二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途

摘要

本申请提供了二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。二氢白皮杉醇具有抗氧化作用，能够抑制心肌细胞的氧化应激损伤，对心肌细胞起到保护作用，从而可以用来预防和/或治疗与氧化应激相关的心血管疾病，进而用于制备预防和/或治疗心血管疾病的药物。进一步地，包含二氢白皮杉醇的药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗心血管疾病的药物。二氢白皮杉醇能够抑制心肌细胞的氧化应激损伤，从而能够用于制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物；进一步地，包含二氢白皮杉醇的药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物。

说明书

技术领域

本申请涉及医药技术领域，特别是涉及二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。

背景技术

随着科技和医学的发展，心血管疾病在诊治方面不断取得可观的研究成果，但每年仍有大量病患因无法得到有效治疗而去世。心肌细胞损伤在心血管疾病的发生发展中起重要作用，开发减轻心肌细胞损伤的药物，从而用于心血管疾病的防治，具有重要的社会意义和经济意义。

发明内容

本申请的发明人通过深入研究，发现二氢白皮杉醇具有抗氧化作用，能够抑制心肌细胞的氧化应激损伤，从而可以用来预防和/或治疗与氧化应激相关的心血管疾病，并基于此完成了本申请。

本申请的第一方面提供二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。

本申请的第二方面提供二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物中的用途。

本申请的第三方面提供一种药物组合物，其包含二氢白皮杉醇。

本申请的第四方面提供本申请第三方面的药物组合物在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。

本申请的第五方面提供本申请第三方面的药物组合物在制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物中的用途。

二氢白皮杉醇能够发挥抗氧化作用，抑制心肌细胞的氧化应激损伤，对心肌细胞起到保护作用，从而能够用于预防和/或治疗心血管疾病，进而用于制备预防和/或治疗心血管疾病的药物。进一步地，包含二氢白皮杉醇的药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗心血管疾病的药物。二氢白皮杉醇具有抗氧化作用，能够抑制心肌细胞的氧化应激损伤，从而能够用于制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物；进一步地，包含二氢白皮杉醇的药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。

图1显示了二氢白皮杉醇对心肌细胞存活率的影响。

图2显示了二氢白皮杉醇对H

图3显示了二氢白皮杉醇对乳酸脱氢酶活性的影响。

图4显示了二氢白皮杉醇对丙二醛含量的影响。

图5显示了二氢白皮杉醇对Nrf2-ARE通路的影响。

图6显示了二氢白皮杉醇对Sirt1、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请的第一方面提供二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。本申请中，二氢白皮杉醇(4-(3,5-dihydroxyphenethyl)benzene-1,2-diol，DHP，CAS号：22318-80-5)的结构式如式I所示。

发明人在研究中发现，本申请的二氢白皮杉醇能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，对心肌细胞起到保护作用，从而能够用于预防和/或治疗心血管疾病，进而用于制备预防和/或治疗心血管疾病的药物。

在本申请第一方面的一些实施方式中，所述心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心肌病和心力衰竭中的至少一种。

本申请的第二方面提供二氢白皮杉醇在制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物中的用途。发明人在研究中发现，本申请的二氢白皮杉醇具有抗氧化作用，能够降低乳酸脱氢酶活性，降低丙二醛的含量；能够激活Nrf2-ARE通路；能够增强Sirt1、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达，调控Nrf2和Sirt1信号通路；从而抑制心肌细胞的氧化应激损伤，进而能够用于制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物。

本申请的第三方面提供一种药物组合物，其包含二氢白皮杉醇。

在本申请中，所述二氢白皮杉醇可以是以单体的形式提供，也可以是以包含其的植物提取物的形式提供；其中，所述植物提取物，可以是选自云杉提取物、葡萄提取物、土大黄提取物、胡椒木提取物、构棘提取物、小叶菝葜提取物或紫檀提取物中的至少一种。在本申请中，对所述提取物的提取方式没有特别限制，只要能实现本申请的目的即可，本领域技术人员可以通过现有的任意方式获取包含二氢白皮杉醇的植物提取物，示例性地，可以用70-80％乙醇溶液进行加热回流提取，得到包含二氢白皮杉醇的植物提取物。

在本申请第三方面的一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

在本申请第三方面的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的至少一种。

本文中，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本申请药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本申请的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本申请的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体或赋形剂混合，然后形成所需的剂型，来制备本申请的药物组合物。根据本申请的药物组合物，其为可以适用于口服给药的药物制剂、适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的药物制剂(例如溶液剂)、适用于表面给药的药物制剂(例如软膏剂、贴剂或乳膏剂)、或适用于直肠给药的药物制剂(例如栓剂)等。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

本申请的第四方面提供本申请第三方面的药物组合物在制备预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。

在本申请第四方面的一些实施方式中，所述心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心肌病和心力衰竭中的至少一种。

本申请的第五方面提供本申请第三方面的药物组合物在制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物中的用途。

本申请中，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文可以是指对已经罹患心血管疾病或心肌细胞损伤的哺乳动物个体(优选为人)采用本申请的药物进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文可以是指对可能罹患心血管疾病或心肌细胞损伤或者对心血管疾病或心肌细胞损伤具有罹患风险的哺乳动物个体采用本申请的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

材料：大鼠H9c2心肌细胞：美国模式培养物集存库(American type culturecollection，ATCC)；双抗(青链霉素混合液)：美国Gibco公司；胎牛血清：美国BI公司；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)：美国BI公司；二甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司；二氢白皮杉醇：Sigma公司；噻唑蓝(MTT)试剂盒：Sigma公司；白藜芦醇：大连美仑生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；磷酸盐缓冲液(PBS)：美国BI公司；丙二醛(MDA)试剂盒：南京建成生物工程研究所；293T细胞：美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)；聚乙烯亚胺(PEI)：德国默克公司；萤火虫荧光素酶报告质粒PGL4.37：北京普洛麦格生物技术有限公司；海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK：北京普洛麦格生物技术有限公司；叔丁基对苯二酚(tertiary butylhydroquinone,tBHQ)：Sigma公司；平衡盐溶液D-Hank's：北京索莱宝科技有限公司；细胞裂解液：北京康为世纪生物科技有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)：北京康为世纪生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)：德国默克公司；脱脂牛奶：北京索莱宝科技有限公司；封闭缓冲液：北京康为世纪生物科技有限公司；沉默信息调节因子1(Sirtuin1，Sirt1)、核因子NF-E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1(NADPH醌氧化还原酶-1，NQO1)抗体：美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物标记的二抗：美国Cell Signaling Technology公司；化学发光试剂(electrochemiluminescence，ECL)：德国默克公司；β-肌动蛋白(β-Actin)抗体：美国SantaCruz生物技术公司。仪器：气套式二氧化碳培养箱：力康生物医疗科技控股有限公司；FlexStation3多功能酶标仪：美国Molecula Device公司；非接触式细胞破碎仪：比利时Diagenode公司；离心机：德国Eppendorf公司；蛋白印迹仪：美国Bio-Rad公司；倒置荧光显微镜：德国LEICA公司。

下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。

细胞培养：H9c2细胞采用完全培养基(含有1％双抗和10％灭活胎牛血清的DMEM培养基)置于5％CO

实施例1二氢白皮杉醇对心肌细胞存活率的影响

将H9c2细胞以每孔8000个细胞密度接种于96孔板中，培养融合至80％时，分组为对照组和各给药组，对照组用含0.01％DMSO的完全培养基培养24h；各给药组分别用含20、50、100、200μmol/L二氢白皮杉醇的完全培养基处理细胞24h；设置空白组，为不含细胞的完全培养基。每孔加入0.5mg/mL噻唑蓝(MTT)，37℃孵育4h后，弃掉上清，加入100μL DMSO，应用多功能酶标仪检测490nm处各孔的吸光度值(OD)，按照以下公式计算细胞存活率，细胞存活率(％)＝(给药组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％，以对照组的细胞存活率为100％。各组细胞存活率结果如图1所示。

将H9c2细胞以每孔8000个细胞密度接种于96孔板中，培养融合至80％时，分组为对照组、模型组和各给药组，对照组用含0.01％DMSO的完全培养基培养26h；各给药组分别用含20、50、100、200μmol/L二氢白皮杉醇的完全培养基预处理细胞24h后，再用含500μmol/L H

根据图1可知，H9c2细胞经20、50、100、200μmol/L二氢白皮杉醇孵育24h，各给药组细胞存活率与对照组无明显差异，表明二氢白皮杉醇对心肌细胞无损伤作用。根据图2可知，经H

实施例2二氢白皮杉醇对乳酸脱氢酶活性和丙二醛含量的影响

乳酸脱氢酶(LDH)活性可作为细胞膜功能损伤的指标，丙二醛(MDA)含量可反映机体脂质过氧化的程度，间接反应出细胞损伤的程度。

将H9c2细胞以2×10

根据图3所示，与对照组相比，模型组乳酸脱氢酶活性明显增加(n＝3,###P<0.001,与对照组比)；与模型组相比，不同浓度的二氢白皮杉醇给药组和阳性对照组的乳酸脱氢酶活性均显著降低(n＝3,***P<0.001,与模型组比)。根据图4所示，与对照组相比，模型组丙二醛含量显著升高(n＝3,###P<0.001,与对照组比)；不同浓度的二氢白皮杉醇给药组和阳性对照组均能够显著降低丙二醛的含量(n＝3,***P<0.001,与模型组比)。结果表明二氢白皮杉醇具有抗氧化作用，能够抑制心肌细胞的氧化应激损伤。

实施例3二氢白皮杉醇对Nrf2-ARE通路的影响

核因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件(Nrf2-ARE)通路是一种内源性抗氧化应激通路，激活Nrf2-ARE通路，能够诱导出一系列的保护性抗氧化蛋白，以缓解细胞所受的损伤。

取对数生长期的293T细胞，以30000个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，使用聚乙烯亚胺(PEI,1g/L)转染试剂同时转染抗氧化反应元件(antioxidant responsiveelement，ARE)萤火虫荧光素酶报告质粒PGL4.37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK，培养24h。培养结束后，对照组加入100μL/孔的基础培养基(DMEM培养基)；阳性对照组是以叔丁基对苯二酚(tBHQ)为阳性对照，tBHQ是一种ARE激活剂，阳性对照组加入100μL/孔含10μmol/L tBHQ的基础培养基；不同浓度的给药组分别加入100μL/孔含10或100μmol/L二氢白皮杉醇的基础培养基；培养6h。弃上清液，D-Hank's漂洗细胞，裂解后，用双荧光素酶(Dual-Luciferase)检测系统检测。每组设6个复孔，重复3次。通过萤火虫荧光素酶活性(Luciferase)与海肾荧光素酶活性(Renilla)对比，得到相对荧光素酶活性值，诱导表达倍数＝(给药组的Luciferase/给药组的Renilla)/(对照组的Luciferase/对照组的Renilla)，诱导表达倍数反映的是对293T细胞中Nrf2-ARE通路激活的效果，各组诱导表达倍数结果如图5所示，以对照组的诱导表达倍数为1。根据图5的结果显示，10μmol/L和100μmol/L二氢白皮杉醇给药组均可显著激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路，诱导表达倍数分别为对照组的6.3±0.51倍和16.6±0.30倍(n＝6,***P<0.001,和对照组比)。结果表明二氢白皮杉醇能够激活Nrf2-ARE通路，发挥抗氧化作用，减轻细胞损伤。

实施例4二氢白皮杉醇对Sirt1、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响

核因子NF-E2相关因子(Nuclear Factor-E2-related factor,Nrf2)是调控细胞氧化应激反应的关键转录因子，是维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者，当细胞暴露于氧化应激时，Nrf2转位到细胞核，与编码抗氧化酶的基因中的抗氧化反应元件(ARE)结合，如NADPH醌氧化还原酶(NQO-1)、血红素加氧酶-1(HO-1)，提高细胞应对氧化应激的能力，产生细胞保护作用。沉默信息调节因子1(Sirt1)为长寿基因，是一种依赖于烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶，能够降低活性氧水平，抑制细胞的氧化应激损伤，促进细胞生存。Sirt1可通过调节转录因子保护细胞免受氧化应激，为预防氧化应激的另一个重要的通路。Nrf2通路和Sirt1是参与H9c2细胞抗氧化调控的重要通路，因此，本申请进一步证实在H

将H9c2细胞以2×10

综上，二氢白皮杉醇具有抗氧化作用，能够降低乳酸脱氢酶活性，降低丙二醛的含量；能够激活Nrf2-ARE通路；能够增强Sirt1、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达，调控Nrf2和Sirt1信号通路；从而抑制心肌细胞的氧化应激损伤，进而用于制备预防和/或治疗心肌细胞损伤的药物。进一步地，二氢白皮杉醇能够抑制心肌细胞死亡，减轻心肌细胞损伤，对心肌细胞起到保护作用，从而能够用于预防和/或治疗心血管疾病，进而用于制备预防和/或治疗心血管疾病的药物。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。