UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU-3’。

本发明还公开了一种所述调控鳞翅目害虫延缓发育或致死的pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34，所述agomiR-34具有如下所示的核苷酸序列：

本发明还公开了一种所述调控鳞翅目害虫延缓发育或致死的pxy-miR-34-5p的抑制剂antagomiR-34，所述antagomiR-34具有如下所示的核苷酸序列：

5’-ACAACCAGCUAACCACACUGCCA-3’。

上述所述类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34是由pxy-miR-34-5p的成熟体序列经标记及化学修饰形成。

本发明还公开了所述pxy-miR-34-5p或所述类似物agomiR-34或所述抑制剂antagomiR-34用于制备鳞翅目害虫防治药剂的用途。

具体的，所述鳞翅目害虫包括夜蛾科或菜蛾科昆虫。

优选的，所述鳞翅目害虫包括甜菜夜蛾、棉铃虫或小菜蛾。

本发明还公开了一种防治鳞翅目害虫的制剂或试剂盒，包括所述pxy-miR-34-5p或所述类似物agomiR-34或所述抑制剂antagomiR-34中的至少一种。

具体的，所述的防治鳞翅目害虫的制剂或试剂盒中：

所述类似物agomiR-34的浓度为1μg/μL-5μg/μL；

所述抑制剂antagomiR-34的浓度为1μg/μL-5μg/μL。

本发明还公开了一种防治鳞翅目害虫的方法，包括将所述pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34或所述抑制剂antagomiR-34注射入鳞翅目害虫体内的步骤。

本发明还公开了所述的防治鳞翅目害虫的制剂或试剂盒在鳞翅目害虫防治领域的应用。

本发明通过对鳞翅目昆虫miRNA基因家族的序列分析，获得鳞翅目昆虫小菜蛾miRNA即pxy-miR-34-5p，并进一步由上述pxy-miR-34-5p的成熟体序列经标记及化学修饰经体外合成相应的miRNA类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34。利用显微注射法研究发现，所述pxy-miR-34-5p及其类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34可通过调控鳞翅目害虫EcR延缓其生长发育或降低它们的存活率。尤其利用显微注射法分别将所述pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34注射鳞翅目害虫甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾，发现该类似物和抑制剂对这三种鳞翅目害虫均有显著致死效果，并能显著抑制鳞翅目害虫的生长发育，延长鳞翅目害虫的发育历期，为建立基于miRNA干扰技术控制鳞翅目害虫的新策略提供理论指导。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为实施例1中注射agomiR-34(A)和antagomiR-34(B)后，甜菜夜蛾EcR的表达量；

图2为实施例2中注射agomiR-34(A)和antagomiR-34(B)后，棉铃虫EcR的表达量；

图3为实施例3中注射agomiR-34(A)和antagomiR-34(B)后，小菜蛾EcR的表达量。

具体实施方式

本发明下述实施例中，通过对鳞翅目昆虫miRNA基因家族的序列分析，获得鳞翅目昆虫miRNA即pxy-miR-34-5p，所述pxy-miR-34-5p具有如下所示的核苷酸序列：

5’-UGGCAGUGUGGUUAGCUGGUUGU-3’。

进一步根据上述pxy-miR-34-5p成熟体序列，由上海吉玛制药技术有限公司经标记及化学修饰经体外合成相应的miRNA类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34，其中，

所述agomiR-34具有如下所示的核苷酸序列：

所述antagomiR-34具有如下所示的核苷酸序列：

5’-ACAACCAGCUAACCACACUGCCA-3’。

实施例1

本实施例中基于上述合成的pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34，于甜菜夜蛾中进行相应的害虫防治效果的验证，同时以通用的无意义的核酸序列agomiR-NC和antagomiR-NC作为对照。

用无核酸酶水分别将上述agomiR-34、agomiR-NC、antagomiR-34和antagomiR-NC溶解稀释至4μg/μL。

选择龄期一致的甜菜夜蛾幼虫，用微量注射仪分别将上述agomiR-34/antagomiR-34注射到昆虫体内，具体标准如下：

(1)选取二龄末期的甜菜夜蛾幼虫，将1.4μg的agomiR-34溶液注射至甜菜夜蛾的腹部(处理组)，对照组甜菜夜蛾注射等量的agomiR-NC，注射后在蘸料杯中用人工饲料单头饲养；

(2)选取三龄初期的甜菜夜蛾幼虫，将1.9μg的antagomiR-34溶液注射至甜菜夜蛾的腹部(处理组)，对照组甜菜夜蛾注射等量的antagomiR-NC，注射后在蘸料杯中用人工饲料单头饲养。

于注射后24h、48h、72h后，收集甜菜夜蛾处理组和对照组样品，分别检测各组甜菜夜蛾中miR-34-5p的靶标基因蜕皮激素受体基因EcR表达水平的变化，测试结果见附图1所示。

注射后，分别观察并统计各实验组中，甜菜夜蛾的幼虫体长体重、蛹重、死亡率、化蛹率、羽化率等生长发育参数，记录结果于下表1。

表1 注射agomiR-34或antagomiR-34后甜菜夜蛾的生长发育情况统计图

由附图1中(A)的数据可知，注射agomiR-34后的24h、48h、72h，甜菜夜蛾中EcR的表达量显著降低；而由表1中结果可知，与对照组相比，注射agomiR-34后，甜菜夜蛾幼虫的体长、体重、蛹重分别显著降低了32.6％、83.2％、21.8％，死亡率显著升高了44.7％，化蛹率显著降低52.8％，发育历期显著延长3.5天。说明所述类似物agomiR-34对甜菜夜蛾害虫具有显著致死效果，并能显著抑制甜菜夜蛾的生长发育，延长甜菜夜蛾的发育历期。

由附图1中(B)的数据可知，注射antagomiR-34后的24h、48h，甜菜夜蛾中EcR的表达量显著升高；而由表1中数据可知，与对照组相比，注射antagomiR-34后，甜菜夜蛾幼虫的体长、体重、蛹重分别显著降低了39.4％、62.1％、38.9％，死亡率显著升高了37.9％，化蛹率、羽化率显著降低了38.2％、34.0％，发育历期显著延长4.7天。说明所述抑制剂antagomiR-34对甜菜夜蛾害虫具有显著致死效果，并能显著抑制甜菜夜蛾的生长发育，延长甜菜夜蛾的发育历期。

实施例2

本实施例中基于上述合成的pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34，于棉铃虫中进行相应的害虫防治效果的验证，同时以通用的无意义的核酸序列agomiR-NC和antagomiR-NC作为对照。

用无核酸酶水分别将上述agomiR-34、agomiR-NC、antagomiR-34和antagomiR-NC溶解稀释至4μg/μL。

选择龄期一致的棉铃虫幼虫，用微量注射仪分别将上述agomiR-34/antagomiR-34注射到昆虫体内，具体标准如下：

(1)选取二龄末期的棉铃虫幼虫，将2.2μg的agomiR-34溶液注射至棉铃虫的腹部(处理组)，对照组棉铃虫注射等量的agomiR-NC，注射后在蘸料杯中用人工饲料单头饲养；

(2)选取二龄末期的棉铃虫幼虫，将2.2μg的antagomiR-34溶液注射至棉铃虫的腹部(处理组)，对照组棉铃虫注射等量的antagomiR-NC，注射后在蘸料杯中用人工饲料单头饲养。

于注射后24h、48h、72h后，收集棉铃虫处理组和对照组样品，分别检测各组棉铃虫中miR-34-5p的靶标基因EcR表达水平的变化，测试结果见附图2所示。

注射后，分别观察并统计各实验组中，棉铃虫的死亡率、幼虫体长体重、化蛹率、羽化率等生长发育参数，记录结果于下表2。

表2 注射agomiR-34或antagomiR-34后棉铃虫的生长发育情况统计图

由附图2中(A)的数据可知，注射agomiR-34后48h、72h，EcR的表达量显著降低；而由表2中结果可知，与对照组相比，注射agomiR-34后，棉铃虫幼虫的体长、体重、蛹重分别显著降低了51.0％、87.8％、15.0％，死亡率显著升高了60.6％，化蛹率、羽化率分别显著降低33.8％、58.8％，发育历期显著延长3天。说明所述类似物agomiR-34对棉铃虫害虫具有显著致死效果，并能显著抑制棉铃虫的生长发育，延长棉铃虫的发育历期。

由附图2中(B)可知，注射antagomiR-34后24h、48h，EcR的表达量显著升高；由表2中数据可知，与对照组相比，注射antagomiR-34后，棉铃虫幼虫的体长、体重、蛹重分别显著降低了33.6％、74.9％、23.1％，死亡率显著升高了31.7％，羽化率显著降低了16.9％，发育历期显著延长3天。说明所述抑制剂antagomiR-34对棉铃虫害虫具有显著致死效果，并能显著抑制棉铃虫的生长发育，延长棉铃虫的发育历期。

实施例3

本实施例中基于上述合成的pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34和抑制剂antagomiR-34，于小菜蛾中进行相应的害虫防治效果的验证，同时以通用的无意义的核酸序列agomiR-NC和antagomiR-NC作为对照。

用无核酸酶水分别将上述agomiR-34、agomiR-NC、antagomiR-34和antagomiR-NC溶解稀释至4μg/μL。

选择龄期一致的小菜蛾幼虫，用微量注射仪分别将上述agomiR-34/antagomiR-34注射到昆虫体内，具体标准如下：

(1)选取三龄中期的小菜蛾幼虫，将207ng的agomiR-34溶液注射至小菜蛾的腹部(处理组)，对照组小菜蛾注射等量的agomiR-NC，注射后在培养皿中用甘蓝叶片饲养；

(2)选取三龄中期的小菜蛾幼虫，将690ng的antagomiR-34溶液注射至小菜蛾的腹部(处理组)，对照组小菜蛾注射等量的antagomiR-NC，注射后在培养皿中用甘蓝叶片饲养。

于注射后24h、48h、72h后，收集小菜蛾处理组和对照组样品，分别检测各组小菜蛾中miR-34-5p的靶标基因EcR表达水平的变化，测试结果见附图3所示。

注射后，分别观察并统计各实验组中，小菜蛾的死亡率、幼虫体长体重、化蛹率、羽化率等生长发育参数，记录结果于下表3。

表3 注射agomiR-34或antagomiR-34后小菜蛾的生长发育情况统计图

由附图3中(A)的数据可知，注射agomiR-34后24h、48h，处理组小菜蛾EcR的表达量显著降低；由表3中结果可知，与对照组相比，注射agomiR-34后，小菜蛾幼虫体长、体重、蛹重分别显著降低了7.3％、16.8％、53.8％，死亡率显著升高了47.1％，化蛹率、羽化率分别显著降低了27.8％、36.6％，发育历期显著延长1天。说明所述类似物agomiR-34对小菜蛾害虫具有显著致死效果，并能显著抑制小菜蛾的生长发育，延长小菜蛾的发育历期。

由附图3中(B)的数据可知，注射antagomiR-34后48h，处理组小菜蛾EcR的表达量显著升高；由表3中结果可知，与对照组相比，注射antagomiR-34后，小菜蛾幼虫的体长、体重、蛹重分别显著降低了26.6％、52.5％、42.0％，死亡率显著升高了72.6％，化蛹率、羽化率分别显著降低27.7％、32.3％，发育历期显著延长1天。说明所述抑制剂antagomiR-34对小菜蛾害虫具有显著致死效果，并能显著抑制小菜蛾的生长发育，延长小菜蛾的发育历期。

综上，本发明上述实施例中，通过注射小菜蛾pxy-miR-34-5p的类似物agomiR-34后，鳞翅目害虫中甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾EcR的表达量显著降低，注射所述抑制剂antagomiR-34后，鳞翅目害虫EcR的表达量显著升高。此外注射agomiR-34和antagomiR-34后，甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾等鳞翅目害虫的体长、体重、蛹重均显著降低，死亡率均显著升高，化蛹率、羽化率也均显著降低，发育历期均显著延长。说明miR-34-5p的异常表达对鳞翅目害虫的致死效应和延缓发育的作用具有高度保守性，而通过注射所述类似物agomiR-34和/或抑制剂antagomiR-34可实现对菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾等鳞翅目害虫的有效防治。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。