一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器

摘要

本发明公开了一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，包括以下部分：金电极、包裹在金电极上的的磷脂双层、位于磷脂脂双层外表面的互补的两条DNA单链a和a1；配合传感器使用的银纳米颗粒，所述银纳米颗粒表面修饰有DNA单链c；当目标DNA存在时，所述目标DNA和所述DNA单链c与所述DNA单链a的3’端分别杂交形成Y结构；所述目标DNA的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过合理的设计将靶标志物检测与DNA自组装信号放大策略相结合，提高了准确度和灵敏度，实现血清中极低浓度目标肿瘤标志物的检测，有望为肝细胞癌早期症断提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物电化学传感器技术领域领域，具体公开了一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器。

背景技术

电化学技术作为一种传统的分析手段，快速简便、价格低廉，具有其他技术难以比拟的高灵敏度、宽检测范围和低检测限，非常适用于低浓度目标物的检测。最近几年，随着分子组装、界面修饰、分子标记等技术的发展，电化学技术不仅是无机及有机小分子检测的重要方法，而且成为生物大分子分析强有力的工具。近年来，国内外学者报道了许多相关的研究成果，其中最主要的是以抗体或核酸适体作为识别分子设计的传感方法。抗体作为识别分子能够与靶蛋白形成稳定的复合物，通过分子识别达到高度的特异性。目前，抗体制备方法明确，商业化程度高，且适用蛋白范围广泛，这为基于抗体-抗原相互作用的免疫分析方法的设计带来极大的便利。另一方面，核酸适体作为一类利用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，从人工构建的单链核酸分子文库中筛选得到的寡聚核苷酸片段，能够与包括蛋白质在内的多种目标物质高特异性和高亲和力的结合，具有抗体所欠缺的结构简单、易于修饰、稳定性高等优点，近年来被越来越多的用于蛋白质的传感研究。虽然由于核酸适体筛选进展缓慢，目前仅有有限种类的蛋白质分子筛选得到了相应的适体，一定程度上限制了适体在蛋白质检测中的应用，然而，已经筛选得到了一些蛋白质适体已经在蛋白质分析中加以使用，而且，随着适体筛选领域的飞速发展，越来越多蛋白质的适体将被筛选出来。

截至目前，以抗体或核酸适体作为识别分子的电化学方法在肿瘤标志物蛋白检测研究中已经取得了一定的成果，但现有方法在血清学诊断方面的应用仍受到很大限制。例如，电化学工作者常利用电极表面固定的识别分子与靶蛋白结合后产生的阻抗变化对目标蛋白进行检测。这类方法简单、快速、直接，但灵敏度和特异性往往难以满足血清学诊断的需要。在检测中引入信号放大单元能获得更理想的效果。酶催化信号放大是肿瘤标志物电化学检测方法中广泛使用的一种信号放大策略：氧化还原酶，如葡萄糖脱氢酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等，以共价作用与识别分子相连，并通过催化底物氧化还原反应产生电子循环的方式有效改善检测方法的灵敏度。但共价修饰过程导致的氧化还原酶催化活性的下降，以及单个识别分子所能连接的酶分子数量的限制，都极大影响了这种信号放大策略对检测灵敏度的提高效果。近年来，随着工具酶辅助的核酸信号放大策略，如切刻内切酶信号放大、聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、滚环扩增（RCA）等的迅速发展，国内外学者以此为基础发展了许多具有高灵敏度和特异性的肿瘤标志物电化学检测新方法。然而，由于这些方法中使用的工具酶都是蛋白质，在血清等复杂样本中易受酸度、离子浓度等影响并易被其他分子污染而失去活性，导致信号放大效果大大下降，严重阻碍了相应方法在血清学诊断中的实际应用。

如何在保证检测特异性的前提下，进一步提高电化学检测方法在血清等复杂样本中的灵敏性和稳定性，已经成为研究者极为关心的问题。然而，目前使用的信号放大策略所固有的技术问题，制约了现有检测方法的进一步提高。因此，要实现血清样本中肿瘤标志物的电化学灵敏检测，就必须从改进信号放大策略方面入手。

发明内容

针对上述情况，申请人以肝细胞癌核酸标志物为研究目标，以电化学技术为主要手段，综合运用核酸适体识别分子，在保证可检测的目标肿瘤标志物范围的基础上，发展更加高效和可靠的检测方法，公开了一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，本传感器能够实现血清中极低浓度目标肿瘤标志物的检测，最终为肝细胞癌的早期诊断提供有力的依据。

本发明的技术方案如下：

一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，包括以下部分：金电极、包裹在金电极上的的磷脂双层、位于磷脂脂双层外表面的互补的两条DNA单链 a（aDNA）和a1(a1DNA)；配合传感器使用的银纳米颗粒，所述银纳米颗粒表面修饰有DNA单链c(cDNA)；当目标DNA（Target）存在时，所述目标DNA（Target）和所述DNA单链c与所述DNA单链 a的3’端分别杂交形成Y结构；所述目标DNA（Target）的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述磷脂双层相对于金电极的外侧携带有磷酰胆碱基团。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述DNA单链 a1可以与DNA单链 a的 5'端序列互补，从而形成aDNA/a1DNA双链。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述DNA单链 a的3’端携带有一个胆固醇基团；所述DNA单链 a1的5’端携带有一个胆固醇基团。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述aDNA/a1DNA双链通过两个胆固醇基团插入电极表面的磷脂双层中。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述DNA单链 a的序列如SEQ ID NO.2所示；所述DNA单链 a1的序列如SEQ IDNO.3所示；所述DNA单链c的序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述将DNA单链c修饰在银纳米颗粒表面包括以下步骤：将一定浓度的cDNA与银纳米颗粒孵育；随后将溶液高速离心，去除未结合的cDNA，得到cDNA@银纳米颗粒溶液；随后，向得到的cDNA@银纳米颗粒溶液中加入NaCl溶液，混合均匀后室温下放置。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，所述一定浓度的cDNA，其浓度为10 μM。

进一步的，上述一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器的制备和检测方法，包括以下步骤：

S1 金电极的预处理 ；

S2 在金电极表面组装磷脂双层；

S3 将DNA单链 a和a1修饰在所述磷脂双层表面；

S4合成银纳米颗粒并在其表面修饰一条DNA单链c；

S5 放入待检测样品，当目标DNA存在时，与银纳米颗粒表面的DNA单链c和金电极表面的DNA单链 a的 3'端序列分别杂交，形成Y字形结构，从而将银纳米颗粒捕获至金电极表面，产生显著的电化学响应；当目标DNA不存在时，银纳米颗粒无法被捕获至金电极表面，最终产生的电化学响应十分微弱。

进一步的，一种用于肝细胞癌早期诊断的试剂盒，其中包括上述基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器。

从上述技术方案可以得出，本发明具有如下有益效果

本发明肝细胞癌肿瘤标志物为研究目标，以核酸适体为识别分子，通过合理的设计将标志物检测与DNA自组装信号放大策略相结合，发展高度准确和灵敏的电化学传感新方法，实现血清中极低浓度目标肿瘤标志物的检测，最终为肝细胞癌的早期诊断提供有力的依据。同时解决了以下问题a. 如何提高肝细胞癌肿瘤标志物电化学检测方法在血清学诊断中的适用性。b. 如何在肿瘤标志物电化学检测方法中引入DNA自组装信号放大策略。c. 如何高效实现肿瘤标志物电化学检测中的DNA自组装信号放大过程。

附图说明

附图1，用于目标DNA（Target）检测的原理示意图；

附图2，（A）银纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱（B）银纳米颗粒的电化学响应图谱；

附图3，金电极表面脂双层形成以及DNA双链嵌入过程示意图以及交流阻抗(EIS)表征图谱；

附图4，检测500 pM Target时和一系列对照实验中得到的线性伏安图谱（LSV）：（a）检测500 pM Target；（b）检测空白对照（即0 pM Target）；（c）检测500 pM Target，但使用的是对照cDNA（即ct-cDNA，该DNA只包含与Target互补的序列，不含有与aDNA互补的序列）；（d）检测500 pM Target，但使用的是对照aDNA（即ct-aDNA，该DNA只包含与Target互补的序列，不含有与cDNA互补的序列）；

附图5，（A）用于表征Y字形结构形成的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,图（B）用于表征Y字形结构形成的荧光光谱图；

附图6，银纳米颗粒表面修饰cDNA浓度优化实验：（A）采用不同浓度cDNA用于银纳米颗粒修饰时得到的紫外-可见吸收光谱图。（B）紫外-可见吸收光谱图中398 nm处吸光度值（A398）与550 nm处吸光度值（A550）的比值随cDNA浓度的变化；

附图7，检测500 pM Target）时得到的LSV峰电流值随Y字形结构组装时间的变化；

附图8，（A）检测一系列不同浓度Target时得到的LSV图谱，从a至i分别是0、1、10、50、100、200、400、500和1000 pM。（B）LSV峰电流值与不同浓度的Target关系，内嵌图是LSV峰电流值与不同浓度的Target的线性关系；

附图9，（A）检测500 pM Target和对照体系时得到的LSV峰电流值：SM是单碱基突变序列，TM是双碱基突变序列，Random是与Target序列完全不同的随机序列，Blank是空白对照。（B）在不同体系中检测500 pM Target时得到的LSV峰电流值：PBS是磷酸盐缓冲，10%-FBS是10%胎牛血清，50%-FBS是50%胎牛血清，10%-HS是10%人血清，50%-HS是50%人血清。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

关于电化学测量方法：本发明的电化学测量方法包括线性扫描伏安法（LSV）和电化学交流阻抗谱（EIS），在CHI660c电化学工作站上运行。P1/AuE电极作为工作电极，Ag/AgCl电极和铂电极分别作为参比电极和对电极。EIS谱工作条件设置：偏电压0.224 V，振幅5-mV，频率范围0.1 Hz 至 10 kHz。LSV扫描，工作溶液1 M KCl，工作电压-0.01 至0.13 V。

实施例

1.传感器的制备以及原理。

一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器，其检测原理如附图1所示，首先在金电极（AuE）表面组装形成脂双层（Lipid Bilayer，LB） ；这种脂双层的外侧是大量的磷酰胆碱基团，可以在溶液中高效地形成水化层，从而作为一个屏障来抵抗蛋白质等血清中复杂成分的非特异性吸附。随后，我们设计了两条末端修饰有胆固醇（cholesterol）基团的单链DNA分别称为aDNA= SEQ ID NO.2=5’-TCAACATCAGCTCAGGATATATATGTGT-TTTTT-3’-cholesterol）和a1DNA=SEQ ID NO.3=cholesterol-5’-TTTTT-ACACATATAT-3’，a1DNA可以与aDNA 5'端序列互补，从而形成aDNA/a1DNA双链，这种双链可以通过两个胆固醇基团插入电极表面的脂双层中；与此同时，合成银纳米颗粒并在其表面修饰了一条单链DNA ,称为cDNA= SEQ ID NO.4=5’-CCTGAGCTAGTCTGATAAGCTA-TTTTT-3’-SH,将制备得到的cDNA@AgNPs作为本实验中使用的电化学信号探针。当目标DNA（Target）=SEQ ID NO.1=5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’存在时，目标DNA（Target）与银纳米颗粒表面的cDNA和电极表面的aDNA 3'端序列分别杂交，形成Y字形结构，从而将银纳米颗粒捕获至电极表面，产生显著的电化学响应。当目标DNA（Target）不存在时，银纳米颗粒无法被捕获至电极表面，最终产生的电化学响应十分微弱。

2. 银纳米颗粒探针的制备和验证

（1）制备：在CTAB存在下，硼氢化钠还原制备了带正电荷的AgNPs。简而言之，先将2mL含1 mM CTAB的乙醇溶液放入30 mL 5 mM AgNO3的水溶液中，在室温下搅拌15 min。然后将1%的NaBH4鲜配制溶液滴加到上述混合物中，直至颜色稳定为黄绿色。

（2）验证：见附图2，制备得到的银纳米颗粒在396 nm附近存在特征吸收峰，与文献一致；内嵌图是银纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图，如图所示，制备得到的银纳米颗粒的粒径约为10 nm。制备得到的银纳米颗粒在0.07 V附近存在明显的线性伏安（LSV）响应，说明有着良好Ag/AgCl伏安响应，可以作为本实验中使用的电化学信号探针。

3.磷脂双层金电极的制备和验证

（1）电极预处理：首先用1000目和500目的砂纸依次打磨金电极，然后将上述处理好电极在绒布上依次用0.5微米和0.03微米铝粉依次打磨。接下来将电极依次放入酒精和纯净水中进行超声波冲洗，时间为5分钟。将水虎鱼溶液（硫酸：双氧水=1：3）滴在电极表面进行处理，时间为5分钟，然后用纯净水冲洗表面。最后用氮气吹干电极表面进行备用。

（2）脂双层的制备：首先将预处理后的金电极在室温下浸泡于含2mm DPPTE的乙醇溶液中过夜，形成第一层脂质双分子层.然后用乙醇冲洗上述电极，去除非共价结合的DPPTE。将DPPTE修饰电极浸泡在含25mm DPPC的溶液(癸烷:乙醇= 3:1)中5min。其次将电极冷却至20℃形成第二层脂质双分子层，最后将电极浸入0.1 M KCl溶液中浸泡2h.在金电极上形成脂质双分子层膜。

（3）DNA双链的嵌入：将aDNA与a1DNA以及上述处理好的电极放置在缓冲溶液中，在室温下反应10h。由于a1DNA与aDNA5端序列互补，故两者能够形成aDNA/a1DNA双链，同时这种双链可以通过两个胆固醇基团插入电极表面的脂双层中。待时间结束后，用缓冲溶液去除表面未结合的DNA。

（4）验证：见附图3，随着脂双层的形成和DNA双链的嵌入，EIS图谱中半圆部分直径逐渐增大，该现象说明电极表面的阻抗逐渐增加。这与实验设想一致，其原因是由于脂双层和DNA双链在电极表面会形成显著的位阻效应，阻碍电化学活性分子铁氰化钾与电极之间的电子传递。

4.目标DNA（Target）的检测

见附图4，如图所示，本方法用于检测500 pM Target时可以得到显著的LSV响应，而在三种对照实验中均只能得到十分低的LSV响应，说明本方法可以用于Target的检测，且检测信号依赖于Y字形结构的形成。

关于附图4中的序列的进一步说明：（a）检测500 pM Target；（b）检测空白对照（即0 pM Target）；（c）检测500 pM Target，但使用的是对照cDNA（即ct-cDNA=SEQ ID NO.5=5’-CCTACTGTATCTGACTACAACT-3’，该DNA只包含与Target互补的序列，不含有与aDNA互补的序列）；（d）检测500 pM Target，但使用的是对照aDNA （即ct-aDNA=SEQ ID NO .6=5’-ATCGAATAGTCTGATGACATAT-3’，该DNA只包含与Target互补的序列，不含有与cDNA互补的序列）。

5.Y结构的验证

见附图5，为了证明只有当Target存在时才能形成稳定的Y字形结构，我们通过如图5（A）所示的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）图来用于表征Y字形结构形成，其中，条带M是DNAMarker，条带1是1 μM Target、1 μM的aDNA和1 μM的cDNA在4℃条件下反应1小时后的体系，条带2是1 μM的aDNA和1 μM的cDNA在4℃条件下反应1小时后的体系。通过图5（A）证明了设计结构的正确性，证明了设计结构可行性以及合理性。另外我们通过图5（B）所示的荧光光谱图表征了Y字形结构的形成，在本部分实验中，cDNA 3'末端修饰有荧光基团FAM，aDNA 5'末端修饰有淬灭基团Eclipse。如图5（B）所示，当Target不存在时，cDNA和aDNA分别游离于溶液中，荧光基团和淬灭基团彼此远离，体系具有较强的荧光发射（曲线a）；当Target存在时，Y字形结构有效形成，此时，cDNA的3'末端和aDNA的5'末端相互邻近，导致荧光基团和淬灭基团在空间上彼此接近，荧光基团的荧光发射被显著猝灭（曲线b）。

6检测条件的优化

见附图6，在实验中，使用不同浓度的cDNA（DNA 单链 c）与银纳米颗粒孵育；随后，将溶液以10000 rpm转速离心，去除未结合的cDNA；随后，向得到的cDNA@银纳米颗粒溶液中加入0.5 mol/L NaCl溶液，混合均匀后室温下放置10分钟，测定溶液的紫外-可见吸收光谱。裸露的银纳米颗粒之间具有较强的静电排斥作用，其在溶液中保持良好的分散性。当向银纳米颗粒溶液中加入一定浓度的NaCl溶液时，由于Na+离子能够中和纳米颗粒表面的负电荷，降低颗粒之间的静电排斥，银纳米颗粒会因而发生聚集。但是，如果银纳米颗粒表面修饰有DNA，银纳米颗粒可以在较高的阳离子浓度下保持分散状态。如图所示，随着使用的cDNA浓度的升高，银纳米颗粒表面修饰的cDNA数量逐渐增加，导致银纳米颗粒在高浓度Na+离子存在条件下的分散性逐渐改善；当cDNA浓度达到10 μM时，银纳米颗粒在高浓度Na+离子存在条件下基本不发生聚集，因此10 μM可以作为银纳米颗粒修饰的最适cDNA浓度。

见附图7，另外随着组装时间的增加，LSV峰电流值逐渐增大，当组装时间达到60min后，LSV峰电流值基本保持稳定；因此，60 min可以作为Y字形结构组装的最优时间。

7 检测灵敏度验证

为了评价所设计方法的灵敏度，在最佳条件下加入不同浓度的Target。见附图8（A），随着Target浓度的增加，电化学响应增加。该结果符合实验设计预期。其主要原因是由于Target的浓度不断增加促进了Y字形结构的形成，实现了电化学信号的增加。图8（B）显示了LSV峰电流值与Target浓度在1~1000 pM范围内的关系，内嵌图是LSV峰电流值与Target浓度在1~500 pM范围内的线性关系，线性方程是y= 0.01x + 0.306，R

见附图9（A），为不同对照体系中的电化学反应。只有当Target存在时才会出现峰值电流，而在不同的对照体系中，无论是单碱基序列还是双碱基序列或者随机序列中都只能观察到相当低的峰值电流。通过Target以及不同对照体系的电化学反应差异显示了我们的方法的高特异性，这归因于Y字形结构的高选择性。如图9（B）显示了相同浓度的Target在PBS缓冲液(缓冲液)或各种浓度的胎牛血清(血清)中的电化学反应。由图中结果可知Target不论是在缓冲液中的峰值电流还是在不同浓度的胎牛血清中的峰值电流，其结果都基本持平，再次证实了我们的方法具有理想以及令人满意的血清样本适用性。结果表明，该方法具有较高的特异性和样本适用性。

关于图9中序列的进一步说明：（A）检测500 pM Target和对照体系时得到的LSV峰电流值：其中SM=SEQ ID NO.7=5’-ATCGAATAGTCTGACAACAACT-3’是单碱基突变序列，TM=SEQ ID NO.8 =ATCGAATAGTCTGACTACAACT是双碱基突变序列，Random= SEQ ID NO.9=5’-AATCGTAACATTGGCATGCAGA-3’是与Target序列完全不同的随机序列，Blank是空白对照。

由上述实施例1-7可知，本发明通过合理的设计将靶标志物检测与DNA自组装信号放大策略相结合，提高了准确度和灵敏度，实现血清中极低浓度目标肿瘤标志物的检测，有望为肝细胞癌早期症断提供依据。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州健雄职业技术学院

<120> 一种基于纳米银和锚定磷脂双层膜的肝细胞癌核酸标记的电化学生物传感器

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